NOVÁ VERZE Systém pro kvantitativní multiplex amplifikaci DNA PLEXAMP KIT PXT3 Detekce genomové přestavby genů MSH2 a MSH6 NÁVOD K POUŽITÍ REFERENCE: PXT3-02.01.25: 25 testů PXT3-02.01.50: 50 testů PXT3-02.01.100: 100 testů SKLADOVÁNÍ: - 20 C POUZE PRO VÝZKUMNÉ ÚČELY NEPOUŽÍVEJTE PRO DIAGNOSTICKÉ PROCEDURY N_PXT3 V3
OBSAH 1) Multiplex PCR... 3 2) Princip... 3 a) PLEXAMP : Kvantitativní multiplex amplifikace fragmentů genomu pomocí PCR... 3 b) Amplikony... 4 3) Komponenty PLEXAMP Kit... 4 4) Umístění PCR cílových sekvencí... 4 5) Vlastnosti PCR cílových sekvencí... 5 6) Varování a doporučení... 7 7) Skladování... 7 8) Nedodávané vybavení, mikrozkumavky a reagencia, potřebné pro testování... 7 a) Základní vybavení... 7 b) Mikrozkumavky... 7 c) Reagencia... 8 9) Příprava genomové DNA... 8 a) Kvalita genomové DNA... 8 b) Kvantita genomové DNA... 8 10) Procedura PLEXAMP... 9 a) PLEXAMP amplifikační reakce... 9 i) Vyberte genomovou referenční DNA... 9 ii) Připravte reakční směs... 9 iii) Spusťte PCR... 9 b) Elektroforéza... 9 i) Parametry elektroforézy... 9 ii) Kapilární elektroforéza: ABI 310, 31xx, 37xx skupinový instrument... 9 c) PLEXAMP Analýza... 10 i) Quantipeak... 10 ii) GeneMapper... 10 iii) Nejčastější problémy... 11 2 N_PXT3 V3
1) Multiplex PCR Simultánní amplifikace několika amplikonů v jedné PCR byla poprvé použita pro detekci delecí a duplikací genu pro dystrophin (Abbs and Bobrow, 1992) 1. Simultánní amplifikace dvou nebo více úseků dovoluje přímé srovnání relativního množství PCR produktů získaných z dvou genomových DNA za předpokladu, že 1/ u každého amplikonu je amplifikace ve své exponenciální fázi a 2/ amplifikační produkty mohou být zobrazeny. K zlepšení sensitivity detekce amplifikačních produktů bylo použito fluorescenční značení (Mansfield et al, 1993) 2. Nová multiplex PCR metoda, nazvaná fluorescenční multiplex PCR krátkých genomových sekvencí, byla vynalezena Charbonnierem a kol. v roce 2000 ve snaze učinit nová vylepšení 3. Tato metoda je založena na simultánní amplifikaci krátkých úseků DNA pro lepší homogenizaci amplifikace různých amplikonů. Amplifikační produkty jsou analyzovány kapilární elektroforézou, která umožňuje překrytí PCR profilů a srovnání fluorescence získané pro každý amplikon ze dvou vzorků DNA. Tato metoda umožňuje detekci genomových heterozygotních alterací, ale množství simultánně amplifikovaných amplikonů je limitováno. Nyní PrestaGen představuje originální multiplex PCR metodu nazvanou PLEXAMP (MultiPLEX AMPlification PCR System). Tato vlastní metoda je založena na speciálním a optimalizovaném návrhu PCR primerů, reakčním pufru a podmínkách PCR umožňujících vysoký počet simultánních amplifikací a kvantitativní analýzu každého amplikonu. Oproti jiným podobným metodám, PLEXAMP je jednokroková metoda, která může být použita jako jednorázový test nebo high-throughput metoda. 2) Princip a) PLEXAMP : Kvantitativní multiplex amplifikace fragmentů genomu pomocí PCR Tato technologie je založena na: 1. Multiplex amplifikaci jednotlivých genomových sekvencí (amplikonů) především z exonových oblastí cílových sekvencí. 2. Kontrole kinetiky procesu PCR amplifikace umožňující kvantitativní analýzu. 3. Použití fluorescenčních primerů umožňujících analýzu fragmentů pomocí většiny genetických analytických systémů. 4. Jednokrokové proceduře. 5. Kvantitativní analýze srovnáním profilu pacientovy genomové DNA s profilem referenční genomové DNA po normalizaci pomocí kontrolních amplikonů. 1 Abbs, S. and Bobrow, M. Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophin gene. J Med Genet. 1992; 29(3):191-6. 2 Mansfield, E. S.; Robertson, J. M.; Lebo, R. V.; Lucero, M. Y.; Mayrand, P. E.; Rappaport, E.; Parrella, T.; Sartore, M.; Surrey, S., and Fortina, P. Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategies. Am J Med Genet. 1993; 48(4):200-8. 3 Charbonnier F, Raux G, Wang Q, Drouot N, Cordier F, Limacher JM, et al. Detection of exon deletions and duplications of the mismatch repair genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer families using multiplex polymerase chain reaction of short fluorescent fragments. Cancer Res 2000; 60: 2760-3. 3 N_PXT3 V3
b) Amplikony Každý jednotlivý genomový segment může být použit jako amplikon pro technologii PLEXAMP. Výběr amplikonů se řidí podle následujících pravidel: 1. Cílové úseky amplikonů by měly být genomově jedinečné. 2. Primerové sekvence by neměly obsahovat známé SNP (Single Nucleotide Polymorphism). 3. Amplikony jsou přednostně vybírány z exonových oblastí. Každý kit obsahuje nejméně dva kontrolní amplikony lokalizované v genomových oblastech, které neobsahují žádné repetitivní sekvence. Tyto amplikony slouží jako kontrola a ke kalibraci, což umožní normalizaci pacientovy a referenční DNA. 3) Komponenty PLEXAMP Soupravy Každá PLEXAMP Souprava obsahuje dostatek reagencií pro provedení 25, 50 nebo 100 testů. Zkumavka Reagens Objem Množství A Červený uzávěr B Žlutý uzávěr C Modrý uzávěr 4X PLEXAMP PCR MASTERMIX obsahující PCR reakční pufr a Taq-polymerasu (ref# PXT-01.01.25-A) 4X PLEXAMP PCR PRIMERMIX* (ref# PXT3-01.01.25-B) PCR grade H 2O (ref# PXT-01.01.50-C) 135 µl 1 (25 testů) 2 (50 testů) 4 (100 testů) 135 µl 1 (25 testů) 2 (50 testů) 4 (100 testů) 500 µl 1 (25 or 50 testů) 2 (100 testů) * PCR primery jsou značené fluorescenčním barvivem 6-FAM TM. 4) Umístění PCR cílových sekvencí 4 N_PXT3 V3
MHS2 gen Od exonu 1 do 16 jsou k amplikaci každého exonu použity specifické primery. Dvě další cílové sekvence se nacházejí v oblasti promotoru genu MHS2, aby byla možná i detekce alterace promotoru: o Jedna cílová sekvence v proximální oblasti promotoru PROM -125 bp (od ATG), o Jedna cílová sekvence v distální oblasti promotoru PROM -13 kb (od ATG). Specifické primery jsou použity k amplifikaci exonu 9 genu EPCAM (TACSTD1), který je umístěný 16 kb v protisměru od ATG genu MSH2. MSH6 gen Od exonu 2 do 10 jsou k amplifikaci každého exonu použity specifické primery. CTRL geny : CTRL A,B,C a D jsou umístěny v různých genomových oblastech, ve kterých dosud nebyly detekovány žádné repetitivní sekvence. 5) Vlastnosti PCR cílových sekvencí PCR TARGET Profile order Genomic Order Size (bp) PCR TARGET Genomic Order Profile order CTRL_A 1 1 92 CTRL_A 1 1 92 CTRL_B 2 2 100 CTRL_B 2 2 100 MSH6_EXON_7 3 28 103 EPCAM (TACSTD1) EXON_9 3 20 243 MSH2_EXON_2 4 7 107 MSH2_PROM -13000 bp 4 27 309 MSH2_EXON_3 5 8 115 MSH2_PROM -125 bp 5 28 316 MSH2_EXON_7 6 12 124 MSH2_EXON_1 6 8 142 MSH2_EXON_4 7 9 133 MSH2_EXON_2 7 4 107 MSH2_EXON_1 8 6 142 MSH2_EXON_3 8 5 115 MSH6_EXON_8 9 29 152 MSH2_EXON_4 9 7 133 MSH6_EXON_9 10 30 158 MSH2_EXON_5 10 25 294 MSH2_EXON_14 11 19 166 MSH2_EXON_6 11 14 190 MSH2_EXON_9 12 14 174 MSH2_EXON_7 12 6 124 MSH2_EXON_12 13 17 183 MSH2_EXON_8 13 15 198 MSH2_EXON_6 14 11 190 MSH2_EXON_9 14 12 174 MSH2_EXON_8 15 13 198 MSH2_EXON_10 15 18 223 Size (bp) PCR TARGET Profile Genomic Size PCR TARGET Genomic Profile Size 5 N_PXT3 V3
order Order (bp) Order order (bp) MSH2_EXON_11 16 16 207 MSH2_EXON_11 16 16 207 MSH6_EXON_6 17 27 215 MSH2_EXON_12 17 13 183 MSH2_EXON_10 18 15 223 MSH2_EXON_13 18 26 301 MSH2_EXON_15 19 20 233 MSH2_EXON_14 19 11 166 EPCAM (TACSTD1) EXON_9 20 3 243 MSH2_EXON_15 20 19 233 MSH6_EXON_4 P1 21 24 250 MSH2_EXON_16 21 24 280 MSH6_EXON_10 22 31 257 MSH6_EXON_2 22 23 273 MSH6_EXON_2 23 22 273 MSH6_EXON_3 23 30 336 MSH2_EXON_16 24 21 280 MSH6_EXON_4 P1 24 21 250 MSH2_EXON_5 25 10 294 MSH6_EXON_4 P2 25 31 343 MSH2_EXON_13 26 18 301 MSH6_EXON_5 26 29 324 MSH2_PROM -13000 bp 27 4 309 MSH6_EXON_6 27 17 215 MSH2_PROM -125 bp 28 5 316 MSH6_EXON_7 28 3 103 MSH6_EXON_5 29 26 324 MSH6_EXON_8 29 9 152 MSH6_EXON_3 30 23 336 MSH6_EXON_9 30 10 158 MSH6_EXON_4 P2 31 25 343 MSH6_EXON_10 31 22 257 CTRL_C 32 32 386 CTRL_C 32 32 386 CTRL_D 33 33 395 CTRL_D 33 33 395 6 N_PXT3 V3
PLEXAMP MSH2/MSH6 PCR profil referenční DNA Každý peak odpovídá jednomu amplikonu. Peaky se objevují podle zvyšující se velikosti od 92 bp (první vlevo) do 395 bp (poslední vpravo): viz tabulka nahoře. 6) Varování a doporučení Tento kit je určen pouze pro výzkumné účely a nikoli pro diagnostické nebo terapeutické účely. Nepoužívejte kit po uplynutí data expirace. Nemíchejte dohromady reagencie z různých šarží nebo různých typů kitů. Používejte stejnou šarži u pacientovy i referenční DNA. Se vzorky a reagenciemi byste měli zacházet v rukavicích. Používejte pouze špičky s filtry. Rozmrazujte pouze nezbytná reagencie. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování a zmrazování. Vždy dodržujte podmínky k skladování a níže uvedenou testovací proceduru. 7) Skladování Kit by měl být skladován při 20 C. 8) Nedodávané vybavení, mikrozkumavky a reagencia, potřebné pro testování a) Základní vybavení PCR thermocycler s 0.2 ml destičkou (rychlost vyhřívání 2 C/sec) Vyhřívané víko by mělo vyvíjet dostatečný tlak na vršek PCR zkumavek, aby umožnil dokonalý kontakt mezi zkumavkami a topným tělesem. Systém kapilární elektroforézy 7 N_PXT3 V3
Tento systém byl validován na ABI3130 36 cm délka kapiláry, POP7 polymer se softwarem Genemapper4.0 Čisté a spolehlivě přesné mikropipety b) Mikrozkumavky 0.2 ml PCR zkumavky prosté nukleových kyselin a nukleáz c) Reagencia Deionizovaný formamid (doporučen ABI 4311320) Fluorescenční standard velikosti DNA kompatibilní s PCR produkty značenými 6-FAM. Doporučujeme použití : Size standard dye Filter set ABI product ABI product Nr ROX D GeneScan 400 HD ROX * 402985 9) Příprava genomové DNA Kvalita genomové DNA je nezbytná pro získávání homogenní amplifikační kinetiky u všech amplikonů. Pro získání spolehlivých kvantitativních výsledků by měla být pro extrakci pacientovy DNA a referenční DNA použita stejná metoda. a) Kvalita genomové DNA DNA extrakce metodou VYSOLOVÁNÍ interferuje s podmínkami PCR a proto byste se jí měli VYHNOUT. Genomová DNA extrahovaná s použitím magnetických kuliček by se měla používat s opatrností: přítomnost magnetických kuliček v eluované genomové DNA může interferovat s chemií multiplex PCR. Nejlepší výsledky jsou získány použitím genomové DNA extrahované pomocí kitů založených na DNA resin afinitě nebo DNA filtrech (Protokol optimální extrakce DNA je k dispozici na vyžádání, kontaktujte prosím techserv@prestagen.com). OD 260/280 se optimálně pohybuje od 1,8 do 2,0. b) Kvantita genomové DNA Koncentrace genomové DNA musí být stanovena přesně: optimálně se pohybuje mezi 20 a 50 ng/µl. Doporučuje se použití kalibrovaného UV spektrofotometru. 8 N_PXT3 V3
10) Procedura PLEXAMP a) PLEXAMP amplifikační reakce i) Vyberte genomovou referenční DNA Genomová referenční DNA by měla být extrahována stejným postupem jako genomová DNA pacienta. Referenční genomová DNA by měla být prostá jakýchkoli známých alterací úseků cílových sekvencí. ii) Připravte reakční směs Rozmrazte nezbytné reagencie. Krátce odstřeďte každou zkumavku, aby se celý obsah usadil na dně. Před použitím dobře promíchejte každou reagencii na vortexu (5 vteřin při nejvyšší rychlosti). Připravte nezbytné množství PCR zkumavek pro testované i pro referenční DNA. Do každé 0,2ml PCR zkumavky přidejte: - 4X PLEXAMP PCR MASTERMIX (Zkumavka A Červený uzávěr): 5 µl - 4X PLEXAMP PRIMERMIX (Zkumavka B Žlutý uzávěr): 5 µl - pacientova DNA nebo referenční DNA: 25 ng - H2O pro PCR (Zkumavka C Modrý uzávěr): až 20 µl Krátce odstřeďte a promíchejte na vortexu PCR zkumavky. iii) Spusťte PCR Nastavte thermocycler na stupeň změny teploty 2 C/sec mezi každým krokem: Krok Čas Teplota Počáteční denaturace 10 min 96 C Denaturace 20 sec 96 C 26 CYKLŮ Nasednutí primeru 60 sec 61 C* b) Elektroforéza Extenze 120 sec 72 C Konečná extenze 5 min 72 C Inkubace 4 C * Teplota pro nasednutí primeru se může u každého kitu lišit Podmínky PCR jsou kritické a měly by být přesně dodržovány. i) Parametry elektroforézy Nastavení elektroforetických parametrů viz doporučení dodavatele. ii) Kapilární elektroforéza: ABI 310, 31xx, 37xx skupinový instrument Připravte plnicí roztok do injekčního platu. Do každé jamky: - PLEXAMP PCR produkt značený fluoresc. barvivem 6-FAMTM 2.0 µl - Fluorescenční standard velikosti DNA 0.3 µl - Deionizovaný formamid 15.0 µl 9 N_PXT3 V3
Inkubujte 3 min při 95 C a 1 min při 4 C. CELKEM (na jamku): 17.3 µl Nastavte Applied následně: parametry Biosystems Systém byl vytvořen na ABI3130 (Délka kapiláry 36 cm; Typ polymeru POP7). c) PLEXAMP Analýza i) Quantipeak Nástroj pro online software analýzu je k dispozici na http://www.prestagen.com/ (Tab «QuantiPeak»). Tento nástroj umožňuje rychlou a jednoduchou analýzu dat ze souborů vytvořených sekvencerem (.fsa). Specializovaný návod k použití je k dispozici na webových stránkách. ii) GeneMapper Analýza dat může být provedena pomocí softwaru GeneMapper v4.0 podle uživatelské poznámky Applied Biosystems: Detekce významných delecí nebo duplikací genomové DNA pomocí kvantitativní multiplex PCR a Applied Biosystems systému kapilární elektroforézy. Uživatelská poznámka může být stažena zde: http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00115216.pdf. Plot analýza PCR multiplex profilů: odkaz na sekci Reviewing plots in GeneMapper Software (viz plot uvedený níže). Početní analýza PCR multiplex: odkaz na sekci Automated analysis. Prosím kontaktujte techserv@prestagen.com pro soubory Bin Set, Analysis Methods a Report Settings vhodné pro automatickou analýzu PLEXAMP profilů softwarem GeneMapper. 10 N_PXT3 V3
Peak Ratio Interpretace Výška = 100±20% 0.8-1.2 Normal 30-70% snížení výšky několika amplikonů 0.3-0.7 Heterozygotní delece 30-70% zvýšení výšky několika 1.3-1.7 amplikonů Duplikace Poměr mezi 0.3 a 0.7 pouze u jednoho amplikonu : viz Nejčastější problémy. Poměr < 0.3, obě alely mohou být variantní. Poměr mezi 0.7 a 0.8 nebo mezi 1.2 a 1.3: - Možná vysvětlení: Různá množství pacientovy DNA a referenční DNA. Různá kvalita pacientovy DNA a referenční DNA. Pacientova DNA a referenční DNA byly extrahovány různými metodami. - Zkontrolujte: Množství DNA pacientovy DNA a referenční DNA. Kvalitu DNA (OD 260/280 mezi 1.8 a 2.0). Metody extrakce DNA. - Pro více informací prosím kontaktujte techserv@prestagen.com. iii) Nejčastější problémy Žádné nebo příliš nízké peaky (Průměrná intenzita < 200) Možné příčiny: Chyba thermocycleru. Špatné nastavení elektroforézy. Špatná elektroforetická migrace. Malé množství a/nebo špatná kvalita vzorku DNA. Řešení: Zkontrolujte thermocycler. Nastavit parametry elektroforézy podle návodu uvedeného výše. Zkontrolujte migraci fluorescenčního DNA standardu a pokud je to nezbytné, pokračujte novou migrací. Zkontrolujte množství genomové DNA fluorescenční metodou (např. picogreen ) a pokud je to nezbytné, množství upravte. Zkontrolujte kvalitu vzorku DNA (např. solí, vysokým obsahem RNA). Dva příliš vysoké peaky (Průměrná intenzita > 4500) Možné příčiny: Špatné nastavení elektroforézy. Vysoce citlivý sekvenční přístroj (např. ABI3730). Vysoké množství vzorku DNA. Řešení: Nastavte parametry elektroforézy podle výše uvedených požadavků. Zkraťte injekční čas, pokud je to nezbytné. Zkontrolujte množství genomové DNA fluorescenční metodou (např. picogreen ) a pokud je to nezbytné, množství upravte. 11 N_PXT3 V3
Některé peaky pacientovy DNA a referenční DNA nemohou být překryty Možné příčiny: Kvalita pacientovy DNA a referenční DNA je různá. Množství pacientovy DNA a referenční DNA je různé. Špatná elektroforetická migrace. Řešení: Použijte stejné extrakční metody pro všechny vzorky. Proveďte další měření množství DNA pomocí referenční metody (picogreen ). (Optimální množství 25 ng). Zkontrolujte migraci fluorescenčního DNA standardu a pokud je to nezbytné, pokračujte novou migrací. Pouze jeden peak vykazuje 50% snížení výšky Možné příčiny: Přítomnost Single Nucleotide Polymorphism (SNP) v sekvenci PCR primeru. Proto může být amplifikována pouze jedna alela. Přítomnost mutace v sekvenci PCR primeru. Pouze jedna alela může být amplifikována. Delece nebo inserce jednoho nebo více nukleotidů v amplikonu spojeného s výskytem peaku navíc Řešení: Hledejte možnou variaci cílové sekvence lokalizovanou na primeru nebo na amplikonu. Kvůli technické podpoře prosím kontaktujte techserv@prestagen.com. 12 N_PXT3 V3
609 Chemin de la Bretèque, BP41 76232 BOIS-GUILLAUME CEDEX FRANCE Hlavní informace : info(a)prestagen.com Objednávka : order(a)prestagen.com Technická podpora : techserv(a)prestagen.com Kvalita : quality(a)prestagen.com Website : www.prestagen.com 13 N_PXT3 V3
14 N_PXT3 V3