Genetická pfiíbuznost kmenû Enterococcus faecium VanA u pacientû s hemato-onkologick m onemocnûním M. KOLÁ 1, R. PANTÒâEK 2, I. VÁGNEROVÁ 1, M. KESSELOVÁ 1, P. SAUER 1, I. MATOU KOVÁ 3, V. RÒÎIâKOVÁ 2, J. DO KA 2 1Ústav mikrobiologie FNO a LF UP v Olomouci, 2 Katedra genetiky a molekulární biologie, PřF MU, Brno, 3Ústav preventivního lékařství LF UP v Olomouci SOUHRN Kolář M., Pantůček R., Vágnerová I. et al.: Genetická příbuznost kmenů Enterococcus faecium VanA u pacientů s hemato-onkologickým onemocněním. Cíl: Cílem předložené práce byla molekulárně-biologická analýza kmenů Enterococcus faecium VanA, izolovaných z klinického materiálu pacientů Hemato-onkologické kliniky Fakultní nemocnice Olomouc v období 1997-2002, z prostředí uvedené kliniky a formulace hypotézy o zdroji a šíření VRE. Materiál a metody: Z klinického materiálu pacientů byly standardními kultivačními metodami izolovány a identifikovány enterokoky, včetně stanovení citlivosti k antibiotikům. Molekulárně biologická analýza byla provedena u vankomycin-rezistentních kmenů E. faecium s fenotypem VanA. Ke stanovení příbuznosti kmenů byla použita makrorestrikční analýza celkové chromozomální DNA naštěpené restrikční endonukleázou SmaI. Výsledky: Celkem bylo ve sledovaném období izolováno 2 647 kmenů Enterococcus sp., přičemž 121 kmenů (4,6 %) bylo identifikováno jako VRE. Nejčastěji se jednalo o kmeny E. faecium VanA (78 %) a E. faecalis VanB (10 %). Z prostředí uvedené kliniky, včetně biologického materiálu ošetřujícího personálu, bylo izolováno 5 vankomycin-rezistentních kmenů E. faecium VanA. SmaI makrorestrikční spektrum genomové DNA analyzovaných kmenů Enterococcus faecium VanA tvořilo více než 25 fragmentů o velikosti od 18 do 470 kb. U 60 kmenů bylo identifikováno 28 jedinečných restrikčních profilů, jejichž podobnost se pohybovala od 62 do 97 %. Mezi těmito profily byly dále identifikovány 4 často zastoupené typy, obsahující 5 a více kmenů, s podobností DNA-profilu 90 % a vyšší. Diskuze a závěr: Na základě získaných výsledků lze předpokládat endogenní i exogenní původ izolovaných kmenů E. faecium VanA. Lze potvrdit možnost přežívání těchto kmenů v prostředí nemocničního oddělení a následný přenos na hospitalizované pacienty. Současně je však nutné připustit i endogenní původ těchto kmenů a následnou selekci vlivem širokospektré antibiotické léčby. SUMMARY Kolář M., Pantůček R., Vágnerová I. et al.: Molecular-biology analysis of Enterococcus faecium VanA strains in hemato-oncological patients. Aim of the study: The aim of this work was the molecular-biology analysis of Enterococcus faecium VanA strains that were isolated from clinical material of the patients hospitalized at the Department of Hemato-Oncology (DHO) of the Teaching Hospital in Olomouc (Czech Republic) from 1997 to 2002, from the environment of this department and formulation of the hypothesis on the source and spread of the VRE. Material and methods: Enterococci were isolated and identified using conventional methods of cultivation including determination of antibiotic susceptibility. Molecular-biology analysis was performed in vancomycin-resistant E. faecium VanA strains isolated in various patients and from the environment of the DHO. A macrorestrictional analysis of the total chromosomal DNA that was broken by the restriction endonucleasis SmaI was used for the determination of the relationship of strains. This analysis was performed by pulse gel electrophoresis (CHEF, Mapper, Bio-Rad) that was followed by statistical processing of the restriction profiles by pooled analysis (Gel Compar, Applied Maths). Results: 2 647 strains of Enterococcus sp. were isolated during the follow-up period totally and 121 strains of them (4.6 %) were identified as VRE. Most common strains were E. faecium phenotype VanA (78 %) and E. faecalis phenotype VanB (10 %). Five strains of E. faecium VanA were isolated from the environment of the DHO including nasal swabs, hair and uniforms of health care providers. Twenty five to thirty three fragments sized 18 to 470 kb originate in SmaI macrorestrictional spectrum of genomic DNA of 60 E. faecium VanA strains and 28 unique restrictional profiles were identified, whose similarity varied from 62 to 97 %. Four frequently presented clonal types with 5 and more strains, whose similarity of DNA-profile was 90 %, were identified among these profiles. Three from five E. faecium VanA strains isolated from the environment had a unique profile that was not similar to any of clinical isolates and two strains are identical with the strains isolated from the patients. Conclusion: Based on the obtained results, both endogenous and exogenous origins of isolated E. faecium VanA could be supposed. Possibility of survival of these strains in the hospital department environment and subsequent transmission on hospitalized patients could be confirmed. Simultaneously, endogenous origin of these strains and subsequent selection caused by wide-spectral antibiotic treatment should be admitted. Klin mikrobiol inf lék 2003;9(6):284 288 Adresa: Doc. MUDr. Milan Kolář, Ph.D., Ústav mikrobiologie LF UP a FNO, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, fax: 585 632 966, e-mail: kolar@fnol.cz Došlo do redakce: 16. 6. 2003 Přijato k tisku: 14. 10. 2003 284 Klinická mikrobiologie a infekãní lékafiství 2003 6
Úvod U hemato-onkologických nemocných dochází vlivem myelosupresivního a imunosupresivního působení cytostatik k dalšímu výraznému oslabení obranné schopnosti organismu. Následné infekce různé etiologie (bakteriální, virové, mykotické, parazitární) pak značným způsobem ovlivňují prognózu nemocného [1]. Většinou se jedná o infekce endogenní, u nichž je rezervoárem vlastní mikroflóra střeva, ústní dutiny a rovněž kůže. Mikroorganismy, vyvolávající infekci, mohou být součástí primární mikroflóry. Častěji jsou však etiologickým agens bakterie osídlující sliznice pacienta sekundárně, vlivem nejrůznějších nemocničních faktorů (např. délka hospitalizace, probíhající chemoterapie). Sekundární bakteriální mikroflóru lze charakterizovat, mimo jiné, i vyšší rezistencí k antimikrobním přípravkům [2]. V posledním desetiletí dochází k významnému vzestupu podílu grampozitivních bakterií (především stafylokoků a enterokoků) na febrilních epizodách u hemato-onkologických pacientů s neutropenií [3,4]. Tyto bakteriální kmeny se často vyznačují multirezistencí k antibiotikům (např. methicilin-rezistentní stafylokoky). Velké nebezpečí rovněž představují vankomycin-rezistentní enterokoky (VRE), které mohou být závažným terapeutickým problémem. VRE se začaly objevovat se stoupající frekvencí od roku 1988 a poprvé byly izolovány právě na hematologických odděleních a transplantačních jednotkách [5,6]. Hlavním rizikovým faktorem pro jejich výskyt je nadměrná aplikace glykopeptidů (vankomycinu, teikoplaninu). Dále se na jejich selekci podílejí i cefalosporiny III. generace a fluorochinolony [7,8]. Velmi důležitou otázkou je zdroj, případně vhodné vehikulum, kde jsou VRE schopné přežívat a odkud se mohou dále šířit v prostředí zdravotnického zařízení. Lze předpokládat dvě varianty: Zdrojem VRE je mikroflóra gastrointestinálního traktu hospitalizovaného pacienta. To však znamená připustit skutečnost, že v běžné komunitní populaci se vyskytují lidé u nichž jsou VRE součástí normální střevní mikroflóry. Pacient je infikován z vhodného vehikula, kde VRE v nemocničním prostředí přežívají. K šíření dochází vlivem nejrůznějších vektorů, z nichž nejdůležitější je nemocniční personál (především ruce). Tyto kmeny je tedy možné považovat za nozokomiální. Cílem předložené práce bylo stanovení genetické příbuznosti kmenů Enterococcus faecium VanA, izolovaných zklinického materiálu pacientů Hemato-onkologické kliniky Fakultní nemocnice Olomouc (FNO) v období 1997 2002 azprostředí uvedené kliniky, včetně biologických materiálů od ošetřujícího personálu a na základě výsledků pak formulovat hypotézu o zdroji a šíření VRE. Materiál a metody Z klinického materiálu pacientů (výtěr z horních cest dýchacích, sputum, hnis, krev, moč, rektální výtěr), hospitalizovaných na Hemato-onkologické klinice FNO v období 1997 2002, byly standardními kultivačními metodami izolovány enterokoky [9]. Současně byly tyto bakteriální kmeny zachyceny i z prostředí uvedené kliniky. Mikrobiální kontaminace povrchů byla sledována kvalitativní metodou [10]. Stěry byly provedeny sterilním vatovým tampónem na dřevěné špejli, který byl těsně před použitím smočen ve sterilní vodě pro injekce, zplochy 100 x 100 mm nebo celého menšího předmětu ve dvou směrech na sebe kolmých. Bezprostředně po odběru byla výtěrovka zkrácena a inokulována do 5 ml Nutrient Broth w/1% peptone ve zkumavce a zahájena kultivace při teplotě 37 C po dobu 48 hodin. Poté byla tekutá půda vyočkována kalibrovanou kličkou na pevnou půdu (Columbia Blood Agar Base s příměsí 7 % beraní krve). Následovala 48 h inkubace při teplotě 37 C za aerobních podmínek. Enterokoky byly identifikovány pozitivním růstem na selektivní půdě Slanetz-Bartley, dále na základě kriterií podle Facklama a Collinse a biochemických vlastností za použití En-coccus testu (Lachema) [9,11]. Skupinová příslušnost VRE byla potvrzena pomocí latexaglutinační diagnostické soupravy Itest Strepto Group (Itest plus) průkazem specifického antigenu D. Rezistence k vankomycinu a teikoplaninu byla stanovena standardní diluční mikrometodou [12,13]. Hodnoty 4 mg/l u vankomycinu a 8 mg/l v případě teikoplaninu byly použity jako hraniční koncentrace pro citlivé kmeny. Pro určení fenotypu glykopeptidové rezistence byly vankomycin a teikoplanin dále naředěny na koncentrace 2 1 024 mg/l. Kvalita ředění obou antibiotik byla ověřována referenčními kmeny Staphylococcus aureus ATCC 29213 a Enterococcus faecalis ATCC 29212. Frekvence izolovaných enterokoků, včetně kmenů rezistentních k vankomycinu, byla hodnocena v ročních intervalech. Izolované kmeny byly zařazovány do databáze podle kritéria: 1 kmen 1 pacient 1 materiál 3 měsíce. U části vankomycin-rezistentních kmenů Enterococcus faecium s fenotypem VanA byla provedena makrorestrikční analýza pomocí pulzní gelové elektroforézy (PFGE). Kmeny byly zařazeny do testovaného souboru tak, aby bylo vyloučeno jejich opakování od stejného pacienta v průběhu kalendářního roku. Ke stanovení příbuznosti kmenů byla použita celková chromozomální DNA štěpená restrikční endonukleázou SmaI (Roche Diagnostics). Fragmenty DNA byly separovány pomocí pulzní gelové elektroforézy (CHEF Mapper, Bio-Rad). Statistické zpracování restrikčních profi- Tabulka 1 Pfiehled v skytu VRE na Hemato-onkologické klinice FNO 1997 1998 1999 2000 2001 2002 Celkem počet všech izolovaných enterokoků 630 495 397 412 344 369 2 647 počet VRE 8 27 27 22 17 20 121 VRE (%) 1,3 5,5 6,8 5,3 4,9 5,4 4,6 Klinická mikrobiologie a infekãní lékafiství 2003 6 285
lů bylo provedeno shlukovou analýzou (Gel Compar, Applied Maths) na základě metodiky použité autory Kolář et al. při molekulárně-biologické analýze VRE animální provenience [14]. PFGE-profily jednotlivých kmenů byly hodnoceny podle kritérií popsaných Goeringem et al. [15]. Výsledky Tabulka 1 uvádí četnost výskytu enterokoků, včetně kmenů rezistentních k vankomycinu, na Hemato-onkologické klinice FNO od roku 1997, kdy byly VRE poprvé na tomto pracovišti zachyceny. Celkem bylo ve sledovaném období izolováno 2 647 kmenů Enterococcus sp., přičemž 121 kmenů (4,6 %) bylo identifikováno jako VRE. Frekvence jednotlivých fenotypů enterokokové rezistence k vankomycinu je uvedena v tabulce 2. Nejčastěji se jednalo o kmeny Enterococcus faecium sfenotypem VanA (77,7 %) a Enterococcus faecalis s fenotypem VanB (9,9 %). Analýza výskytu VRE v klinickém materiálu pacientů, hospitalizovaných na Hemato-onkologické klinice FNO ve sledovaném období, je uvedena v tabulce 3. VRE byly s nejvyšší četností výskytu izolovány z rektálního výtěru (55,2 %), moči (20,0 %), sputa Tabulka 2 Pfiehled druhû VRE a jejich fenotypû (10,3 %) a krve (8,3 %). Z ostatních klinických materiálů byly VRE izolovány s frekvencí pod 3 %. Z prostředí Hemato-onkologické kliniky FNO (instrumentární stolek, prostěradlo) a stěrů z nosu, vlasů a uniforem ošetřujícího personálu bylo izolováno 5 vankomycin-rezistentních kmenů Enterococcus faecium s fenotypem VanA. Současně byla provedena analýza vybrané skupiny vankomycin-rezistentních kmenů Enterococcus faecium VanA molekulárně-biologickými metodami. Celkem bylo analyzováno 55 kmenů izolovaných z biologického materiálu hospitalizovaných pacientů v období 1997 2002 a 5 izolátů z prostředí uvedené kliniky, včetně biologického materiálu ošetřujícího personálu. Podobnost genomové DNA testovaných izolátů. SmaI makrorestrikční spektrum genomové DNA analyzovaných kmenů Enterococcus faecium VanA tvořilo více než 25 fragmentů o velikosti od 18 do 470 kb. Pro obtížně hodnotitelné výsledky separace restrikčních fragmentů o velikosti 18 70 kb, byly pro molekulární typizaci využity pouze velké fragmenty (80 kb a větší), jejichž počet byl u každého studovaného kmene v rozmezí 10 až 13. Malé fragmenty nebyly do srovnávací Druh/fenotyp Abs. počet kmenů Relativní četnost (%) Enterococcus faecium VanA 94 77,7 Enterococcus faecium VanB 9 7,4 Enterococcus faecalis VanA 6 5,0 Enterococcus faecalis VanB 12 9,9 Tabulka 3 V skyt VRE v klinickém materiálu pacientû Hemato-onkologické kliniky FNO Materiál Počet izolovaných VRE Relativní četnost (%) rektální výtěr 67 55,2 moč 24 20,0 sputum 12 10,3 krev 10 8,3 ostatní 8 6,2 analýzy zahrnuty. U 60 kmenů bylo identifikováno 28 jedinečných restrikčních profilů, jejichž podobnost se pohybovala od 62 do 97 %. Mezi těmito profily byly dále identifikovány 4 často zastoupené typy, obsahující 5 a více kmenů, s podobností DNA-profilu 90 % a vyšší. Klonální typ I byl zastoupen deseti kmeny, typ II pěti kmeny, typ III devíti kmeny a typ IV 23 kmeny. Další kmeny měly buď jedinečný profil, nebo byly zastoupeny dvojicí příbuzných kmenů. Dendrogram všech 60 analyzovaných kmenů je uveden na obr. 1. Výsledek molekulárně biologické analýzy vybraných kmenů je uveden na obr. 2. Sledování podobnosti makrorestrikčního profilu kmenů, vyskytujících se v jednotlivých letech 1997 2002. Uch typů I a III byla pozorována rovnoměrná distribuce izolátů ve sledovaném období. Klonální typ II obsahoval pouze kmeny z roku 1998 a 1999. U ho typu IV převažovaly izoláty z roku 2001 (patří sem všech 10 izolátů pocházejících z tohoto roku). Z následujícího roku 2002 byly do ho typu IV zařazeny pouze 3 kmeny. Kmeny z prostředí. Z pěti kmenů Enterococcus faecium VanA, izolovaných z prostředí Hemato-onkologické kliniky FNO a biologického materiálu ošetřujícího personálu, měly 3 (izoláty z instrumentárního stolku, sesterské zástěry a výtěru z nosu) jedinečný profil, který se nepodobal žádnému z klinických izolátů. Dva kmeny z prostředí (izoláty z prostěradla a vlasů ošetřujícího personálu) jsou identické s kmeny izolovanými od pacientů, přičemž kmen získaný z prostěradla je identický nejen s kmenem Enterococcus faecium VanA z humánního materiálu ze stejného roku (1999), ale i dalšími 4 kmeny z jiných let, patřících do ho typu III. Diskuze Nepříznivým faktorem ve vývoji bakteriální rezistence je, mimo jiné, vznik a šíření VRE, které představují potencionální riziko pro hospitalizované pacienty. Tuto skutečnost je nutné mít na zřeteli právě v případě hematoonkologických pacientů, kteří jsou vzhledem k oslabení jejich obranné schopnosti zvláště ohroženi. V případě 286 Klinická mikrobiologie a infekãní lékafiství 2003 6
VRE s fenotypy VanA a VanB se jedná o rezistenci získanou, transferabilní, aproto z epidemiologického i klinického hlediska velmi závažnou [16,17]. Z klinického materiálu pacientů Hemato-onkologické kliniky FNO jsou VRE pravidelně izolovány od roku 1997 [8,18]. Četnost jejich výskytu mezi všemi izoláty enterokoků představuje v průměru 5 %. VRE byly nejčastěji identifikovány jako Enterococcus faecium VanA (78 %) a Enterococcus faecalis VanB (10 %). Z rektálních výtěrů bylo izolováno 55 % těchto kmenů a lze tedy předpokládat, že většina VRE představuje kolonizaci gastrointestinálního traktu, aniž vyvolává infekci. Na základě výsledků, získaných při molekulárně-biologické analýze kmenů Enterococcus faecium VanA, lze předpokládat jejich endogenní i exogenní původ. Byla prokázána přítomnost 4 ch typů, přičemž kmeny patřící do jednotlivých typů mají podobnost DNA-profilu 90 % a vyšší, což naznačuje, že se jedná o stejné nebo velice blízce příbuzné kmeny. Lze tedy s vysokou pravděpodobností předpokládat jejich šíření a s tím související nozokomiální charakter. Dva vankomycin-rezistentní kmeny Enterococcus faecium VanA, izolované z prostěradla a vlasů ošetřujícího personálu, jsou identické s kmeny izolovanými od pacientů. Je tak potvrzena možnost kolonizace ošetřujícího personálu a následného přenosu na hospitalizované pacienty prostřednictvím různých vektorů prostředí. Největší význam pak mají zřejmě ruce zdravotnického personálu. V literatuře je rovněž uváděna voda v záchodové míse jako vhodné vehikulum pro přežívání VRE, odkud se pak mohou šířit mikroaerosolem nebo případně kontaktem prostřednictvím rukou nebo oděvu [19]. Vzhledem ke skutečnosti, že některé analyzované kmeny měly jedinečný profil, je současně nutné připustit i jejich endogenní původ a následnou selekci vlivem širokospektré antibiotické léčby. V praxi tato hypotéza znamená, že pacient je hospitalizován již jako nosič VRE, které jsou součástí bakteriální mikroflóry gastrointestinálního traktu. Širokospektrá antibiotická léčba, kterou si vyžádá komplikující bakteriální infekce nebo profylaktická aplikace antibiotik, vede k selekci a pomnožení VRE. Tyto je pak možné izolovat a identifikovat i při rutinním bakteriologickém monitorování hemato-onkologických pacientů. 70 80 90 100 Zajímavým zjištěním rovněž bylo, že 2 kmeny z prostředí (izoláty z instrumentárního stolku a sesterské zástěry) a 1 kmen z biologického materiálu Obr. 1 Dendrogram 60 izolátû Enterococcus faecium VanA zkonstruovan na základû Diceho koeficientû podobnosti, vypoãítan ch pro kaïdou dvojici kmenû a s pouïitím metody UPGMA pro shlukování Podobnost Smal makrorestrikãního profilu (%) 1/02 3/00 881H/99 486H/99 27/98 41/98 52/99 2/00 9/00 8/00 36/98 57/99 59/99 10/02 782H/99 29/98 34A/98 48/99 54/99 4/02 11/98 6/02 22/98 10/00 9822/00 6/97 8/02 5/02 32/98 39/98 1/00 2/97 17/98 53/99 520H/99 4/00 3/02 19/01 43/99 726H/99 18/01 50/99 5/00 44/99 13/98 20/98 40/98 49/99 6/00 11/01 12/01 13/01 14/01 15/01 16/01 17/01 20/01 2/02 Legenda: 7/02 9/02 Číslo kmene/rok izolace Kmeny z prostředí: 881H/99, 486H/99, 782H/99, 520H/99, 726H/99 typ I typ II typ III typ IV Klinická mikrobiologie a infekãní lékafiství 2003 6 287
Obr. 2 V sledek PFGE 20 kmenû Enterococcus faecium VanA ošetřujícího personálu (výtěr z nosu) měly jedinečný profil, který se nepodobal žádnému z klinických izolátů. Tuto skutečnost bude nutné ještě potvrdit analýzou malých fragmentů DNA, přesto lze předběžně vyslovit dvě vysvětlující teorie: Kmeny pochází od nosičů z řad zdravotnického personálu a nebyly přeneseny nebo alespoň prokázány u hospitalizovaných pacientů (tuto teorii podporuje průkaz VRE ve výtěru z nosu). Kmeny pochází od hospitalizovaných pacientů, přičemž v jejich klinických materiálech nebyly prokázány. Nadále však zůstává velmi důležitou otázkou primární zdroj VRE. Jako rezervoár mohou mít velký význam i zvířata, u nichž enterokoky tvoří přirozenou součást mikroflóry střevního traktu. VRE byly izolovány nejen z humánního materiálu pacientů hospitalizovaných v různých nemocnicích v České republice, ale rovněž ze slepičích chovů [8,18,20,21,22]. Jejich výskyt u zvířat mohl být podmíněn v minulosti rozšířeným používáním avoparcinu (glykopeptidový veterinární přípravek) jako růstového promotoru ve zvířecích chovech [23,24]. Lze tedy předpokládat, že jejich přítomnost v lidské populaci může mít původ i v potravě živočišného původu. Další možností je pravděpodobně přenos VRE na osoby v kontaktu se zvířecími zdroji. V obou případech dochází ke zvyšování rezervoáru těchto kmenů v lidské populaci. V této souvislosti se jako velmi důležitý jeví průkaz VRE u osob v komunitním prostředí České republiky [25]. V konkrétním olomouckém regionu byly VRE izolovány z klinického materiálu pacientů FNO, z chovů drůbeže a rovněž z humánního biologického materiálu komunitní populace [14,18,22,25]. Je tedy zřejmé, že je nutné vzít v úvahu možnost jejich šíření z animální oblasti do lidské komunitní populace a následně i do zdravotnických zařízení. Na nemocničních odděleních pak nastává možnost jejich přežívání a dalšího šíření prostřednictvím vektorů prostředí (včetně ošetřujícího personálu) a vlivem širokospektré antibiotické léčby. Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR č. NI/7305-3. Literatura 1. Bow EJ. Infection risk and cancer chemotherapy: the impact of the chemotherapeutic regimen in patients with lymphoma and solid tissue malignancies. J Antimicrob Chemother 1998;41(Suppl D):1 5. 2. Kolář M, Fáber E, Lochmannová J. jr, et al. Antibiotická léčba pacientů s febrilní neutropenií. Transfuz Hematol Dnes 2002;8:20 24. 3. Oppenheim BA. The changing pattern of infection in neutropenic patients. J Antimicrob Chemother 1998;41(Suppl D):7 11. 4. Rolston KVI, Raad I, Whimbey E, Bodey GP. The changing spectrum of bacterial infections in febrile neutropenic patients. In Klastersky JA. Febrile neutropenia. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1997:53 56. 5. Speller DCE, Lynn WA, Rogers TR. Glycopeptide resistance in gram-positive bacteria. Clin Microb Infect 1995;1:54 59. 6. Weber DJ, Rutala WA. Role of environmental contamination in the transmission of vancomycin-resistant enterococci. Inf Control Hosp Epidemiol 1997;18:306 309. 7. Heath CH, Blackmore TK, Gordon DL. Emerging resistance in Enterococcus sp. Med J Aust 1996;164:116 120. 8. Kolář M, Vágnerová I, Látal T. Vliv selekčního tlaku antimikrobních preparátů na výskyt vankomycinrezistentních enterokoků u pacientů s hematologickým onemocněním. Klin Mikrobiol Inf Lék 2001;7:230 234. 9. Facklam RR, Collins MD. Identification of Enterococcus species isolated from human infections by conventional test scheme. J Clin Microbiol 1989;27:731 734. 10.Vybrané mikrobiologické metodiky používané při prevenci a výskytu nemocničních nákaz (Mikrobiologický manuál pro NN). Acta Hyg Epidemiol Microbiol 1992; příloha č. 7. 11. Burkwall MK, Hartman PA. Comparison of direct plating media for the isolation and enumeration of enterococci in certain frozen foods. Appl Microbiol 1964; 12:18 23. 12.Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům vybrané metody. Trios, Praha;1998. 13.National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Sixth informational supplement. Nat Comm Clin Lab Standards, Villanova PA;1995. 14.Kolář M, Pantůček R, Bardoň J, et al. Occurrence of antibiotic-resistant bacterial strains isolated in poultry. Vet Med Czech 2002;47:52 59. 15. Goering RV. The molecular epidemiology of nosocomial infection. In: Specter S, (Ed.) Rapid detection of infectious agents. Plenum Press, New York 1998;131 157. 16. Murray BE. Vancomycin-resistant enterococci. Am J Med 1997;101:284 293. 17. Murray BE. Diversity among multidrug-resistant enterococci. Emerg Infect Dis 1998;4:37 47. 18. Kolář M, Vágnerová I, Kohnová I. Záchyt vankomycin rezistentních enterokoků ve Fakultní nemocnici v Olomouci. Klin Mikrobiol Inf Lék 1997;3:189 191. 19.Noble MA, Isaac-Renton JL, Bryce EA, et al. The toilet as a transmission vector of vancomycin-resistant enterococci. J Hosp Infect 1998;40:237 241. 20. Bergerová T, Turková S. První vankomycin-rezistentní enterokoky ve FN v Plzni. Klin Mikrobiol Inf Lék 1997;3:287 288. 21. Hanslianová T, Burgetová D. Diskuzní příspěvek k článku Záchyt vankomycin-rezistentních enterokoků ve Fakultní nemocnici v Olomouci. Klin Mikrobiol Inf Lék 1997;9:256. 22. Kolář M, Bardoň J, Vágnerová I, et al. Occurrence of vancomycin-resistant enterococci in hens in the central region of Moravia. Vet Med Czech 2000;45:93 97. 23. Aarestrup FM. Occurrence of glycopeptide resistance among Enterococcus faecium isolates from conventional and ecological poultry farms. Microb Drug Resist 1995;1:255 257. 24. Bates J, Jordens JZ, Criffiths DT. Farm animals as a putative reservoir for vancomycin-resistant enterococci infection in man. J Antimicrob Chemother 1994; 34:507 516. 25. Kolář M, Čekanová L, Vágnerová I. Průkaz vankomycin-rezistentních enterokoků u komunitní populace České republiky. Zprávy CEM 2003;12:73 74. 288 Klinická mikrobiologie a infekãní lékafiství 2003 6