DIPLOMOVÁ PRÁCE. VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie DIPLOMOVÁ PRÁCE Protilátky ke tkáňové transglutaminase ve screeningu celiakií Vypracovala: Vedoucí diplomové práce: Konzultant: Studijní obor: Studijní zaměření: Jitka Hlavatá MUDr. Petr Kocna, CSc. MUDr. Zdislava Vaníčková Obecná a aplikovaná biochemie Biomedicínské inženýrství Prohlašuji, že jsem v předložené diplomové práci použila jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury. V Praze dne 9. května 2006 podpis

SOUHRN Enzym tkáňová transglutaminasa hraje velmi důležitou roli v rozvoji celiakie, geneticky podmíněného autoimunitního onemocnění, které se projevuje chronickým zánětem tenkého střeva. Úkolem této práce bylo porovnat metodu ImmunoDot s rutinní metodou klinické laboratoře, a to při stanovení čtyř sérologických markerů celiakie, protilátek proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA a IgG a protilátek proti gliadinu ve třídě IgA a IgG. Stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase třídy IgA bylo doporučeno pro screening celiakie. Obě metody jsou založeny na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy. Bylo analyzováno celkem 96 vzorků, rozdělených do tří skupin, podle výsledků rutinního stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase IgA. Zjištěná diagnostická přesnost metody ImmunoDot vzhledem k rutinní metodě, která byla při výpočtu považována za referenční, byla nejvyšší právě u protilátek ke tkáňové transglutaminase třídy IgA. Diagnostická specificita stanovení byla 100% a senzitivita 78,4%. Metoda ImmunoDot může být použita pro screening celiakie v klinických laboratořích. Interakce mezi tkáňovou transglutaminasou a fragmenty α-gliadinu byly zkoumány pomocí nekompetitivní enzymové imunoanalýzy. Na začátek byl zařazen krok, kdy proběhla preinkubace enzymu s fragmenty gliadinu. Bylo prokázáno, že fragmenty α-gliadinu blokují epitopy tkáňové transglutaminasy, na které se následně nemohou vázat protilátky. Zvýšení koncentrace fragmentů při preinkubaci má za následek snížení detekované hladiny protilátek proti attg IgA v séru. Bohužel při identifikaci peptidových fragmentů pomocí hmotnostní spektrometrie se podařilo určit pouze tři fragmenty pocházející prokazatelně z α-gliadinu. Vzhledem k malému množství těchto fragmentů je nebylo možné použít pro další experimenty.

SUMMARY Enzyme tissue transglutaminase has fundamental role in development of celiac disease, autoimmune disorder with genetic predisposition. It is characterized by chronic bowel inflammation. The aim of this work was to compare two different methods, classical method used in clinical laboratory with ImmunoDot. Both methods are based on noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay. All samples were evaluated in four celiac serological markers, antibodies against tissue transglutaminase class IgA and IgG and antibodies against gliadin class IgA and IgG. Tissue transglutaminase antibodies class IgA has been recommended for celiac screening. 96 pacient s samples were evaluated. Samples were divided in three groups according to result of antibodies against tissue transglutaminase class IgA assay. Diagnostic accurancy of ImmunoDot in reference with classic method was highest for antibodies against tissue transglutaminase class IgA assay. Diagnostic specificity of this assay was 100% and diagnostic sensitivity was 78,4%. ImmunoDot method can be used in celiac screening in clinical laboratories. Interactions between tissue transglutaminase and α-gliadin fragments were evaluated by noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay, when one step involving incubation of enzyme with α-gliadin fragments was added. It was found tissue transglutaminase epitopes are blocked by these fragments, so antibodies cannot bind there. Increasing concentration of fragments during preincubation cause decrease of detected amount of antibodies against tissue transglutaminase IgA in pacient s serum. Unfortunately, within identification of α-gliadin fragments using mass spectrometry only three α-gliadin fragments were confirmed. According to low amont of these fragments future experiments with them were not possible.

Ráda bych poděkovala školiteli MUDr.Petru Kocnovi, CSc. a konzultantce MUDr. Zdislavě Vaníčkové z Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF UK a VFN za odborné vedení a pomoc při řešení úkolů této diplomové práce. Děkuji za vytvoření ideálního prostředí pro mou práci. Mé díky dále patří Mgr.Miloslavu Šandovi z Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR za možnost využití jeho laboratoře pro některá analytická stanovení v této práci. studia. Zvlášť bych pak chtěla poděkovat svým rodičům za všestrannou podporu během

OBSAH 1. ÚVOD 1 2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2 2.1 CELIAKIE 2 2.1.1 Gluten 2 2.1.2 Klinické projevy 2 2.1.2.1 Klasická forma 3 2.1.2.2 Tichá forma 3 2.1.2.3 Latentní forma 3 2.1.2.4 Potenciální forma 3 2.1.3 Incidence onemocnění 4 2.2 PATOGENEZE CELIAKIE 5 2.3 DIAGNOSTIKA CELIAKIE 7 2.3.1 Biopsie 8 2.3.2 Dechové testy 8 2.3.2.1 Dechové testy H 2 8 2.3.2.2 Dechové testy 13 C, 14 C 9 2.3.3 Sérologické testy 10 2.3.3.1 Protilátky proti tkáňové transglutaminase 10 2.3.3.2 Protilátky proti gliadinu 11 2.3.3.3 Protilátky proti endomysiu 11 2.3.3.4 Protilátky proti retikulinu 12 2.4 TKÁŇOVÁ TRANSGLUTAMINASA 12 2.4.1 Enzymologie 13 2.4.2 Neenzymatická role tkáňové transglutaminasy při rozvoji celiakie 15 2.5 ALTERNATIVA K BEZLEPKOVÉ DIETĚ? 16 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 17 3.1 MATERIÁLOVÉ A PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ 17 3.1.1 Chemikálie 17 3.1.2 Přístroje a materiál 17 3.1.3 Složení roztoků 18 3.1.4 Pacienti 20 3.2 METODIKA MĚŘENÍ 21 3.2.1 ELISA (Dialab) 21 3.2.1.1 Modifikace metody, preinkubace s gliadinem a PTP 22 3.2.2 ImmunoDot (D-tek) 23 3.2.3 ELISA (D-tec) 24 3.2.4 Výpočet diagnostické senzitivity, specificity a Cohenova κ 25 3.2.5 Hmotnostní spektrometrie spojená s kapilární chromatografií 26 3.2.6 MALDI TOF hmotnostní spektrometrie 27

4. VÝSLEDKY A DISKUSE 28 4.1 SROVNÁNÍ METOD ELISA A IMMUNODOT 28 4.1.1 Srovnání rutinní metody ELISA a metody ImmunoDot 28 4.1.1.1 Srovnání stanovení attg IgA 28 4.1.1.2 Srovnání stanovení attg IgG 29 4.1.1.3 Srovnání stanovení AGA IgA a IgG 30 4.1.2 Srovnání vizuálního vyhodnocení metody ImmunoDot a jejího qqq vyhodnocení počítačovým programem 33 4.1.3 Srovnání attg IgA s vyhodnocením proužku ImmunoDot IgA jako celku 34 4.1.4 Srovnání metody ELISA a metody ImmunoDot při použití stejného qqq antigenu 35 4.1.5 Srovnání stanovení protilátek různými komerčními sety metodou ELISA 37 4.2 INTERAKCE MEZI TKÁŇOVOU TRANSGLUTAMINASOU qqqqqqqqqqq A GLIADINEM NEBO JEHO FRAGMENTY 39 4.2.1 Interakce mezi gliadinem a tkáňovou transglutaminasou 39 4.2.2 Interakce mezi PTP fragmenty α-gliadinu a tkáňovou transglutaminasou 39 4.2.3 Chromatografie PTP fragmentů 41 4.2.4 Určení molekulové hmotnosti pomocí MALDI-TOF 42 4.2.5 Sekvenace PTP fragmentů de novo následná identifikace pomocí qqq BLAST vyhledávání 43 5. ZÁVĚR 45 6. LITERATURA 47 7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 50 8. PŘÍLOHY 51 Tabulka XIV. Přehled všech hodnot použitých při srovnání metody ELISA a metody ImmunoDot 52

1. ÚVOD Tkáňová transglutaminasa má zásadní roli v patogenezi celiakie, autoimunitního onemocnění, které se projevuje chronickým zánětem tenkého střeva. Stanovení sérologických markerů je vyvíjeno jako první test. Pro screening je doporučováno stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA, které má nejlepší diagnostické vlastnosti, tedy senzitivitu a specificitu. Jediným jednoznačně průkazným vyšetřením je enterobiopsie tenkého střeva, toto vyšetření není operací a není nijak zvláště náročné. V klinických laboratořích se pro toto stanovení používají komerční sady principiálně založené většinou na metodě ELISA. Na trhu je dostupné velké množství těchto sad, většinou v provedení na mikrotitračních destičkách. Cut off hodnota těchto testů je určena pouze empiricky, výrobce ji většinou uvádí s doporučením, aby si laboratoř stanovila své vlastní rozmezí normálních a patologických hodnot. Cílem práce je porovnání výsledků stanovení markerů celiakie, především tkáňové transglutaminasy, při použití různých komerčních setů, a to jak v provedení na mikrotitračních destičkách, tak i na papírových proužcích metodou zvanou ImmunoDot. V odborné literatuře se v souvislosti se zvýšením diagnostické specificity a senzitivity objevil termín transglutaminasa aktivovaná gliadinem. Z tohoto důvodu bylo zkoumáno, jaký vliv má preinkubace enzymu s jednotlivými typy gliadinů nebo s fragmenty α-gliadinu, které vznikly následkem štěpení tohoto peptidu enzymy trávicího traktu, na stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase třídy IgA. 1

2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1. CELIAKIE Celiakie, jinak také celiakální sprue nebo glutenová enteropatie, je geneticky podmíněné autoimunitní onemocnění, které se projevuje intolerancí k pšeničnému lepku (glutenu) resp. k dalším zásobním proteinům příbuzných obilovin, ječmene, žita a ovsa. 1 Po požití potravin obsahujících lepek dochází k abnormální imunitní odpovědi, která se projevuje chronickým zánětem tenkého střeva. 2 Celiakie je velmi významně asociována s lidskými leukocytárními antigeny (HLA). 3 Vzhledem k permanentní intoleranci je v současné době jediným léčebným řešením dieta vylučující gliadin z potravy. 4 2.2.1 Gluten Gluten je směs proteinů nerozpustných ve vodě, kterou lze získat z pšeničné mouky. Skládá se z více než dvou stovek homologních gluteninů a gliadinů. Gliadiny jsou dále rozděleny na α-, β-, γ- a ω-gliadiny. Gluteniny se dělí na nízkomolekulární a vysokomolekulární. 5 Za toxicitu jsou zodpovědné převážně gliadiny, proteiny obsahující velké množství glutaminu a prolinu (35 a 15% z celkového aminokyselinového složení). 6,7 Rezistence vůči trávicím enzymům je dána obsahem prolinu. 4 2.1.1. Klinické projevy Příznaky onemocnění celiakií bývají velmi nespecifické a z tohoto důvodu většina případů není stále ještě diagnostikována. Pomůckou při klasifikaci celiakie je tzv. teorie ledovce. (Schéma 1) 8 2

2.1.2.1 Klasická forma Klasická forma se prezentuje gastrointestinálními symptomy (bolesti v břišní dutině, zácpa, diarea, steatorea, zvracení) a následky poruchy vstřebávání živin neboli malabsorpce (ztráta hmotnosti, anemie, osteoporóza, avitaminózy, nervové poruchy a u dětí i poruchy tělesného a duševního vývoje). Lze ji potvrdit vyšetřením sérologických markerů a biopsií tenkého střeva. 9 2.1.2.2 Tichá forma Při tiché formě onemocnění pacient netrpí žádnými gastrointestinálními příznaky, ovšem výsledek sérologického screeningu je pozitivní a následná biopsie tenkého střeva diagnózu celiakie potvrdí. 9 2.1.2.3 Latentní forma Jedinci trpící latentní formou onemocnění nemají žádné klinické příznaky a obvykle bývají diagnostikováni pomocí sérologických markerů. Histologický rozbor tenkého střeva je normální, ovšem s velkou pravděpodobností dojde během života k patologickým změnám v tenkém střevě. 9 2.1.2.4 Potenciální forma Potenciální forma je charakteristická pouze genetickými predispozicemi, tedy přítomností HLA-DQ2 a HLA-DQ8 a zvýšenou přítomností intraepiteliálních lymfocytů exprimujících TCR typu γδ. 10 Molekula HLA-DQ2, kódována alelami β1*0201 a α1*0501 se vyskytuje 95% pacientů, kdežto u zdravých jedinců pouze ve 20-30%. 3 U většiny pacientů, u kterých bylo stanovení HLA-DQ2 negativní, byla zjištěna přítomnost HLA-DQ8. 11 3

Schéma 1. Teorie ledovce. 1, 8 Rozdělení jednotlivých forem celiakie na základě klinických projevů 2.1.3 Incidence onemocnění Incidence celiakie má v poslední době vzrůstající tendenci, vzhledem k neustálému vývoji sérologických testů. 9 Výsledky screeningu v normální populaci uvádí incidenci onemocnění mezi 1:100 a 1:133, což potvrzuje i studie u dětí do pěti let, která uvádí incidenci 1:104. 12,13,14 Toto číslo vzrůstá u příbuzných nemocných celiakií až na 1:22. 13 Zvýšený výskyt nemoci je u také u pacientů, kteří trpí i jinými nejen autoimunitními chorobami jako jsou např. diabetes mellitus, systémový lupus erythematodes, poruchy štítné žlázy, revmatoidní artritida a Downův syndrom. 9 4

2.2. PATOGENEZE (Obr. 1) Ačkoli je celiakie považována za nejlépe prostudované autoimunitní onemocnění, patogeneze této nemoci je velmi složitá a některé kroky zůstávají stále neobjasněny. Rozvoj onemocnění je jednoznačně podmíněn přítomností glutenu v potravě. Po jeho požití dojde k hydrolýze pšeničných proteinů trávicími enzymy pepsinem, trypsinem, chymotrypsinem, elastasou, enteropeptidasami, karboxypeptidasami a enzymy kartáčového lemu enterocytů, čímž dojde k vzniku krátkých peptidů o délce maximálně několik desítek aminokyselin, které nejsou dále štěpitelné trávicími enzymy. 6 Peptidy se potom transportují přes epitel tenkého střeva, do subepiteliální vrstvy, kde se nachází enzym tkáňová transglutaminasa. Mechanismus transportu není stále zcela objasněn a je vysoce pravděpodobné, že právě způsob, jakým jsou tyto krátké peptidy schopny prostoupit přes epiteliální vrstvu složenou z enterocytů, je jedním z klíčových kroků vzniku a rozvoje onemocnění. 10 Bylo potvrzeno, že některé genetické modifikace proteinů myosinového typu mají za následek zvýšení permeability buněčných membrán. Například gen MYO9B kóduje protein myosin typu IX, který obsahuje doménu pro Rho-GTPasa aktivující protein. Tato GTPasová doména katalyzuje přeměnu aktivního Rho-GTP na neaktivní Rho- GDP, čímž zasahuje do regulačních drah přestavby cytoskeletu a s tím spojených dějů a také mimo jiné ovlivňuje vlastnosti buněčných membrán. 16 Zvýšená permeabilita může být také ovlivněna nadměrnou expresí zonulinu, proteinu, který reguluje mezibuněčný transport. 17 Fragmenty gliadinu jsou poté vysoce pravděpodobně modifikovány tkáňovou transglutaminasou. 5 Deaminované peptidy jsou zachyceny na buňkách prezentujících antigen (APC) navázáním na receptory HLA-DQ2 popř. HLA-DQ8 a tyto buňky je dále prezentují nezralým T buňkám. Ty je rozeznají jako antigen a díky vzájemné interakci dojde k diferenciaci T-buněk. 18 Enteropatie je potom indukována uvolněním interferonu γ a dalších prozánětlivých cytokinů produkovaných efektorovými T buňkami. 15 Rovněž dochází k uvolňování matrixových methaloproteinas, které mohou poškozovat sliznici tenkého střeva. 10 5

Obr. 1. Průběh patogeneze. Gliadin v potravě je vystaven působení trávicích enzymů, včetně prolylendopeptidas, za vzniku dále neštěpitelných krátkých peptidů. Ty jsou poté transportovány do subepiteliální vrstvy a vystaveny působení tkáňové transglutaminasy (ttg), která specificky modifikuje některé glutaminové zbytky na glutamátové. Modifikované peptidy jsou pomocí APC (buňky prezentující antigen) prezentovány CD4+ T buňkám a dochází k interakci s HLA DQ2 nebo DQ8. Následkem toho dojde k rozvoji imunitní odpovědi, a to jak ke vzniku zánětlivé reakce, která poškozuje sliznici tenkého střeva, tak ke stimulaci B lymfocytů a produkci protilátek proti gliadinu a tkáňové transglutaminase. 15 6

2.3. DIAGNOSTIKA CELIAKIE Gastrointestinální příznaky celiakie nejsou příliš specifické, navíc mnoho pacientů trpí jen některými nebo vůbec žádnými, tudíž její diagnóza není snadná. Tyto příznaky mohou trvat i několik let než je diagnostikována. 19 K rozvoji onemocnění může dojít v jakémkoli věku, ale nejčastěji bývá celiakie diagnostikována během prvních dvou let života, tedy v době, kdy se gliadin stává složkou potravy, dále potom v pubertě a ve středním věku. Z hlediska pohlaví bývá diagnostikováno více žen než mužů, ale současné studie se přiklánějí k tomu, že incidence bude ekvivalentní. 9 (Schéma 2, Tab. I) Schéma 2. Postup při diagnóze celiakie 20 7

Tab. I. Postup při diagnostikování celiakie 21 Kritéria pro diagnostiku celiakie podle Evropské společnost pro pediatrickou gastroenterologii, hepatologii a výživu (ESPGHAN) 1. anamnéza a klinické projevy odpovídající celiakii 2. pozitivní sérologické markery celiakie 3. histologický průkaz změn sliznice tenkého střeva 4. klinická i sérologická odpověď na bezlepkovou dietu 5. vyloučena jiná onemocnění podobná celiakii 2.3.1. Biopsie Pro diagnózu celiakie je biopsie stále zásadní. Ovšem vzhledem k jeho invazivnímu charakteru se k tomuto vyšetření přistupuje až po stanovení sérologických markerů. Sliznice tenkého střeva při celiakii je charakteristická atrofií klků, zvýšeným množstvím intraepiteliálních lymfocytů a hyperplasií krypt. 9, 22 (Obr. 2) 2.3.2. Dechové testy Diagnostika celiakie pomocí dechových testů je v současnosti se rozvíjející vyšetření. Jako jediné je neinvazivní. 2.3.2.1. Dechové testy H 2 Použití těchto testů se neomezuje jen na diagnostiku celiakie, ale lze ho také použít k mnoha dalším speciálním měřením v gastroenterologii. Princip testu spočívá v podání substrátu (sorbitol v případě celiakie) a následnému měření koncentrace H 2 ve vydechovaném vzduchu. 23 Způsob měření koncentrace může být pomocí plynové chromatografie, nebo pomocí elektrochemického článku. 24 8

Obr. 2. Zdravá sliznice a sliznice při onemocnění celiakií a. Histologie normální sliznice, s klky (V) a kryptami (C). Lamina propria neboli subepiteliální vrstva (LP) se nachází mezi kryptami a uvnitř každého klku. Nachází se tam mnoho krevních i lymfatických vlásečnic, kde dochází k absorpci produktů trávení. b. Sliznice při onemocnění celiakií je charakteristická atrofií klků, hyperplasií krypt a zvýšenou infiltrací lymfocytů v epitelu a subepiteliální vrstvě.(převzato) 22 2.3.2.2. Dechové testy 13 C, 14 C Princip těchto dechových testů spočívá v měření poměru izotopů 12 C a 13 C ve vydechovaném CO 2, který stoupá přímo úměrně s mírou hydrolýzy substrátu značeného izotopem 13 C. Při stanovení malabsorpce se jako substrát používá značená xylosa, laktosa nebo kyselina palmitová. 9

V současné době se vzhledem k jeho nestabilitě již ustupuje od používání izotopu 14 C, ale princip těchto testů je stejný. Způsobů detekce 13 CO 2 ve vydechovaném vzduchu je několik. Nejpřesnější je detekce hmotnostní spektrometrií (IRMS), pro kterou je nutné pouze malé množství vzorku. Více rozšířené, především z ekonomických důvodů, jsou detektory na principu infračervených spekter (NDIRS). Třetí princip detektoru spočívá v optogalvanickém měření vlastností laserového paprsku (LARA). Další používaný typ detektoru je založen na tzv. molekulární 24, 25 korelační spektroskopii (MCS). 2.3.3. Sérologické testy Sérologické testy jsou po lékařské diagnóze prvním stupněm v klinické diagnostice celiakie. 9 Je známa celá řada sérologických markerů, které lze stanovit, nicméně jen některé jsou rutinně stanovovány v klinických laboratořích. Jedná se zejména o protilátky proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA, protilátky proti gliadinu IgA i IgG a protilátky proti endomysiu IgA. K dispozici je celá řada komerčních sad, které dávají srovnatelné výsledky z hlediska pozitivity nebo negativity, ale chybějící standardizace testů bohužel neumožňuje získání srovnatelných hodnot. 26 2.3.3.3. Protilátky proti tkáňové transglutaminase (attg) Stanovují se protilátky ve třídě IgA a IgG. Protilátky proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA jsou doporučovány pro případný screening na celiakii, neboť mají nejlepší poměr senzitivity a specificity. 27 Senzitivita IgA testů se pohybuje mezi 91-97% a specificita mezi 96-100%. 28 Tyto testy dávají lepší údaje než stanovení protilátek proti endomysiu a protilátek proti gliadinu ve třídě IgA. Stanovení má i výpovědní hodnotu i jako míra dodržování bezlepkové diety. 10

Všeobecně bývá stanovení protilátek ve třídě IgG mnohem méně senzitivní, ale má velký význam pro diagnostiku celiakie u IgA deficientních pacientů. Právě u těchto pacientů mají tyto protilátky senzitivitu 98,7% a specificitu 98.6%. 29 Rutinní laboratorní metody jsou založeny na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy (ELISA), většinou jsou k dispozici komerční sady pro analýzu na mikrotitračních destičkách, která umožňuje stanovení několika desítek pacientů najednou. 26 2.3.3.2. Protilátky proti gliadinu (AGA) Vzhledem k chybějící standardizaci souprav pro stanovení protilátek proti gliadinu ve třídách IgA a IgG se i výsledky jednotlivých souprav značně liší. Některé soupravy používají surový gliadin, jiné purifikovaný gliadin, většinou frakci α, a proto vzhledem použití různých antigenů nelze očekávat shodné výsledky. 30 Stanovují se protilátky ve třídách IgA a IgG. Senzitivita IgA se pohybuje v rozmezí 73-89%, a specificita 66-85%. IgG protilátky mají význam hlavně u nemocných s deficitem IgA, jejich senzitivita se pohybuje 78-92% a specificita 66-85%. 28 Metody, které používají jako antigen purifikovaný α-gliadin vykazují vyšší specificitu. V současné době tato vyšetření ustupují stanovení attg IgA a EMA, právě kvůli vyšší specificitě. Toto sérologické stanovení je prováděno metodou ELISA. 31 2.3.3.1 Protilátky proti endomysiu (EMA) myofybrilami. Endomysium je pojivový protein hladkého svalstva, nacházející se mezi Pro stanovení protilátek proti endomysiu se používá metoda nepřímé imunofluorescence, jako substrát se používá svalovina opičího jícnu nebo svalovina pupečníku. 26, 31 Vyhodnocení fluorescence v mikroskopu vyžaduje dlouhodobé zkušenosti. 24 Senzitivita se pohybuje mezi 83-95% a specificita dosahuje hodnot 94 100%. 28 Ve většině 11

rutinních laboratoří se stanovují protilátky pouze ve třídě IgA, ale pro testování IgA deficientních pacientů lze použít i stanovení EMA IgG. 29 2.3.3.4. Protilátky proti retikulinu (ARA) Retikulin je jedním z pojivových proteinů lymfatických tkání. Protilátky mohou být stanovovány ve třídách IgA a IgG a to metodou nepřímé fluorescence stejně jako u EMA. 32 V současné době se toto stanovení již neprovádí. 2.4 TKÁŇOVÁ TRANSGLUTAMINASA Transglutaminasy se nachází nejen ve tkáních, ale i v plazmě, a extracelulárních tekutinách. V současné době je známo několik lidských isoenzymů. 33 Tkáňová transglutaminasa (isoenzym transglutaminasa II) se nachází v extracelulárním prostoru, v cytoplazmě, ale i v jádře mnoha lidských buněk, včetně buněk cévní stěny, střevního epitelu a hladkého svalu. Katalyzuje posttranslační modifikace cytoplazmatických proteinů. Vzniklá kovalentní isopeptidová vazba je stabilní, rezistentní k proteolýze, čímž zvyšuje odolnost tkání k chemickým, enzymatickým a mechanickým poškozením. Úkolem tohoto enzymu jsou tedy posttranslační modifikace proteinů za účelem 33, 34 jejich stabilizace v různých fyziologických i patologických dějích. Ačkoli ještě nebylo in vivo prokázáno, že tkáňová transglutaminasa má schopnost modifikovat gluten, existují argumenty, které toto tvrzení podporují. Bylo už mnohokrát ověřeno, že T lymfocyty získané z tkání pacientů reagovaly pouze nebo mnohem lépe na peptidy, které byly modifikovány tímto enzymem. Také aktivita tohoto enzymu ve tkáních pacientů s celiakií byla vyšší, přítomnost enzymu byla prokázána v epiteliální i subepiteliální vrstvě tenkého střeva. 5 12

2.4.1. Enzymologie Tkáňová transglutaminasa (isoenzym transglutaminasa II) se v enzymovém katalogu nachází pod číslem EC 2.3.2.13, což ji řadí mezi transferasy přenášející aminoacylovou skupinu. Její systémový název je protein-glutamin:amin-γ-glutamyltransferasa. Tkáňová transglutaminasa je Ca 2+ dependentní enzym, katalyzující následující reakce. protein-glutamin + amin protein-n 5 -alkylglutamin + NH 3 Tímto dochází ke vzniku intra- i intermolekulárních vazeb mezi postranními řetězci glutaminu (akceptor) a lysinu (donor). protein-glutamin + H 2 O protein-glutamát + NH 3 Tato reakce probíhá s vyšší pravděpodobností při sníženém ph a při vysoké koncentraci glutaminů vzhledem ke koncentraci přítomných primárních aminů. (Obr. 3) 22 Z hlediska kinetiky působí tento enzym ping-pongovým mechanismem. (Schéma 3) 35 Schéma 3. Ping-pongový model reakce A + B P + Q 35 13

Obr. 3. Reakce katalyzované tkáňovou transglutaminasou. Enzym katalyzuje vznik intramolekulární vazby mezi postranním řetězcem glutaminu a primárním aminem např. primárním řetězcem lysinu a deaminaci postranního řetězce glutaminu za vzniku protein-glutamátu. Poměr deaminace ke vzniku intramolekulární vazby je tím vyšší, čím nižší je ph a čím vyšší je poměr glutaminových postranních řetězců k polyaminům. 22 V aktivním místě enzymu je naprosto zásadní cysteinový zbytek, který se přímo účastní reakce. Konkrétně lze reakční mechanismus rozepsat těmito rovnicemi. 14

aminem. V případě deaminace probíhá v druhém kroku reakce s H 2 O místo s primárním Enzym má širokou specificitu pro primární aminy (lysin nebo polyaminy), na druhou stranu jen některé proteiny obsahující glutamin se mohou zúčastnit této reakce. Tato schopnost závisí na okolí příslušného postranního řetězce glutaminu, a to jak z hlediska aminokyselinové sekvence, tak z hlediska prostorového uspořádání. 33 Klíčová je přítomnost prolinu ve vzdálenosti dvou aminokyselin směrem k C-terminálnímu konci nebo hydrofobní aminokyseliny jako např. fenylalanimu ve vzdálenosti tří aminokyselin směrem k C- terminálnímu konci. 5 Vzhledem k množství gliadinů obsažených v pšenici, kde jich bylo nalezeno více než 200, literatura většinou nerozlišuje vztahy tkáňové transglutaminasy k jednotlivým gliadinům. 2,36 V současnosti se výzkum zabývá identifikací epitopů, které je tento enzym schopen modifikovat a které následně stimulují T buňky. 6 2.4.2. Neenzymatická role tkáňové transglutaminasy při rozvoji celiakie Během zánětu T- lymfocyty migrují z krve do tkání nejprve pomocí speciálních receptorů zajištující adhezi k endoteliu. Ovšem následný proces migrace T lymfocytů skrz endotelium (TEM) je méně jasný. Byly vyrobeny monoklonální protilátky mab 6B9, které prokazatelně inhibují proces TEM, ale nijak neovlivňují proces adheze. Antigen byl nečekaně identifikován jako tkáňová transglutaminasa. Protilátka 6B9 selektivně inhibovala pouze CD8 + T lymfocyty, tedy tzv. cytotoxické T lymfocyty, jejichž počet mnohonásobně stoupá během zánětlivé reakce u celiakií. 27 Rozdíly mezi reakcí zdravých tkání a tkáněmi nemocných celiakií s protilátkou 6B9 nebyly pozorovány. Prozatím nebyla prokázána žádná vazba mezi enzymatickou aktivitou tkáňové transglutaminasy a výskytem povrchového proteinu této 15

transglutaminasy, jak byla detekována pomocí mab 6B9. V případě exprese tkáňové transglutaminasy na povrchu endoteliálních buněk tedy není enzymatická aktivita tohoto enzymu bezpodmínečně nutná pro jeho aktivitu biologickou. 34 Tento směr výzkumu se snaží objasnit novou biologickou roli pro tkáňovou transglutaminasu, která se zdá být v regulaci transepiteliální migrace, která má význam nejen u celiakie, ale i u mnoha jiných onemocnění. 34 2.5 ALTERNATIVA K BEZLEPKOVÉ DIETĚ? Bezlepková dieta je v současné době jediná účinná metoda, jak předcházet chronickému zánětu tenkého střeva, čímž se zároveň snižuje i riziko rozvoje gastrointestinálního lymfomu nebo karcinomu. 37 Bohužel, i tato dieta má své negativní stránky, jak ekonomické, tak i pacienti samotní jsou dietou omezováni, nehledě na to, že některé bezlepkové potraviny lze jen těžko označit za chutné. Jsou také pacienti, jejichž odpověď na bezlepkovou dietu není dostatečná nebo dostatečně rychlá. 38 Jedním z možných řešení je vyvinout pšenici, která bude obsahovat méně či vůbec žádný gliadin, popřípadě takový, který nebude vyvolávat imunitní odpověď. 5 Toxicita peptidu může být snížena bakteriálními endopeptidasami z Flavobacterium meningosepticum. Tato jejich aktivita byla prokázána in vitro a ex vivo a v současné době se zkoumá i možné použití enzymu in vivo jako doplněk bezlepkové diety. Tento enzym je dostatečně odolný, jak proti extrémnímu ph, tak i proti hydrolýze trávícími enzymy, což značně usnadňuje jeho případné použití u pacientů. 27 Další možností je inhibice aktivity tkáňové transglutaminasy. Bohužel tento enzym má rozličné biologické funkce, jak bylo uvedeno kapitole 2.4.2., a i lokální inhibice tohoto enzymu by mohla mít závažné následky. 38 16

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 MATERIÁLOVÉ A PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ 3.1.1 Chemikálie acetonitril (ACN) (Sigma-Aldrich) dihydrát citronanu trisodného (C 6 H 5 O 7 Na 3.2H 2 O) (Lachema) dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného (Na 2 HPO 4.H 2 O) (Lachema) dihydrogenfosforečnan draselný (KH 2 PO 4 ) (Lachema) ethanol (Kulich Hradec Králové) hydroxid sodný (NaOH) (Lachema) chlorid vápenatý (CaCl 2 ) (Sigma-Aldrich) kyselina chlorovodíková (HCl) (Lachema) kyselina synapová (Sigma-Aldrich) kyselina trifluoroctová (TFA) (Sigma-Aldrich) kyselina α-hydroxyskořicová (Sigma-Aldrich) monohydrát kyseliny citronové (C 6 H 8 O 7.H 2 O) (Fluka) tetraboritan disodný (Na 2 B 4 O 7.10H 2 O) (Lachema) TRIS (N-tris[hydroxymethyl]-methyl-2-aminoethansulfonová kyselina) (Lachema) 3.1.2 Přístroje a materiál Přístroje: Hybridní hmotnostní spektrometr Q-TOF Micro (Waters Micromass) spojený s 2D kapilární chromatografií 2D CapLC (Waters) MALDI TOF hmotnostní spektrometr, REFLEX IV, Bruker Daltonics Automatická promývačka pro mikrotitrační destičky, BIOTEC Instrument 17

ph metr Precisa ph 900 se skleněnou elektrodou Fotometr pro měření absorbance na mikrotitračních destičkách, SLT Labinstuments A-5082 Analytické váhy, Mettler H10T Multikanálová pipeta Program KIM pro vyhodnocení mikrotitračních destiček, verze 2.13 Materiál: purifikovaný α-, β-, γ-, ω-gliadin, lyofilizát α-gliadin po štěpení pomocí pepsinu, trypsinu a směsí pankreatických enzymů (PTP), lyofilizát Oba vzorky byly vyrobeny v rámci předcházejícího projektu v laboratoři. 39 3.1.3 Složení roztoků Pufry: C 6 H 8 O 7 -Na 2 HPO 4 0,01M ph 3,4 5,7ml 0,2M Na 2 HPO 4 14,3ml 0,1M C 6 H 8 O 7 doplnit objem na 400 ml C 6 H 8 O 7 -Na 2 HPO 4 0,01M ph 4,2 8,3ml 0,2M Na 2 HPO 4 11,7ml 0,1M C 6 H 8 O 7 doplnit objem na 400 ml Fosfátový pufr 0,01M ph 5,7 9,4ml 0,1M KH 2 PO 4 18

0,6ml 0,1M Na 2 HPO 4 doplnit objem na 100 ml Fosfátový pufr 0,01M ph 6,2 8,3ml 0,1M KH 2 PO 4 1,7ml 0,1M Na 2 HPO 4 doplnit objem na 100 ml Fosfátový pufr 0,01M ph 6,8 5,5ml 0,1M KH 2 PO 4 4,5ml 0,1M Na 2 HPO 4 doplnit objem na 100 ml TRIS-HCl 0,01M ph 7,4 1,9ml 0,1M TRIS 8,1ml 0,1M HCl doplnit objem na 100 ml TRIS-HCl 0,01M ph 8,2 6,9 ml 0,1M TRIS 4,1ml 0,1M HCl doplnit objem na 100 ml TRIS-HCl 0,01M ph 9,0 9,0ml 0,1M TRIS 1,0ml 0,1M HCl doplnit objem na 100 ml NaOH-Na 2 B 4 O 7 0,01M ph 10,5 5,0ml 0,1M NaOH 5,0ml 0,05M Na 2 B 4 O 7 19

doplnit objem na 100 ml NaOH-Na 2 B 4 O 7 0,01M ph 12,0 6,0ml 0,1M NaOH 4,0ml 0,05M Na 2 B 4 O 7 doplnit objem na 100 ml Roztoky: α- gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M ph 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml β- gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M ph 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml γ- gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M ph 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml ω-gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M ph 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml PTP rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M ph 7,4 1mg/ml; 0,8mg/ml, 0,6mg/ml, 0,4mg/ml, 0,2mg/ml, 0,02mg/ml 3.1.4 Pacienti Bylo vybráno 96 pacientů, jejichž séra byla rozdělena do tří kategorií dle aktivity protilátek proti tkáňové transglutaminase. Ta byla stanovena v rámci klinického stanovení na základě doporučení lékaře v Laboratoří gastroenterologie Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. První skupina obsahovala vzorky s hodnotami aktivity menšími než 10U/ml, tedy jednoznačně negativní vzorky, druhá jednoznačně pozitivní vzorky s aktivitou mezi 80 a 205U/ml a ve třetí skupině byly vzorky s hodnotou aktivity těsně nad hranicí cut off hodnoty, která je 10U/ml, tj. mezi 10 a 20U/ml. Stáří sér bylo v době měření maximálně dva roky od data odběru, byla skladována zmrazená na teplotu -20 C. 20

3.2 METODIKA MĚŘENÍ 3.2.1 Metoda ELISA (Dialab) Pro rutinní stanovení markerů celiakie se používají komerční sady firmy Dialab. Všechny jsou založeny na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy. Postup se shoduje pro všechny stanovované antigeny, tj. attg IgA, attg IgG, AGA IgA a AGA IgG. Veškerá stanovení jsou prováděna v duplikátu, tudíž na jedné desce lze stanovit 40 pacientů. Postup: 1. Všechny vzorky naředíme ředícím pufrem (10µl vzorku + 1000µl pufru) 2. Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetujeme 100µl kalibrátorů, kontrol a předředěných vzorků pacientů. 3. Inkubujeme 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Promyjeme 3x300µl promývacího roztoku. 5. Přidáme do všech jamek 100µl konjugátu. 6. Inkubujeme 15 minut při laboratorní teplotě. 7. Promyjeme 3x300µl promývacího roztoku. 8. Přidáme do všech jamek 100µl substrátu. 9. Inkubujeme 15 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 10. Ukončíme reakci přidáním 100µl Stop roztoku do každé jamky. 11. Necháme 5minut stát. 12. Do 30ti minut odečteme absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620nm. Zpracování a vyhodnocení výsledků bylo provedeno programem KIM verze 2.13. Výrobcem doporučované cut off hodnoty se liší v jednotlivých setech (Tab. II). 21

Tab. II. Cut off hodnoty sad Dialab Sada Doporučená hodnota cut off (U/ml) attg IgA 10 attg IgG 15 AGA IgA 12 AGA IgG 12 3.2.1.1 Modifikace metody, preinkubace s gliadinem a PTP Pro zkoumání interakcí mezi tkáňovou transglutaminasou a proteiny, popř. peptidy byl na začátek do metody ELISA zařazen další krok. Byla zkoumána i možnost preinkubace proteinů spolu se sérem, ale ta neměla žádný efekt na výsledné hodnoty absorbance. Preinkubace s α-, β-, γ-, ω-gliadinem : 1. Do jamky napipetujeme 100µl pufru TRIS-HCl 0,01M ph 7,4 a 10µl roztoku příslušného gliadinu (0; 0,1; 5,0mg/ml) a 5µl CaCl 2 (0; 0,5;50mM) 2. Necháme inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě. 3. Promyjeme3x300ml promývacího pufru na automatické promývačce. Preinkubace s PTP při měření závislosti absorbance na koncentraci proteinu: 1. Do jamky napipetujeme 100µl pufru TRIS-HCl 0,01M ph 7,4 a 10µl roztoku PTP příslušné koncentrace (0,02; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0mg/ml) 2. Necháme inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě. 3. Promyjeme3x300ml promývacího pufru na automatické promývačce. Preinkubace s PTP při měření závislosti absorbance na ph: 1. Do jamky napipetujeme 100µl pufru 0,01M o příslušném ph (3,4; 4,2; 5,7; 6,2; 6,8; 7,4; 8,2; 9,0; 10,5; 12,0) a 10µl roztoku PTP o koncentraci 1mg/ml. 2. Necháme inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě. 3. Promyjeme3x300ml promývacího pufru na automatické promývačce. 22

3.2.2 ImmunoDot (D-tec) Metoda ImmunoDot je stejně jako rutinní metoda založena na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy, v provedení na papírových proužcích. Konkrétně na těchto proužcích se stanovují dva antigeny, attg a AGA vždy ve stejné třídě. Na každém proužku je také pozitivní a negativní kontrola. Najednou lze stanovit maximálně 16 vzorků. Postup: 1. Do každé jamky napipetujeme 2 ml promývacího roztoku. 2. Proužky necháme 10 minut inkubovat za stálého kolébání. 3. Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem. 4. Do příslušné jamky přidáme 1,5 ml roztoku na ředění séra a 10µl séra. 5. Necháme inkubovat 30 minut za stálého kolébání. 6. Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem. 7. Promyjeme 3x3minuty 1,5ml promývacího roztoku. 8. Přidáme 1,5ml konjugátu do každé jamky. 9. Necháme inkubovat 30 minut za stálého kolébání. 10. Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem. 11. Promyjeme 3x3minuty 1,5ml promývacího roztoku. 12. Přidáme 1,5ml substrátu do každé jamky. 13. Necháme inkubovat 10 minut za stálého kolébání. 14. Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem. 15. Reakci zastavíme promytím po dobu 3 minut 1,5ml promývacího roztoku. 16. Papírové proužky vyndáme z jamek a necháme oschnout. Výsledné stanovení je kvalitativní při vizuálním vyhodnocení, popřípadě semikvantitativní při vyhodnocení počítačovým programem. Vizuálně vyhodnotíme, zda je 23

ploška reprezentující příslušný antigen více zbarvena, pak je vzorek označen za pozitivní, pokud je zbarvena méně nebo je stejné intenzity, vzorek je negativní. Počítačový program při vyhodnocení přiřadí optické hustotě negativní kontroly hodnotu 0 a optické hustotě pozitivní kontrole hodnotu 100. Na základě těchto hodnot je potom určena konkrétní hodnota stanovovaných plošek. Nemělo by dojít k vyššímu probarvení plošek, které odpovídají množství protilátek, než kontrolních plošek, i když ve výjimečném případě může tato situace nastat a to při tzv. hook efektu. Klinické vyhodnocení testu je pozitivní, je-li hodnota vyšší než 0. (Obr.4) Konkrétní číselná hodnota má význam pouze při opakovaném stanovení jako marker průběhu onemocnění. Obr. 4. Proužek na stanovení attg IgG a AGA IgG Další nespornou výhodou testů attg IgA a AGA IgA je princip pozitivní kontroly. Pokud se totiž pozitivní kontrola neprobarví, je pravděpodobným důvodem deficience IgA protilátek pacienta. Principiálně je test založen na stanovení příslušné třídy protilátek, jako antigen jsou použity kozí rekombinantní protilátky pro γ-globulinům IgA. 3.2.3 ELISA (D-tec) Pro srovnání byla některá stanovení provedena i jinou komerční sadou. Principiálně se jedná taktéž o metodu ELISA v provedení na mikrotitračních destičkách. Postup se shoduje pro oba stanovované antigeny, tj. attg IgA a attg IgG. Veškerá stanovení jsou prováděna v duplikátu. 24

Postup: 1. Všechny vzorky naředíme ředícím pufrem (10µl vzorku + 500µl pufru) 2. Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetujeme 100ml kalibrátorů, kontrol a předředěných vzorků pacientů. 3. Inkubujeme 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Promyjeme 3x200µl promývacího roztoku. 5. Přidáme do všech jamek 100µl konjugátu. 6. Inkubujeme 30 minut při laboratorní teplotě. 7. Promyjeme 3x200µl promývacího roztoku. 8. Přidáme do všech jamek 100µl substrátu. 9. Inkubujeme 10 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 10. Ukončíme reakci přidáním 100µl Stop roztoku do každé jamky. 11. Do 30ti minut odečteme absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620nm. Zpracování a vyhodnocení výsledků bylo provedeno programem KIM verze 2.13. Výrobcem doporučované cut off hodnoty se liší v jednotlivých setech (Tab. III). Tab. III. Cut off hodnoty sad D-tek Sada Doporučená hodnota cut off (U/ml) attg IgA 50 attg IgG 25 3.2.4 Výpočet diagnostické senzitivity, specificity a Cohenova κ Tab. IV. Příklad výpočtu senzitivity a specificity referenční testovaná metoda metoda negativní pozitivní negativní TN FP pozitivní FN TP 25

Specificita (SP) = TN/(TN+FN) Senzitivita (SN) = TP/(TP+FP) Pomocná hodnota Q = (TP+FN)*(TP+FP)+(FN+TN)*(FP+TN) Cohenovo κ = [(TP+TN)-Q]/(1-Q) κ = 0. Při úplném souhlasu testované metody s referenční je κ = 1, při úplném nesouhlasu je 3.2.5 Hmotnostní spektrometrie spojená s kapilární chromatografií Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou. Instrument: Hybridní hmotnostní spektrometr Q-TOF Micro (Waters Micromass) spojený s 2D kapilární chromatografií 2D CapLC (Waters) 1. použitý iontový zdroj: nanospray 2. první kolona Symetry300, C18, 5um OPTI-PAK 3. druhá kolona Atlantis dc18, 150 x 75um x 3um M.F. : 1. 90% ACN + 10% (0,1% TFA) 2. 2% ACN + 98% (0,1% TFA) Průtok na kolonu 4ul/min Průtok do zdroje 200nl/min Gradientový program 1Run 60minut Nástřik 1,5µl 26

Identifikace fragmentů: 1. analýza směsi tryptických štěpů v režimu MS (150-2000Da) 2. MS/MS fragmentace tryptických štěpů převážně z 2x nabitých iontů prekurzorů 3. de-novo sekvenování pomocí hmotnostního spektrometru 4. databazové vyhledávání BLAST search 3.2.6 MALDI TOF hmotnostní spektrometrie Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou. MALDI instrument: MALDI TOF hmotnostní spektrometr, REFLEX IV, Bruker Daltonics Použité matrice: α-kyselina hydroxyskořicová kyselina synapová 27

4. VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1 SROVNÁNÍ RUTINNÍ METODY ELISA A METODY IMMUNODOT Skupiny pacientů byly vybrány s ohledem na požadované výsledky. Hlavním bodem bylo zjištění, zdali lze stanovení získané oběma metodami považovat za ekvivalentní, tedy jestli informace pro lékaře (pozitivní nebo negativní) bude stejná. Červeně jsou v grafech označeny příslušné cut off hodnoty. Tabulka, obsahující veškeré použité hodnoty, je v příloze. (Tab. XIV) 4.1.1 Srovnání rutinní metody ELISA (Dialab) a metody ImmunoDot Srovnání bylo provedeno pro čtyři markery onemocnění, attg IgA, attg IgG, AGA IgA a AGA IgG. 4.1.1.1 Srovnání stanovení attg IgA Graf 1. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro attg IgA 100 90 80 70 ImmunoDot 60 50 40 > 10 U/ml 10-20 U/ml 80-205 U/ml 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 ELISA (U/ml) 28

Tab. V. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro attg IgA attg IgA ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 32 0 pozitivní 14 50 Celkově se tyto metody shodly ve 85,4% případů. (Tab. V) Na výsledném grafu (Graf 1) jsou dobře patrné všechny tři vybrané skupiny pacientů. Obě jednoznačně klasifikovatelné skupiny, jak vysoce pozitivní tak i negativní, se shodují ve výsledcích ve 100%. V případě třetí skupiny, tedy pacientů jejichž hodnoty attg IgA se pohybují těsně nad hranicí cut off (mezi 10 20 U/ml), došlo mezi oběma metodami k výrazným rozdílům. Z počtu 32 pacientů v této skupině bylo jako pozitivní označeno 18 pacientů, tj. v 56,3% případů. U zbylých 14 pacientů, tj. ve 43,7% případů, došlo k rozporu. Podstatné je, že ve všech limitních případech se výsledky těchto testů shodují, neboť výsledky pacientů nemocných celiakií bývají většinou velmi vysoké. 23 Diagnostická specificita metody ImmunoDot je vzhledem k rutinní metodě 100% a diagnostická senzitivita je 78,1%. Cohenovo κ je 0,70. 4.1.1.2 Srovnání stanovení attg IgG Při rutinním stanovení tohoto antigenu se celkově dosahuje mnohem nižších hodnot než u ostatních antigenů. Jak je patrné i z grafu (Graf 2), žádná z hodnot získaná rutinní metodou nebyla vyšší než 80U/ml. Naproti tomu při stanovení metodou ImmunoDot bylo 22 pacientů, kteří podle metody ELISA byly označeny negativně, určeno jako pozitivní. Opačná situace nastala pouze u jednoho pacienta. K shodě došlo celkem v 76% případů. (Tab. VI) Diagnostická specificita metody ImmunoDot je vzhledem k rutinní metodě 65,6% a diagnostická senzitivita je 96,9%. Cohenovo κ je 0,54. 29

Graf 2. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro attg IgG 100 90 80 70 ImmunoDot 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ELISA (U/ml) Tab. VI. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro attg IgG attg IgG ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 42 22 pozitivní 1 31 4.1.1.3 Srovnání stanovení AGA IgA a IgG Srovnání výsledků těchto dvou metod je z analytického hlediska nelogické, neboť každá z metod používá pro stanovení jiný antigen, v případě metody ELISA se jedná o purifikovaný α- gliadin v případě metody ImmunoDot se jedná o surový gliadin, tedy směs α-, β-, γ- a ω-gliadinů. Nicméně zde toto srovnání uvádím a to z toho důvodu, že v klinické laboratorní praxi nejsou tyto antigeny z hlediska diagnózy nijak rozlišovány. 30

Graf 3. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro AGA IgA 100 90 80 70 ImmunoDot 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 ELISA (U/ml) K celkové shodě došlo v případě AGA IgA v 79,2% a v případě AGA IgG v 80,2% stanovení. (Tab. VII, Tab. VIII) Tato čísla ovšem, navzdory očekávání nejsou nijak výrazně nízká vzhledem k procentům shody u metod attg IgA a attg IgG, a tak je zřejmé, že analytická chyba způsobená jiným antigenem nebude mít zásadní vliv na shodu obou stanovení. (Graf 3, Graf 4) Tab. VII. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro AGA IgA AGA IgA ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 56 2 pozitivní 18 20 31

Graf 4. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro AGA IgG 100 90 80 70 ImmunoDot 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 ELISA (U/ml) Tab. VIII. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro AGA IgG AGA IgG ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 44 3 pozitivní 16 33 V případě rozporů se ve většině případů jednalo o vzorky určené metodou ImmunoDot jako negativní, kdežto rutinní laboratorní metoda je stanovila jako pozitivní. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky AGA IgA je vzhledem k rutinní metodě 96,6% a diagnostická senzitivita je 52,6%. Cohenovo κ je 0,53. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky AGA IgG je vzhledem k rutinní metodě 93,6% a diagnostická senzitivita je 67,3%. Cohenovo κ je 0,61. Tyto výsledky podporuje tvrzení, že metody s purifikovaným gliadinem mají vyšší senzitivitu než metody používající směs gliadinů. 28 32

4.1.2 Srovnání vizuálního vyhodnocení metody ImmunoDot a jejího vyhodnocení počítačovým programem Vyhodnocení papírových proužků metody ImmunoDot bylo provedeno jak vizuálně, kdy byly proužky vyhodnoceny pouze kvalitativně, tedy jako negativní nebo pozitivní na příslušné antigeny, a také pomocí počítačového programu, který přiřadí optické hustotě negativní kontroly hodnotu 0 a optické hustotě pozitivní kontroly hodnotu 100, a na základě takto získaných hodnot je potom přiřazena i hodnota stanovovaným protilátkám. Celkem bylo vyhodnoceno 384 stanovení metodou ImmunoDot. Oba způsoby vyhodnocení se shodly v 91,5% případů. Naprostá většina rozporů se týkala situace, kdy byly protilátky vyhodnoceny vizuálně jako pozitivní a následné vyhodnocení počítačovým programem je označilo jako negativní (Obr. 5), opačný případ nastal pouze jeden. Semikvantitativní vyhodnocení má důležitou roli při monitorování průběhu nemoci, ale z analytického hlediska je vizuální vyhodnocení dostatečně spolehlivé. Lze se ho velmi rychle naučit, o čemž svědčí fakt, že po první polovině provedených stanovení došlo ke shodě mezi vizuálním a počítačovým vyhodnocením v 86,9% a v druhé polovině v 95,8% případů. Obr. 5. Příklad rozporu mezi vizuálním vyhodnocením a vyhodnocením počítačovým programem 33

4.1.3 Srovnání attg IgA s vyhodnocením proužku ImmunoDot IgA jako celku Účelem tohoto srovnání je zjistit, jaké výsledky bychom získali, kdybychom nahradili stanovení attg IgA rutinní ELISA metodou, které je doporučováno pro screening celiakie, výsledky získanými z proužků ImmunoDot IgA, které nám poskytují pouze semikvantitativní informaci, ale zato o dvou markerech, attg IgA a AGA IgA. U pacientů, jejichž výsledek byl podle rutinního stanovení attg IgA negativní, stejně jako podle stanovení toho markeru metodou ImmunoDot, byl pouze u jednoho pacienta zjištěn metodou ImmunoDot pozitivní výsledek na AGA IgA. U pacientů s vysokou hodnotou attg IgA, byly metodou ImmunoDot všichni pacienti označeny za pozitivní na attg IgA a 50% z nich bylo současně pozitivní i na AGA IgA. Dle předpokladů bylo nejzajímavější vyhodnocení skupiny pacientů, jejichž hodnoty byly těsně nad hranicí cut off hodnoty. Z 32 pacientů v této skupině bylo 14 pacientů pozitivních pouze na attg IgA, 1 pacient pozitivní pouze na AGA IgA a 4, kteří byli pozitivní na oba markery. U žádného pacienta nebyl metodou ImmunoDot zjištěn deficit IgA protilátek. Pokud posuzujeme výsledek stanovení metodou ImmunoDot jako pozitivní v případě, že je pozitivní alespoň jeden z markerů stanovovaným na proužku a tyto výsledky následně porovnáme s rutinní metodou, kterou považujeme za referenční, dostaneme hodnoty diagnostické specificity 96,9%, diagnostické senzitivity 79,7% a Cohenovo κ je 0,51. Srovnáním těchto statistických hodnot s hodnotami získanými porovnáním rutinní metody s metodou ImmunoDot tgtg IgA došlo ke snížení diagnostické specificity ze 100% na 96,9% a ke zvýšení senzitivity ze 78,1% na 79,7%. Lze tedy konstatovat, že zahrnutí stanovení AGA IgA nepřineslo žádné výrazné zlepšení diagnostických vlastností. 34

4.1.4 Srovnání metody ELISA D-tek a metody ImmunoDot D-tek Účelem tohoto stanovení bylo zjistit, jak dobře korelují hodnoty získané metodou ELISA a metodou ImmunoDot, pokud se v případě metody ELISA použije jiná komerční sada. Obě tyto metody pocházejí od stejného výrobce a pravděpodobně používají stejný antigen. Toto srovnání vychází z vyhodnocení 40 pacientů, kteří byli vybráni z původní skupiny. Do výběru byli zahrnuti pacienti s vysokou hodnotou attg IgA, a všichni pacienti, u kterých došlo k neshodě mezi stanovením rutinní metodou ELISA a metodou ImmunoDot. Graf 5. Korelační graf metod ELISA D-tec a ImmunoDot pro attg IgA 100 90 80 70 ImmunoDot 60 50 40 30 80-205 U/ml 10-20 U/ml < 10 U/ml 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 ELISA D-tec (U/ml) Tab. IX. Vyhodnocení metod ELISA D-tek a ImmunoDot pro attg IgA attg IgA ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 7 0 pozitivní 2 31 35

Graf 6. Korelační graf metod ELISA D-tec a ImmunoDot pro attg IgG 100 90 80 70 ImmunoDot 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 ELISA D-tec (U/ml) Tab. X. Vyhodnocení metod ELISA D-tek a ImmunoDot pro attg IgG attg IgG ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 4 2 pozitivní 1 31 Už na grafech (Graf 5, Graf 6) je jednoznačně vidět, že zde dochází k vyšší shodě než při srovnání metody ImmunoDot s rutinní metodou. Míra shody je vysoká pro stanovení protilátek obou tříd, pro IgA je 95% a pro IgG je 95,2%. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky attg IgA je vzhledem k rutinní metodě 100% a diagnostická senzitivita je 93,9%. Cohenovo κ je 0,84. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky AGA IgG je vzhledem k rutinní metodě 93,6% a diagnostická senzitivita je 67,3%. Cohenovo κ je 0,61. Tyto výsledky odpovídají předpokladu, že je používám stejný antigen. (Tab. IX, Tab. X) 36

4.1.5 Srovnání stanovení protilátek různými komerčními sety metodou ELISA Při vyhodnocení attg IgA došlo ke shodě ve 100% (Tab. XI, Graf 7) a tudíž i diagnostická specificita metody ELISA (D-tek) je vzhledem k rutinní metodě 100% a diagnostická senzitivita je 100%. Cohenovo κ je 1. Nicméně se dá předpokládat, že tyto ideální výsledky jsou způsobeny výběrem vzorků a pokud by bylo možné srovnat celé spektrum vzorků, jistě by se objevily případy, jejichž stanovení by bylo rozdílné. Graf 7. Korelační graf metod ELISA D-tec a ELISA Dialab pro attg IgA 300,00 250,00 ELISA Dialab U/ml 200,00 150,00 100,00 80-205 U/ml < 10 U/ml 10-20 U/ml 50,00 0,00 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 ELISA D-tec (U/ml) Tab. XI. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ELISA D-tek pro attg IgA ELISA ELISA D-tek Dialab negativní pozitivní negativní 7 0 pozitivní 0 33 37