BIOLOGICKÉ LISTY 68 (3): 183-189, 2003 Genetické mapování jako nástroj ke studiu evoluce pohlavních chromosomů rodu Silene VLADIMÍRA HYKELOVÁ Biofyzikální ústav AV ČR, Laboratoř vývojové genetiky rostlin, 612 65 Brno, (tel.: 541 517 203, e-mail: vladka.hykelova@angelfire.com) Úvod Determinace pohlaví je jednou z klíčových otázek vývojové biologie. Různé typy determinace pohlaví, od environmentálního po genetické, byly dopodrobna studovány u široké škály organismů. Stále však nejvíce pozornosti přitahují systémy genetické a to především ty založené na existenci pohlavních chromosomů. Nejlépe charakterizován je Y dominantní typ determinace pohlaví se dvěma chromosomy X přítomnými u samic a X a Y chromosomy u samců. Předpokládá se, že pohlavní chromosomy savců se vyvinuly postupnou diferenciací páru autosomů. Vzájemná diferenciace páru autosomů začala nejspíš hromaděním antagonistických genů zapojených do procesů sex determinace na jednom či druhém chromosomu, což mělo za následek ztrátu homologie a zástavu rekombinace v určité oblasti původně homologních chromosomů. Tato přechodná stádia ve vývoji pohlavních chromosomů se označují jako proto-x a proto-y chromosomy (Ellis 1998). Proces diferenciace byl způsoben i chromosomálními přestavbami - delecemi a inzercemi různých DNA sekvencí, inversemi a translokacemi částí proto-sex chromosomů (Lahn a Page 1999). Tento předpoklad je zřejmě platný i pro evoluci pohlavních chromosomů rostlin. Z analýz srovnávajících strukturu pohlavních chromosomů rostlin a živočichů vyplývá, že pohlavní chromosomy rostlin vznikly daleko později v průběhu evoluce a poskytují tedy jedinečnou příležitost studovat určité kroky vývoje pohlavních chromosomů, ke kterým u živočišných systémů již přístup nemáme. Model Silene latifolia Jedním z nejlépe prostudovaných rostlinných modelů z hlediska sex determinace je Y aktivní systém S. latifolia. Determinace pohlaví u S. latifolia přitahuje pozornost vědců už od začátku 20. století, ale teprve posledních 10 let je díky identifikaci molekulárních markerů možné realizovat analýzy pohlavních chromosomů. První aktivní geny lokalizované na rostlinném chromosomu Y byly identifikovány prohledáváním samčí cdna knihovny. Tímto způsobem bylo izolováno pět genů vázaných na Y chromosom (SlY1-5) (Delichere et al. 1999). Při podrobnějších analýzách bylo zjištěno, že tři z těchto pěti genů, SlX1, SlX3 a SlX4 mají své homology také na chromosomu X (Delichere et al. 1999; Atanassov et al. 2001). Další z genů, gen DD44, byl izolován metodou differential diplay. Jeho lokalizace na X a Y chromosomech S. latifolia byla prokázána fluorescenční in situ hybridizací (Moore et al. 2003). Identifikace molekulárních markerů na heteromorfních pohlavních chromosomech S. latifolia poskytla příležitost sledovat evoluci pohlavních chromosomů v rámci celého rodu Silene. Dosud nejlépe charakterizovanné geny 183
V. HYKELOVÁ mající své homology na chromosomu X - geny SlY1, 3, 4 a gen DD44, byly vybrány pro naši analýzu. Srovnávacím mapováním těchto markerových genů na pohlavních chromosomech dvoudomých rostlin (S. latifolia, S. dioica, S. diclinis) a na autosomech gynodioecických (S. noctiflora) a hermafroditních (S. conica) druhů, můžeme získat informace potřebné k zodpovězení nejčastěji kladených otázek souvisejících s evolucí pohlavních chromosomů. Který z páru autosomů stál na počátku vývoje pohlavních chromosomů? K jakým přestavbám (inzercím, delecím, translokacím, inversím) došlo v průběhu vývoje pohlavních chromosomů? Je původ pohlavních chromosomů v rámci rodu Silene monofyletický? Rod Silene je velmi vhodným modelem ke studiu evoluce pohlavních chromosomů, zvláště díky přítomnosti druhů s rozdílnými způsoby reprodukce. Předpokládá se, že pohlavní chromosomy dvoudomých druhů mají svůj původ v autosomech druhů hermafroditních. Za přechodné stadium mezi hermafroditismem a dioecií je považována gynodioecie (Westergaard 1958, Degreave 1980, Desfeux et al. 1996). Proto jsme pro naše analýzy vývoje pohlavních chromosomů rodu Silene vybrali těsně sousedící druhy se zmíněnými reprodukčními systémy - dvoudomé druhy (S. latifolia, S. dioica a S. diclinis) spolu s druhem gynodioecickým (S. noctiflora) a hermafroditním (S. conica). Fakt, že všechny druhy mají stejný počet chromosomů (2n=24) nám tyto analýzy do značné míry usnadňuje. Při výběru druhů jsme vycházeli z fylogenetického stromu rodu Silene sestaveného na základě ITS sekvencí rdna (sekvencí mezerníků v genech pro ribosomální DNA) (Desfeux 1996; Obr.1). Obecně je možné mapování genů na chromosomech provádět fyzikálně a geneticky. Pro sestrojení fyzikálních map se v naší laboratoři využívá metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Pro genetické mapování čtyř markerových genů na chromosomech vybraných druhů Silene jsme se rozhodli využít metody založené na stanovení frekvence rekombinace mezi geny. Fyzikální mapování markerových genů u Silene latifolia Výhodou FISH jako metody k mapování pohlavních chromosomů je možnost mapovat geny jak na X tak na Y chromosomu. SlY - geny, stejně jako gen DD44 jsou lokalizovány v nerekombinující oblasti Y chromosomu S latifolia, a proto metody založené na sledovaní frekvence rekombinace pro mapování Y chromosomu u tohoto druhu nemůžeme použít. Dalším přínosem této metody je vizualizace pozice markerových genů, možnost orientace mapy vzhledem k ramenům chromosomů a korekce výpočtů vzdáleností mezi jednotlivými geny, které mohou být genetickým mapováním zkresleny. Komplikovaná příprava vhodných sond pro FISH nám však dosud umožnila lokalizovat touto metodou pouze gen DD44 (Moore 2003; Lengerova et al. in press). Genetické mapování Genetické mapování je založeno na stanovení frekvence rekombinace mezi geny. Podstatou rekombinace je meiotický crossing-over, probíhající mezi homologními oblastmi chromosomů. Z tohoto faktu vyplývá, že geneticky je možné mapovat pouze geny lokalizované na autosomech, X chromosomech a geny lokalizované v pseudoautosomální oblasti Y chromosomu. 184
GENETICKÉ MAPOVÁNÍ JAKO NÁSTROJ KE STUDIU EVOLUCE POHLAVNÍCH CHROMOSOMŮ Obr. 1. Fylogenetický strom rodu Silene sestavený na základě ITS sekvencí rdna 22 druhů Silene (podle Desfeux et al. 1996). Na první pohled je z fylogenetického stromu zřejmé, že v rámci 22 vybraných druhů Silene je gynodioecie nejrozšířenější reprodukční strategíí. Kromě druhů gynodioecických zde pozorujeme existenci dvou vzdálených skupin dvoudomých druhů (skupina A a B), které sousedí vždy s jedním druhem hermafroditním (S. galica resp. S. conica). V naší studii vývoje pohlavních chromosomů jsme se zaměřili na skupinu B dvoudomých druhů S. latifolia, S. dioica, S. diclinis, hermafroditní druh - S. conica, a gynodioecický druh - S. noctiflora Obecně platí, že pravděpodobnost crossing-over mezi geny je mírou vzdálenosti mezi geny na chromosomech. Vzdálenosti mezi geny jsou na genetické mapě vyjadřovány pomocí mapových jednotek, přičemž jedna mapová jednotka, označovaná jako centimorgan, odpovídá jednomu procentu rekombinace. V případě, že jsou geny od sebe dostatečně vzdálené, může mezi nimi dojít ke dvěma i více crossing-over. Pokud druhý crossing-over vrací geny na chromosomech zpět do výchozí pozice, stávají se oba crossing-over nedetegovatelnými. Na výsledné genetické mapě se tato skutečnost projeví zmenšením vzdálenosti mezi geny oproti vzdálenosti reálné. Naopak existence oblastí chromosomů, označovaných jako horká místa rekombinace (hot spots), ve kterých detegujeme výrazně více crossing-over než v oblastech jiných, mapovou vzdálenost mezi geny oproti reálné vzdálenosti zvětšují. Vzdálenost mezi geny stanovená na základě frekvence rekombinace je tedy označována za vzdálenost relativní. 185
V. HYKELOVÁ Genetické mapování genů SlX1, SlX3, SlX4 a DD44 na chromosomech druhů Silene Pro srovnávací mapování čtyř vybraných markerových genů, SlX1,3,4 a genu DD44 na X chromosomech S. latifolia a chromosomech S. dioica, S. diclinis, S noctiflora a S. conica jsme zvolili výše popsanou metodu založenou na stanovení frekvence rekombinace mezi geny. Před vlastní analýzou bylo nejprve nutné rozlišit dvě alely každého mapovaného genu u všech vybraných druhů tak, aby bylo možné sledovat průběh crossing-over. Mapovací populace byly připraveny křížením samičí rostliny heterozygotní pro všechny čtyři markerové geny se samčí rostlinou s náhodnou, avšak známou kombinací alel v těchto genech. U každého jedince z potomstva tohoto křížení byla sledována kombinace alel ve všech čtyřech lokusech, stanovena frekvence rekombinace mezi geny, vypočítány relativní vzdálenosti a sestaveny genetické mapy. Hledání sekvenčních rozdílů mezi alelami markerových genů V případě S. latifolia, kde již byla metodou Southernovy hybridizace ověřena lokalizace všech markerových genů na chromosomu X, jsme hledali sekvenční rozdíly mezi dvěma alelami genů lokalizovanými na X chromosomech pomocí PCR metody s využitím X-specifických primerů. V případě genu SlX4 se nám podařilo rozlišit jeho dvě alely pouze touto PCR reakcí, na základě rozdílné velikosti produktů amplifikace. U genů SlX1, SlX3 a DD44 byly specifické PCR produkty sekvenovány a teprve na základě těchto sekvencí jsme určili rozdíly mezi alelami. Sekvence alel se lišily v místech, která se shodovala s rozpoznávacími místy pro restrikční enzymy. Alely jsme proto detegovali restrikční analýzou. U S. dioica, S. diclinis, S. noctiflora a S. conica, u kterých neznáme přesné sekvence markerových genů, nemáme k dispozici ani X-specifické primery. Vycházeli jsme proto z primerů navržených pro S. latifolia. U S. dioica bylo možné alely genů SlX i genu DD44 odlišit stejně jako u S. latifolia sekvenací PCR produktu a restrikční analýzou. U ostatních jmenovaných druhů však musíme nejprve metodou RACE PCR (rapid amplified cdna ends) na samičí cdna amplifikovat 3 konce mapovaných genů, které jsou obecně považovány za nejvíce polymorfní místa, produkty reakce klonovat do vektoru pgemt-easy a sekvenovat. Získané sekvence jsme srovnávali a hledali rozdíly mezi alelami. V mapovaných populacích rostlin jsme alely opět detegovali restrikční analýzou. Genetické mapování markerových genů na chromosmu X Silene latifolia Poté co byly nalezeny vždy dvě alely všech markerových genů a křížením připravena populace potomstva, bylo provedeno vlastní mapování. Pomocí PCR (pro gen SlX4) a restrikční analýzy PCR produktů (pro geny SlX1, SlX3 a DD44) byly stanoveny genotypy jednotlivých rostlin mapovaného potomstva. Samičí genotypy mohly být přímo použity pro výpočet frekvencí rekombinace, zatímco samčí genotypy, které jsou v důsledku přítomnosti pouze jednoho X chromosomu v hemizygotním stavu, je nutné pomocí zpětného křížení převést do stavu dvou chromosomů X. Takto upravená data byla vložena do programu JoinMap verze 1.4., který pak určil procento rekombinace mezi každým možným párem analyzovaných genů, stanovil pořadí mapovaných genů a vypočítal relativní 186
GENETICKÉ MAPOVÁNÍ JAKO NÁSTROJ KE STUDIU EVOLUCE POHLAVNÍCH CHROMOSOMŮ vzdálenosti mezi mapovanými geny. Tento program na základě rekombinačních frekvencí geny rozdělí do vazebných skupin a v případě, že jde pouze o jednu vazebnou skupinu, hodnoty procent rekombinace převede na mapovou vzdálenost. Pro výpočet vzdáleností mezi geny používá dvou mapovacích funkcí, Haldanovy a Kossambiho. Funkce se od sebe odlišují způsobem přepočtu mapových vzdáleností na relativní vzdálenost mezi geny. Haldanova funkce na rozdíl od funkce Kossambiho předpokládá absenci interference mezi crossing-over během meiosy. Pro většinu vyšších organismů je Kossambiho funkce, uvažující určitý stupeň interference, obecně považována za přesnější. Programem Join- Map 1.4. je zároveň výpočtem standardních odchylek ověřena statistická významnost výsledků. Genetické mapování markerových genů na chromosomech dalších dvoudomých druhů, S. dioica a S. diclinis Analýzy markerových genů u dvoudomých druhů, S. dioica a S. diclinis, komplikuje fakt, že nevíme, zda jsou lokalizovány na pohlavních chromosomech nebo na autosomech. Proto je nutné po nalezení alel pro každý markerový gen provést segregační analýzu. Segregačními analýzami zjistíme zda geny segregují jako geny vázané na chromosom X (obr. 2) nebo jako geny vázané na autosomy (obr. 3). Jako reprezentativní vzorek mapované populace analyzujeme mateřskou rostlinu, otcovskou rostlinu a 10 potomků křížení, z toho 5 potomků samčího a 5 samičího pohlaví. Na základě segregačních analýz jsme zjistili, že markerové geny segregují v populacích těchto dvou druhů jako geny vázané na pohlavní chromosomy, analýzy jsme proto prováděli stejným způsobem jako u S. latifolia. P F1 Obr. 2. Segregační analýza genů lokalizovaných na X chromosom. Sekvenční rozdíl mezi alelami genu je v tomto případě detegován metodou PCR a gelovou elektroforézou na základě rozdílné velikosti PCR produktů. V potomstvu samčích rostlin, vzniklých křížením heterozygotní samičí rostliny se samčí rostlinou nesoucí alelu a, nacházíme vždy jen jednu alelu, A nebo a, nesenou jediným chromosomem X. V potomstvu samičích rostlin jsou vždy alely dvě, od otce dostávající alelu a, od matky A nebo a. Samičí potomstvo je tedy buď heterozygotní (Aa) nebo homozygotní (aa) pro alelu nesenou samčím rodičem. 187
V. HYKELOVÁ P F1 Obr. 3. Segregační analýza genů vázaných na autosomy. Sekvenční rozdíl mezi alelami genu je v tomto případě detegován metodou PCR a následně restrikční analýzou produktů. V samčím potomstvu nacházíme též heterozygotní konstituce alel (Aa), což není v případe lokalizace genu na X chromosomu možné, kvůli přítomnosti pouze jediného X chromosomu. Genetické mapování markerových genů na autosomech gynodioecické S. noctiflora a hermafroditní S. conica Mapování genů na autosomech S. noctiflora a S. conica se od mapování na X chromosomu S. latifolia liší přípravou mapovacích populací, tedy křížením rodičovské generace. U S. noctiflora připravujeme mapovací populace rostlin opylením samičí (mateřské) rostliny pylem rostliny hermafroditní (otcovské). V případě hermafroditní S. conica, kvůli zajištění dostatečného stupně polymorfismu, nevycházíme z populací vzniklých samosprášením, ale kastrací tyčinek hermafroditního jedince připravíme mateřskou rodičovskou rostlinu a opylíme ji pylem jiné rostliny. Pro kontrolu, zda analyzovaní jedinci vznikli skutečně cizosprášením, jsme k mapovaným genům přidali ještě jednu kontrolní markerovou sekvenci. Každá z rodičovských rostlin bude homozygotní pro jednu ze dvou alel tohoto markeru. Potomstvo křížení takových rodičů, a tedy potomstvo vhodné pro mapovaní markerových genů, musí být v tomto kontrolním markeru heterozygotní. Sekvenční rozdíly mezi alelami u těchto dvou druhů hledáme pomocí RACE PCR, tak jak již bylo popsáno v předcházejícím paragrafu, a genotypy jednotlivých rostlin potomstva stanovujeme restrikční analýzou. Výhodou mapování genů na autosomech oproti mapování genů X chromosomu je, že odpadá problém hemizygotního stavu X chromosomu u samčích rostlin dvoudomých druhů. Genotypy samičího i hermafroditního potomstva mohou být přímo analyzovány programem JoinMap verze 1.4. Stanovení frekvence rekombinace a výpočet vzdáleností mezi geny se u těchto dvou druhů od genetického mapování S. latifolia, S. dioica a S. diclinis neliší. Analýza genetických map Posledním krokem analýz je srovnání získaných genetických map S. latifolia, S. dioica, S. diclinis, S. noctiflora a S. conica. Srovnáváme vzájemné pozice markerových genů a vzdálenosti mezi těmito geny u jednotlivých druhů. Na základě vzdáleností mezi geny můžeme usuzovat na případné inzerce nebo delece v oblastech mezi jednotlivými geny a na základě vzájemných pozic genů odvodíme k jakým přestavbám, inversím či 188
BIOLOGICKÉ LISTY 68 (3): 189-192, 2003 translokacím mohlo v průběhu evoluce pohlavních chromosomů dojít. Stanovením počtu vazebných skupin u druhů hermafroditních pak můžeme definovat, zda na počátku vývoje pohlavních chromosomů stál jeden nebo více párů autosomů. Procesy sex determinace u rostlin, nebyly dosud přesně prozkoumány. Analýzami pohlavních chromosomů dvoudomých rostlin a autosomů rostlin gynodioecických a hermafroditních jsme schopni sledovat mechanismy, kterými vývoj probíhal v rámci tohoto rodu. Fylogenetické analýzy sekvencí SlX a SlY genů probíhající paralelně s mapováním jejich pozice na chromosomech, poskytnou další informace potřebné ke stanovení doby, kdy došlo ke ztrátě rekombinace mezi geny a tedy k diferenciaci X a Y chromosomu. Spojením těchto dvou studií vzniká komplexní analýza evoluce pohlavních chromosomů rodu Silene, která může ověřit, zda obecné hypotézy vypracované pro savčí systémy platí také u rostlin. Literatura Atanassov, I., Delichere, C., Filatov, D.A., Charlesworth, D., Negrutiu, I., Moneger, F. 2001. - Mol. Biol. Evol. 18: 2162. Degraeve, N. 1980. - Bol. Soc. Brot. Ser. 53: 595. Delichere, C., Veukens, J., Hernould, M., Barbacar, N., Mouras, A., Negrutiu, I., Moneger, F. 1999. - EMBO J. 18: 4169. Desfeux, C., Maurice, S., Henry, J.P., Lejeune, B., Gouyon, P.H. 1996. - Proc. R. Soc. Lond. B 263: 409. Poděkování. Tato práce byla podporována GA ČR (grant 204/02/0417). Ellis, N.A. 1998. - Nat. Genet. 20: 9. Lahn, B.T., Page, D.C. 1999. - Science 286: 964. Lengerova, M., Moore R.C., Grant, S.R., Vyskot, B. - Genetics - in press. Moore, R.C., Kozyreva, O., Lebel-Hardenac, S., Siroky, J., Hobza, R., Vyskot, B., Grant, S.R. 2003. - Genetics, 163: 321. Westergaard, M. 1958.-Adv. Genet.,9: 217-281. Strukturní vlastnosti DNA studované pomocí cirkulárního dichroismu IVA KEJNOVSKÁ Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno, (tel.: 541 517 123, e-mail: kejnovska@ibp.cz) Cirkulárně dichroická (CD) spektroskopie Cirkulární dichroismus DNA vyplývá z asymetrického vrstvení nukleotidů do šroubovicového uspořádání. Proto je CD spektroskopie citlivá ke změnám ve vzájemné orientaci bází v DNA, a proto je vhodná ke studiu konformačních změn dvojité šroubovice (Johnson et al. 1981). Nukleové kyseliny se stejně jako řada jiných biologicky aktivních látek vyznačují chiralitou, která je způsobena přítomností asymetrických prvků v těchto molekulách. Makromolekuly mohou být chirální, i když jejich nízkomolekulární složky tuto 189