Systém pro kvantitativní multiplex amplifikaci DNA PLEXAMP KIT PXT5 Detekce genomové přestavby genu BRCA2 NÁVOD K POUŽITÍ REFERENCE: PXT5-01.01.25: 25 testů PXT5-01.01.50: 50 testů PXT5-01.01.100: 100 testů SKLADOVÁNÍ: - 20 C POUZE PRO VÝZKUMNÉ ÚČELY NEPOUŽÍVEJTE PRO DIAGNOSTICKÉ PROCEDURY N_PXT5 V1
OBSAH 1) Multiplex PCR...3 2) Princip...3 a) PLEXAMP : Kvantitativní multiplex amplifikace fragmentů genomu pomocí PCR... 3 b) Amplikony... 4 3) Komponenty PLEXAMP Kit...4 4) Umístění PCR cílových sekvencí...4 5) Vlastnosti PCR cílových sekvencí...5 6) Varování a doporučení...6 7) Skladování... Chyba! Záložka není definována. 8) Nedodávané vybavení, mikrozkumavky a reagencia, potřebné pro testování...6 a) Základní vybavení... Chyba! Záložka není definována. b) Mikrozkumavky... 7 c) Reagencia... 7 9) Příprava genomové DNA... Chyba! Záložka není definována. a) Kvalita genomové DNA... 7 b) Kvantita genomové DNA... 7 10) Procedura PLEXAMP...8 a) PLEXAMP amplifikační reakce... 8 i) Vyberte referenční genomovou DNA... 8 ii) Připravte reakční směs... 8 iii) Spusťte PCR... 8 b) Elektroforéza... 8 i) Parametry elektroforézy... Chyba! Záložka není definována. ii) Kapilární elektroforéza: ABI 310, 31xx, 37xx skupinový instrument... 8 c) PLEXAMP Analýza... 9 i) Quantipeak... 9 ii) GeneMapper... 9 iii) Nejčastější problémy... Chyba! Záložka není definována. 2 N_PXT5 V1
1) Multiplex PCR Simultánní amplifikace několika amplikonů v jedné PCR byla poprvé použita pro detekci delecí a duplikací genu pro dystrophin (Abbs and Bobrow, 1992) 1. Simultánní amplifikace dvou nebo více úseků dovoluje přímé srovnání relativního množství PCR produktů získaných z dvou genomových DNA za předpokladu, že 1/ u každého amplikonu je amplifikace ve své exponenciální fázi a 2/ amplifikační produkty mohou být zobrazeny. K zlepšení sensitivity detekce amplifikačních produktů bylo použito fluorescenční značení (Mansfield et al, 1993) 2. Nová multiplex PCR metoda, nazvaná fluorescenční multiplex PCR krátkých genomových sekvencí, byla vynalezena Charbonnierem a kol. v roce 2000 ve snaze učinit nová vylepšení 3. Tato metoda je založena na simultánní amplifikaci krátkých úseků DNA pro lepší homogenizaci amplifikace různých amplikonů. Amplifikační produkty jsou analyzovány kapilární elektroforézou, která umožňuje překrytí PCR profilů a srovnání fluorescence získané pro každý amplikon ze dvou vzorků DNA. Tato metoda umožňuje detekci genomových heterozygotních alterací, ale množství simultánně amplifikovaných amplikonů je limitováno. Nyní PrestaGen představuje originální multiplex PCR metodu nazvanou PLEXAMP (MultiPLEX AMPlification PCR System). Tato vlastní metoda je založena na speciálním a optimalizovaném návrhu PCR primerů, reakčním pufru a podmínkách PCR umožňujících vysoký počet simultánních amplifikací a kvantitativní analýzu každého amplikonu. Oproti jiným podobným metodám, PLEXAMP je jednokroková metoda, která může být použita jako jednorázový test nebo high-throughput metoda. 2) Princip a) PLEXAMP : Kvantitativní multiplex amplifikace fragmentů genomu pomocí PCR Tato technologie je založena na: 1. Multiplex amplifikaci jednotlivých genomových sekvencí (amplikonů) především z exonových oblastí cílových sekvencí. 2. Kontrole kinetiky procesu PCR amplifikace umožňující kvantitativní analýzu. 3. Použití fluorescenčních primerů umožňujících analýzu fragmentů pomocí většiny genetických analytických systémů. 4. Jednokrokové proceduře. 5. Kvantitativní analýzu srovnáním profilu pacientovy genomové DNA s profilem referenční genomové DNA po normalizaci pomocí kontrolních amplikonů. 1 Abbs, S. and Bobrow, M. Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophin gene. J Med Genet. 1992; 29(3):191-6. 2 Mansfield, E. S.; Robertson, J. M.; Lebo, R. V.; Lucero, M. Y.; Mayrand, P. E.; Rappaport, E.; Parrella, T.; Sartore, M.; Surrey, S., and Fortina, P. Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategies. Am J Med Genet. 1993; 48(4):200-8. 3 Charbonnier F, Raux G, Wang Q, Drouot N, Cordier F, Limacher JM, et al. Detection of exon deletions and duplications of the mismatch repair genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer families using multiplex polymerase chain reaction of short fluorescent fragments. Cancer Res 2000; 60: 2760-3. 3 N_PXT5 V1
b) Amplikony Každý jednotlivý genomový segment může být použit jako amplikon pro technologii PLEXAMP. Výběr amplikonů se řidí podle následujících pravidel: 1. Cílové úseky amplikonů by měly být genomově jedinečné. 2. Primerové sekvence by neměly obsahovat známé SNP (Single Nucleotide Polymorphism). 3. Amplikony jsou přednostně vybírány z exonových oblastí. Každý kit obsahuje nejméně dva kontrolní amplikony lokalizované v genomových oblastech, které neobsahují žádné repetitivní sekvence. Tyto amplikony slouží jako kontrola a ke kalibraci, což umožní normalizaci pacientovy a referenční DNA. 3) Komponenty PLEXAMP Kit Každý PLEXAMP Kit obsahuje dostatek reagencií pro provedení 25, 50 nebo 100 testů. Zkumavka Reagens Objem Množství A Červený uzávěr B Žlutý uzávěr C Modrý uzávěr 4X PLEXAMP PCR MASTERMIX obsahující PCR reakční pufr a Taq-polymerasu (ref# PXT-01.01.25-A) 4X PLEXAMP PCR PRIMERMIX* (ref# PXT5-01.01.25-B) H 2O PCR grade (ref# PXT-01.01.50-C) 135 µl 1 (25 testů) 2 (50 testů) 4 (100 testů) 135 µl 1 (25 testů) 2 (50 testů) 4 (100 testů) 500 µl 1 (25 nebo 50 testů) 2 (100 testů) * PCR primery jsou značené fluorescenčním barvivem 6-FAM TM. 4) Umístění PCR cílových sekvencí Každá další cílová sekvence je umístěna v každém exonu kromě exonu 11, kde se nachází 3 cílové sekvence, exony 5 a 6 jsou amplifikovány ve stejném amplikonu a exony 23 a 24 jsou amplifikovány ve stejném amplikonu. 4 N_PXT5 V1
CTRL geny : CTRL A, B, C a D jsou umístěny v různých genomových oblastech, ve kterých dosud nebyly detekovány žádné repetitivní sekvence. 5) Vlastnosti PCR cílových sekvencí 5 N_PXT5 V1
PLEXAMP BRCA2 PCR profil referenční DNA Každý peak odpovídá jednomu amplikonu. Peaky se objevují podle zvyšující se velikosti od 92 bp (první vlevo) do 395 bp (poslední vpravo): viz tabulka nahoře. 6) Varování a doporučení Tento kit je určen pouze pro výzkumné účely a nikoli pro diagnostické nebo terapeutické účely. Nepoužívejte kit po uplynutí data expirace. Nemíchejte dohromady reagencia z různých šarží a/nebo s různými osvědčeními. Používejte stejnou šarži u pacientovy i referenční DNA. S vzorky a reagencii byste měli zacházet v rukavicích. Používejte pouze špičky s filtry. Rozmrazujte pouze nezbytná reagencia. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování a zmrazování. Vždy dodržujte podmínky k skladování a níže uvedenou testovací proceduru. 7) Skladování Kit by měl být skladován při 20 C. 8) Nedodávané vybavení, mikrozkumavky a reagencia, potřebné pro testování a) Základní vybavení PCR thermocycler s 0.2 ml platem (rychlost teplotních skoků 2 C/sec) Vyhřívané víko by mělo vyvíjet dostatečný tlak na vršek PCR zkumavek, aby umožnil dokonalý kontakt mezi zkumavkami a topným tělesem. Systém kapilární elektroforézy 6 N_PXT5 V1
Tento systém byl validován na ABI3130 36 cm délka kapiláry, POP7 polymer se softwarem Genemapper4.0 Čisté a spolehlivě přesné mikropipety b) Mikrozkumavky 0.2 ml PCR zkumavky prosté nukleových kyselin a nukleáz c) Reagencia Deionizovaný formamid (doporučen ABI 4311320) Fluorescenční standard velikosti DNA kompatibilní s PCR produkty značenými 6-FAM. Doporučujeme použití : Size standard dye Filter set ABI product ABI product Nr ROX D GeneScan 400 HD ROX * 402985 9) Příprava genomové DNA Kvalita genomové DNA je nezbytná pro získávání homogenní amplifikační kinetiky u všech amplikonů. Pro získání spolehlivých kvantitativních výsledků by měla být pro extrakci pacientovy DNA a referenční DNA použita stejná metoda. a) Kvalita genomové DNA DNA extrakce metodou VYSOLOVÁNÍ interferuje s podmínkami PCR a proto byste se jí měli VYHNOUT. Genomová DNA extrahovaná s použitím magnetických kuliček by se měla používat s opatrností: přítomnost magnetických kuliček v eluované genomové DNA může interferovat s chemií multiplex PCR. Nejlepší výsledky jsou získány použitím genomové DNA extrahované pomocí kitů založených na DNA resin afinitě nebo DNA filtrech (Protokol optimální extrakce DNA je k dispozici na vyžádání, kontaktujte prosím techserv@prestagen.com). OD 260/280 se optimálně pohybuje od 1,8 do 2,0. b) Kvantita genomové DNA Koncentrace genomové DNA musí být stanovena přesně: optimálně se pohybuje mezi 20 a 50 ng/µl. Doporučuje se použití kalibrovaného UV spektrofotometru. 7 N_PXT5 V1
10) Procedura PLEXAMP a) PLEXAMP amplifikační reakce i) Vyberte genomovou referenční DNA Genomová referenční DNA by měla být extrahována stejným postupem jako genomová DNA pacienta. Referenční genomová DNA by měla být prostá jakýchkoli známých alterací úseků cílových sekvencí. ii) Připravte reakční směs Rozmrazte nezbytná reagencia. Krátce odstřeďte každou zkumavku, aby se celý obsah usadil na dně. Před použitím dobře promíchejte každé reagencium na vortexu (5 vteřin při nejvyšší rychlosti). Připravte nezbytné množství PCR zkumavek pro testované i pro referenční DNA. Do každé 0,2ml PCR zkumavky přidejte: - 4X PLEXAMP PCR MASTERMIX (Zkumavka A Červený uzávěr): 5 µl - 4X PLEXAMP PRIMERMIX (Zkumavka B Žlutý uzávěr): 5 µl - pacientova DNA nebo referenční DNA: 25 ng - H2O pro PCR (Zkumavka C Modrý uzávěr): do 20 µl Krátce odstřeďte a promíchejte na vortexu PCR zkumavky. iii) Spusťte PCR Nastavte thermocycler na rychlost změny teploty 2 C/sec mezi každým krokem: Krok Čas Teplota Počáteční denaturace 10 min 96 C Denaturace 20 sec 96 C 26 CYKLŮ Nasednutí primeru 60 sec 61 C* b) Elektroforéza Extenze 120 sec 72 C Konečná extenze 5 min 72 C Inkubace 4 C * Teplota pro nasednutí primeru se může u každého kitu lišit Podmínky PCR jsou kritické a měly by být přesně dodržovány. i) Parametry elektroforézy Nastavení elektroforetických parametrů viz doporučení dodavatele. ii) Kapilární elektroforéza: ABI 310, 31xx, 37xx skupinový instrument Připravte plnicí roztok do injekční destičky. Do každé jamky: - PLEXAMP PCR produkt značený fluoresc. barvivem 6-FAM 2.0 µl - Fluorescenční standard velikosti DNA 0.3 µl - Deionizovaný formamid 15.0 µl 8 N_PXT5 V1
Inkubujte 3 min při 95 C a 1 min při 4 C. CELKEM (na jamku): 17.3 µl Nastavte Applied následně: parametry Biosystems Systém byl vytvořen na ABI3130 (Délka kapiláry 36 cm; Typ polymeru POP7). c) PLEXAMP Analýza i) Quantipeak Nástroj pro online software analýzu je k dispozici na http://www.prestagen.com/ (Tab «QuantiPeak»). Tento nástroj umožňuje rychlou a jednoduchou analýzu dat ze souborů vytvořených sekvennátorem (.fsa). Specializovaný návod k použití je k dispozici na webových stránkách. ii) GeneMapper Analýza dat může být provedena pomocí softwaru GeneMapper v4.0 podle uživatelské poznámky Applied Biosystems: Detekce významných delecí nebo duplikací genomové DNA pomocí kvantitativní multiplex PCR a Applied Biosystems systému kapilární elektroforézy. Uživatelský návod může být stažen zde: http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00115216.pdf. Plot analýza PCR multiplex profilů: odkaz na sekci Reviewing plots in GeneMapper Software (viz plot uvedený níže). Početní analýza PCR multiplex: odkaz na sekci Automated analysis. Prosím kontaktujte techserv@prestagen.com pro soubory Bin Set, Analysis Methods a Report Settings vhodné pro automatickou analýzu PLEXAMP profilů softwarem GeneMapper. 9 N_PXT5 V1
Peak Ratio Interpretace Výška = 100±20% 0.8-1.2 Normal 30-70% snížení výšky několika amplikonů 0.3-0.7 Heterozygotní delece 30-70% zvýšení výšky několika 1.3-1.7 amplikonů Duplikace Ratio mezi 0.3 a 0.7 pouze u jednoho amplikonu : viz Nejčastější problémy. Ratia < 0.3, obě alely mohou být variantní. Ratia mezi 0.7 a 0.8 nebo mezi 1.2 a 1.3: - Možná vysvětlení: Různá množství pacientovy DNA a referenční DNA. Různá kvalita pacientovy DNA a referenční DNA. Pacientova DNA a referenční DNA byly extrahovány různými metodami. - Zkontrolujte: Množství DNA pacientovy DNA a referenční DNA. Kvalitu DNA (OD 260/280 mezi 1.8 a 2.0). Metody extrakce DNA. - Pro více informací prosím kontaktujte techserv@prestagen.com. iii) Nejčastější problémy Žádné nebo příliš nízké peaky (Průměrná intenzita < 200) Možné příčiny: Chyba thermocycleru. Špatná nastavení elektroforézy. Špatná elektroforetická migrace. Malé množství a/nebo špatná kvalita vzorku DNA. Řešení: Zkontrolujte thermocycler. Nastavit parametry elektroforézy podle návodu uvedeného výše. Zkontrolujte migraci fluorescenčního DNA standardu a pokud je to nezbytné, pokračujte novou migrací. Zkontrolujte množství genomové DNA fluorescenční metodou (např. picogreen ) a pokud je to nezbytné, množství upravte. Zkontrolujte kvalitu vzorku DNA (např. solí, vysokým obsahem RNA). Dva příliš vysoké peaky (Průměrná intenzita > 4500) Možné příčiny: Špatné nastavení elektroforézy. Vysoce citlivý sekvenční přístroj (např. ABI3730). Vysoké množství vzorku DNA. Řešení: Nastavte parametry elektroforézy podle výše uvedených požadavků. Zkraťte injekční čas, pokud je to nezbytné. Zkontrolujte množství genomové DNA fluorescenční metodou (např. picogreen ) a pokud je to nezbytné, množství upravte. 10 N_PXT5 V1
Některé píky pacientovy DNA a referenční DNA nemohou být překryty Možné příčiny: Kvalita pacientovy DNA a referenční DNA je různá. Množství pacientovy DNA a referenční DNA je různé. Špatná elektroforetická migrace. Řešení: Použijte stejné extrakční metody pro všechny vzorky. Proveďte další měření množství DNA pomocí referenční metody (picogreen ). (Optimální množství 25 ng). Zkontrolujte migraci fluorescenčního DNA standardu a pokud je to nezbytné, pokračujte novou migrací. Pouze jeden peak vykazuje 50% snížení výšky Možné příčiny: Přítomnost Single Nucleotide Polymorphism (SNP) v sekvenci PCR primeru. Proto může být amplifikována pouze jedna alela. Přítomnost mutace v sekvenci PCR primeru. Pouze jedna alela může být amplifikována. Delece nebo inserce jednoho nebo více nukleotidů v amplikonu spojeného s výskytem peaku navíc Řešení: Hledejte možnou variaci cílové sekvence lokalizovanou na primeru nebo na amplikonu. Kvůli technické podpoře prosím kontaktujte techserv@prestagen.com. 11 N_PXT5 V1
609 Chemin de la Bretèque, BP41 76232 BOIS-GUILLAUME CEDEX FRANCE Hlavní informace : info(a)prestagen.com Objednávka : order(a)prestagen.com Technická podpora : techserv(a)prestagen.com Kvalita : quality(a)prestagen.com Website : www.prestagen.com 12 N_PXT5 V1