ELISAVIDITEST antivca EBV IgA OD096 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, www.vidia.cz, tel.: 420 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISAVIDITEST antivca EBV IgA ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgA proti kapsidovému antigenu (VCA) viru EpsteinBarrové (EBV). 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Test má zásadní význam v diagnostice nasofaryngeálního karcinomu, dále se používá též při diagnostice Burkittova lymfomu, karcinomů Waldayerova okruhu a k charakterizaci oportunních (oligo nebo polyklonálních) lymfomů. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. Stanovení IgA protilátek proti VCA je vhodné zejména při reaktivaci EBV infekce, kde mohou být hladiny IgM protilátek proti VCA nízké za současné přítomnosti IgG protilátek proti VCA a EBNA1. 3. PRINCIP TESTU: ELISAVIDITEST antivca EBV IgA je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen, který reprezentuje imunodominantní epitopy VCA komplexu. Jsouli v testovaných sérech příslušné protilátky, navážou se na imobilizované proteiny. Navázané protilátky jsou pak v dalším kroku rozpoznávány protilátkami proti lidskému IgA značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1x 12 ks 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. 1) CTRL 1 lahvička 1,3 ml pozitivního kontrolního séra r.t.u. CTRL 1 lahvička 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. CAL 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgA značených peroxidázou (konjugát antiiga Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 55 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 60 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u.tmb 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISAVIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISAVIDITEST TMBO, TMBBF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 1
6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kontrolní séra a kalibrátor. Testovaná séra řeďte 101x ředicím roztokem (5 L séra 500 L ředicího roztoku). Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku 450 ml H 2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10 o C. d. Důkladně zamíchejte roztok konjugátu antiiga Px r.t.u. a chromogensubstrátový roztok r.t.u. e. Roztok konjugátu antiiga Px, Chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 L kalibrátorem, kontrolními séry a ředěnými testovanými séry následujícím způsobem: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte kalibrátorem CAL a jednu jamku negativním kontrolním sérem CTRL. Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, ) viz Schéma aplikace vzorků. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum CTRL. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor CAL na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 30 minut ( 2 minuty) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem antiiga Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu antiiga Px r.t.u. Inkubujte 60 minut ( 5 minut) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut ( 30 sec) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620690 nm. Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL S5 b CAL S c CAL d CTRL e f g h S1 S2 S3 S4 2
8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kalibrátoru, kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu Kalibrátoru CAL ze dvou jamek. Počítáteli průměr ze tří jamek a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cutoff hodnotu. Cutoff hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Kalibrátoru se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cutoff jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cutoff jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér : 1. Nejdříve stanovte cutoff hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cutoff hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ : Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90 1,10 / 1,11 4,00 4,01 6,50 6,51 12,00 > 12,00 Příklad : Získaná OD Kalibrátoru = 0,986; 0,996; 0,998 Průměrná hodnota OD Kalibrátoru = 0,993 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor Kalibrátoru = 0,19 Cutoff hodnota = 0,993 x 0,19 = 0,189 Hodnota indexu = 0,800 / 0,189 = 4,23 Pozn.: Hodnocení / znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Ležíli sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 12 týdny později. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: VCA VCA VCA EA (D) EBNA1 EBNA1 Stadium EBV infekce IgG IgM IgA IgG IgG IgM EBV negativní Primární EBV infekce (časná fáze) / Primární EBV infekce ( transientní fáze) Primární EBV infekce (fáze rekonvalescence) Seropozitivní bez známek aktivní EBV infekce Reaktivovaná EBV infekce Pozn: Při vyhodnocení výsledků je třeba brát v úvahu, že zvýšenou hladinu protilátek IgA proti VCA EBV má i určité procento zdravé populace. 3
Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům nabízí VIDIA spol. s r.o. tyto soupravy: ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgG a IgM; ELISAVIDITEST antivca EBV IgG a IgM; ELISA VIDITEST antiea (D) EBV IgG. Pro konfirmaci výsledků lze použít IFVIDITEST antivca EBV IgG a IgM; IFVIDITEST antiea (DR nebo D) EBV IgG. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředícího roztoku DIL (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy reprodukovatelnost (interassay) a během testu opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A σ CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A σ min max CVrepro 18 1,369 0,064 1,2231,476 4,7 % 18 0,463 0,060 0,3370,569 12,9 % 14 1,128 0,093 0,9451,319 8,2 % 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo ověřeno vyšetřením vzorků sér od pacientů s infekční mononukleosou, pacientů se sérologickým nálezem reaktivace EBV a reaktivace a jedinců ze zdravé populace. Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy. Diagnostická citlivost je 85%. U souboru pacientů s diagnózou IM je citlivost 92%. Zjištěná specifita testu byla 100%. 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek antihiv1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. 4
Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Staneli se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISAVIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát antiiga Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v kapitole 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě 2 až 10 C v originálních obalech. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. c. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě 18 až 28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě 2 až 10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 5
14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Krok 2. Aplikujte 100 L / jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Krok 3. Aplikujte 100 L / jamku konjugátu antiiga Px r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Krok 4. Aplikujte 100 L / jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 L / jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450 / 620690 nm do 20 minut Doporučená literatura: Wakiguchi H., Fujieda M., Kubota H., Matsumoto K., Wakiguchi A., Kurashige T., Oda M.: Elevated IgA antibodies to EpsteinBarr virus in children with chronic active EpsteinBarr virus infection; Acta Med Okayama. 1989 Jun; 43 (3): 1936 Marklund G., Henle W., Henle G., Ernberg I.: IgA antibodies to EpsteinBarr virus in infectious mononucleosis; Scand J Infect Dis. 1986; 18(2): 1119 Roubalova K., Roubal J., Skopovy P., Fucikova T., Domorazkova E., Vonka V.: Antibody response to EpsteinBarr virus antigens in patients with chronic viral infection; J Med Virol. 1988 May; 25(1): 11522 Chalupa P., Slesinger P., Krchnakova A., Prasek J.: IgA antibodies against EpsteinBarr virus capsid antigen; Cas Lek Cesk.. 1992 Sep 10; 131(17): 5269 Nikoskelainen J., Neel EU, Stevens DA: EpsteinBarr virusspecific serum imunoglobulin A as an acutephase antibody in infectious mononucleosis; J Clin microbiol. 1979 Jul; 10(1): 759 Edwards JM, Woodroof M.: EB virus specific IgA in serum of patients with infectious mononucleosis and of healthy people of diferent ages; J Clin Pathol. 1979 Oct; 32(10): 103640 Hadar T., Rahima M., Kahan E., Sidi J., Rakowsky E., Sarov B., Sarov I.: Significance of specific Epstein Barr virus IgA and elevated IgG antibodies to viral capsid antigens in nasopharyngeal carcinoma patients; PMID: 3025351 [PubMed] Datum poslední verze tohoto návodu: 02/2015 6