Vědecký výbor veterinární

Vědecký výbor veterinární Klasifikace: Draft Pro vnitřní potřebu VVV Oponovaný draft Pro vnitřní potřebu VVV Finální dokument X Pro oficiální použití Deklasifikovaný dokument Pro veřejné použití MOŽNOSTI IDENTIFIKACE KŮŽÍ PSŮ A KOČEK A VÝROBKŮ Z NICH V PŘÍPADĚ STANOVENÍ JEJICH ZÁKAZU DOVOZU DO EU Garant studie : MVDr. Eva Renčová, Ph.D. Říjen 2007 Výzkumný ústav veterinárního lékařství v.v.i., Hudcova 70, 621 32, Brno Tel. +4205 3333 1111 / fax +4205 4121 1229, URL: http://www.vri.cz/

OBSAH 1. Úvod...2 2. Cíl práce...2 3. Publikované metody...2 4. Návrh metodiky...7 5. Závěr a doporučení...8 6. Literatura...9

ÚVOD Evropská Unie (EU) aktuálně připravuje legislativu, která bude zakazovat členským státům obchodování a dovoz a vývoz kočičích a psích kožešin a výrobků z nich. EU považuje toto za neetické. Proto je třeba, aby každý členský stát EU měl k dispozici vhodnou analytickou metodu, která by byla spolehlivě schopna ověřit, zda se nejedná o dovoz produktů z koček a psů. CÍL PRÁCE Cílem práce je zmapování možnosti metodických přístupů k řešení problematiky identifikace kočičích a psích kožešin a produktů z nich v případě stanovení zákazu jejich dovozu do České republiky. PUBLIKOVANÉ METODY V literatuře je publikována řada článků s využitím různých metod pro rozlišení srsti zvířat pro využití zejména ve forensní identifikaci. Fridez et al., 1999 ve Švýcarsku konstatují, že ze srsti se nedá izolovat jaderná DNA, která bývá často poškozená a je jí malé množství. Proto doporučují analyzovat mitochondriální DNA, na jejímž základě, se pokusili úspěšně rozlišit srst kočky a psa. Kočky a psi mají opakované sekvence v jejich mtdna D smyčce. Autoři poukazují na velké množství polymorfismů, ale zároveň i na vysokou úroveň heteroplasticity, která vede k velké variabilitě mezi jednotlivými jedinci. Takže by bylo možné použít tuto techniku stejně jako STR (short tandem repeat analysis) u lidí. Autoři upozorňují, že v heteroplasticitě se může skrývat i nebezpečí, protože naopak může vést k intra individuální

variabilitě tzv. mosaicismu. Autoři ověřovali, zda jsou profily chlupu a jiné tkáně u téhož zvířete stejné a zjistili, že u některých jedinců se liší, ale spíše v síle bandu. Záleží na množství (koncentraci) templátové DNA. Pokud jí bylo málo, některé bandy zmizely. Dokonce se lišily i profily u téhož chlupu, který byl nastříhán vždy po dvou centimetrech. Autoři uzavírají studii s tím, že vzhledem k množství intraindividuálních variací u koček i psů není možné spolehlivě vzorky identifikovat pomocí této metody. Kolowski et al., 2004 srovnávali dvě metody PCR-STR DNA analýzu a mikroskopickou analýzu pro identifikaci vlasů (pubického ochlupení) dobrovolníků. DNA analýza poskytla kompletní DNA profil u třech vzorků z pěti a u dvou vzorků analýza poskytla pouze částečný nebo neúplný DNA profil. Mikroskopická metoda správně určila 4 z pěti vzorků a zúžila tak počet vzorků pro PCR analýzu. Mikroskopická analýza byla shledána nadále jako vhodná metoda pro forensní stanovení. Identifikace pomocí optické mikroskopie je tradiční technikou a záleží velmi na zkušenosti vyšetřovatele, aby bylo možné rozlišit jednotlivé druhy srsti. Tato technika se zabývá morfologií a skladbou chlupu. Chlup se skládá ze tří vrstev centrální dřeň, kůra, která obklopuje dřeň a kutikula na povrchu a má vzorek, který se u různých druhů srsti liší a právě toto slouží k rozlišení jednotlivých druhů. Králík má velmi ostrý vzorek a kočka má naopak vzorek širší. Například zvěřina má širokou dřeň oproti psovi, který ji má užší. Poměrně novou techniku Matrix Assisted Laser Desorption /Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI TOF MS) pro identifikaci zvířecí srsti popsal Hollemeyer et al., 2002, kde ko-precipitát UV záření pohlcující hmotu a biomolekula je ozářena po dobu nanosekundy pulsním laserem. Většina energie laseru je pohlcena hmotou, což zabraňuje fragmentaci biomolekuly. Metoda se používá pro stanovení a charakteristiku fragmentů

proteinů, které se nacházejí ve zvířecí srsti a jsou charakteristické svou sekvencí aminokyselin, která je geneticky determinovaná a liší se druh od druhu. Je to metoda velmi citlivá a dovoluje analýzu velmi malého množství analytu a zároveň i velkého počtu vzorků v krátkém časovém intervalu. Důležité je vytvoření databáze spekter proteinových fragmentů srsti různých druhů zvířat umožňující porovnání vzorků. Podstatná je i zkušenost a erudovanost pracovníků při finálním vyhodnocování vzorků. Holandská studie (Voeman, 2006) se zaměřila na průzkum zimního ošacení zejména kožichů dostupných v tržní síti. Cílem studie bylo nejprve zmapovat, zda se kočičí nebo psí kožešiny objevují jako součást zimní nabídky oblečení v Holandsku a následně zjistit původ těch vzorků zahrnutých do studie, u kterých selhla mikroskopická analýza. Dále byla popsána metoda SIAM (Species Identification of Animals by MALDI-TOF mass spectrometry) a byla rovněž srovnána s metodou analýzy DNA. Byla vyhodnocena kvalita a možnosti obou metod. Bylo odebráno celkem 51 vzorků kožešinového oblečení. Tyto vzorky byly vyšetřeny mikroskopickou analýzou v laboratoři v Groningenu. Bylo zjištěno, že 14 vzorků je ze syntetických materiálů, 37 vzorků obsahovalo zvířecí srst. Z těchto 37 vzorků bylo 35 králičích, jeden psí a jeden liščí nebo kočičí. Tyto dva vzorky byly zaslány na ověření jinými metodami DNA analýza a SIAM. Metodou SIAM byl potvrzen vzorek liščí srsti (ne kočičí) a vzorek psa byl potvrzen jako mývalí. Dále byly identifikovány opět metodou SIAM chlupy ze psa domácího a kočky domácí. Lze konstatovat, že na holandském trhu se nenachází oblečení z kočky nebo psa. Nakonec bylo vyšetřeno celkem 103 vzorků kožešin. Většina kožešin byla z králíka nebo syntetických a dvě byly z lišky a mývala. DNA analýza zde úplně selhala. Byl určen pouze jeden vzorek. Jinak tato analýza nedala žádný výsledek. Zřejmě z důvodu velmi malého množství DNA nebo případně zničení DNA použitím chemikálií při zpracování vzorků. Ukázalo se, že použití mikroskopické analýzy jako metody první volby a

následná verifikace metodou SIAM bylo vhodné řešení. Mikroskopická metoda je vhodnou metodou pro určování, ze kterého zvířete srst pochází. Spolehlivě lze určit králičí a syntetickou kožešinu. V případě pochybností lze analýzu doplnit metodou SIAM, která by měla být metodou rozhodčí. Americká humánní společnost (HSUS) referovala o testování kožichů v prosinci 2006. Kožichy označené jako mývalí (Procyon lotor) byly ve skutečnosti kůže psíka mývalovitého (Nyctereutes procyonoides), jež je zařazen do psovitých a je považován za druh psa. Pro molekulárně genetickou analýzu je vhodnější použití mitochondriální DNA než nukleární DNA, která je chemickými procesy, kterými prochází kožešina při zpracování více degradována oproti DNA mitochondriální. Řada autorů využívá pro identifikaci gen pro Cytochrom b u rozlišení jednotlivých druhů psů, dokonce může být rozlišen stejný druh psa v různých zemích nebo druh divokého a domestikovaného psa ( Wetton et al., 2003; Angleby et al, 2005). V literatuře nejsou dosud publikovány údaje, které by zohledňovaly efekt vlivu chemického technologického procesu, kterým kožešiny procházejí, na stabilitu a údržnost mtdna. Lze předpokládat, že dřeň chlupu tímto nebude poškozena. Nakaki et al., 2007 vyvinuli jednoduchou multiplex single-base primer extenzní reakci pro druhovou identifikaci lidské, psí, a kočičí DNA genu cytochromu b. Jednotlivé nukleotidy byly zkoumány s použitím různě dlouhých primerů. Metoda byla schopná rozlišit najednou v jedné reakci lidské, kočičí a psí vzorky a i různé vzorky od jednoho zvířete se nijak nelišily. Byly testovány vzorky srsti (chlupů) a vzorky krve, případně krevní skvrny. Tato metoda se velmi osvědčila ve forensní vědě. DNA izolace byla provedena pomocí komerčního kitu QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen). Koncentrace získané DNA byla měřena spekrofotometricky

při 260 nm. Získaná mtdna (425 bp) byla amplifikována pomocí navržených primerů. Autoři studovali i efekt amplifikace různého množství DNA, které se lišilo od 1ng do 0.O1 ng, kdy reakce proběhla v reakční směsi o množství 25 ul obsahující vždy 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, a 1 ng templátové DNA pro každý zkoumaný druh. Vzorky chlupů měřily u všech zkoumaných druhů (lidské, kočka, pes) 2 cm. K multiplex single base primer extension reakci byl využit ABI PRISM SNaPshot Multiplex kit (Applied Biosystems, USA). Pro finální detekci byla využita kapilární elektroforéza ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Množství DNA potřebné pro analýzu bylo 0.01 ng pro lidské a psí vzorky a 0.1 pro kočičí vzorky. Z šesti vzorků chlupů bylo spolehlivě určeno pět. Jeden vzorek se nepodařilo určit ani jako psí ani jako kočičí. Byl zřejmě z jiného zvířete. Pfeiffer et al., 2004 se zabývali důležitostí identifikace nalezených jednotlivých psích chlupů jako důkazního materiálu v kriminalistice. Vzhledem k tomu, že v chlupových folikulech je málo jaderné DNA a bývá často poškozená, je třeba se orientovat na mtdna. I zde může být málo DNA z důvodu ojedinělých chlupů nebo poškození, polámání chlupu. Autoři se ve své práci proto zaměřili na zlepšení izolace DNA pomocí Ca2+ vápenatých iontů a proteinázy K. Psí chlupy byly inkubovány při teplotě 56 C po dobu 2-5 hodin a následně natrávení aktivovanou pomocí vápníku proteinázou K. Tmavé chlupy byly natráveny během 2-3 hodin a světlé až za 5 hodin. Následně byl použit izolační kit QIAGEN Germany. Byla získáno 80 ul DNA. Množství DNA izolované pomocí Ca iontů se navýšilo prakticky o 100% oproti původní izolaci s použitím Qiagen Tissue Kit. Savolainen et al., (1999) zkoumali možnost využití velkého množství genetických variací nacházejících se v oblasti mtdna opakovaných repeticí u psů pro forensní analýzu. DNA získaná z krve a chlupů byla analyzována pomocí polymorfismu délkz restrikčních řetězců a

pomocí sekvenování DNA. Pokud se ve vzorku nachází relativně velké množství DNA využívá se obvykle STR (short tandem repeat analysis), respektive DNA fingerprinting. Ovšem pro materiály obsahující malé množství DNA je vhodné využít mtdna. Důvodem je, že jedna buňka obsahuje více než tisíc kopii mtdna ve srovnání se dvěma kopiemi jaderné DNA. Autoři referují, že tato metoda je vhodná pro stanovení vzorků krve, ale ne pro identifikaci zejména jednotlivých chlupů. Pokud je analyzováno více chlupů, pak výsledky analýzy odpovídají prakticky se shodují s výsledky analýzy krve. NÁVRH METODIKY REAL TIME PCR (DOSUD NENÍ POPSÁNA) PRO IDENTIFIKACI KOŽEŠINY ZE PSA A KOČKY DOMÁCÍ DNA bude izolována z chlupů kožešiny. K izolaci bude použita metoda založená na vazbě DNA s křemelinou (diatom) v prostředí guanidin thiokyanátu. Chlupy budou smíchány s 1ml lyzačního pufru a homogenizovány skleněnými kuličkami na homogenizátoru Mini Beadbeater. Po centrifugaci bude 200 μl supernatantu smícháno s 500 μl lyzačního pufru a s 40 μl roztoku křemeliny. Navázaná DNA bude promyta promývacím pufrem, 70% ethanolem a acetonem. Po vysušení bude DNA vymyta vodou a použita pro Real-time PCR stanovení. Pro detekci kočičí a psí DNA budou navrženy primery a proby v oblasti mtdna ATPázy podjednotek 8 a 6. Bude ověřena druhová specifita navržených primerů a prób na vzorcích DNA zvířecích druhů, které se používají v kožešnictví (králík, liška). ZÁVĚR Na základě vypracované studie a vzhledem technologickému zpracování kožešin, považuji za nejvhodnější pro identifikaci kočičí a psí DNA metodu real-time PCR, která umožňuje stanovit krátké úseky (100-150 bp) tepelně a mechanicky poškozené DNA. Tato metoda je vhodná i pro vysoce citlivé stanovení několika molekul DNA ve vzorku. Stanovení budou

prováděna na termocykleru s real-time detekcí LightCycler (Roche), kterým je vybaveno pracoviště VÚVeL. Na základě vyhodnocení studie byly zahájeny laboratorní práce týkající se izolace a amplifikace DNA uvedených druhů. Dále doporučuji provést prověření vzorků kožešin dostupných v tržní síti České republiky na přítomnost psí a kočičí DNA. SOUHRN Cílem práce bylo zmapování možností metodických přístupů k řešení problematiky identifikace kočičích a psích kožešin a produktů z nich v případě stanovení zákazu jejich dovozu do České republiky. Na základě údajů v literatuře a vzhledem technologickému zpracování kožešin, byla navržena jako nejvhodnější pro identifikaci kočičí a psí DNA metoda real-time PCR, která umožňuje stanovit krátké úseky (100-150 bp) tepelně a mechanicky poškozené DNA. Tato metoda je vhodná i pro vysoce citlivé stanovení několika molekul DNA ve vzorku. Stanovení budou prováděna na termocykleru s real-time detekcí LightCycler (Roche), kterým je vybaveno pracoviště VÚVeL. Bude provedena analýza vzorků kožešin dostupných v tržní síti České republiky na přítomnost psí a kočičí DNA. SUMMARY The aim of this study was to find out the possibilities of the methodological approaches to solve cat and dog fur identification in case of ban on their importing to the EU. Based on the literature data and the technological processing of the fur real-time PCR method for the differentiation of cat and dog fur has been suggested as the most suitable one. This method enables to detect very short parts (100-150 bp) of heat and mechanically damaged DNA. The identification will be performed using LightCycler (Roche) with the real-time detection. Our Veterinary Research Institute is equipped with this apparatus. The analysis of fur samples for the presence of cat and dog DNA in the market of the Czech Republic will be realized.

POUŽITÁ LITERATURA Angleby, H., Savolainen, P. Forensic informativity of domestic dog mtdna control region sequences. Forensic Sci Int, 2005, 154(2-3), 235-241. Fridez, F., Rochat, S., Coquoz, R. Individual identification of cats and g dogs using mitochondrial DNA tandem repeats. Sci Justice, 1999, 39(3), 167-171. Hollemeyer, K. Altmeyer, W., Heinzle, E. Identification and quantification of feathers down, and hair of avian and mammalian origin using matrix-assisted lase desorption/ionization time of flight mass spectrometry. Anal Chem., 2002, 74(23), 5960-5968. Kolowski,J.C., Petraco, N., Wallace, M.M., De Forest, P.R., Prinz, M. A comparison study of hair examination methodologies. J Forensic Sci., 2004, 49(6), 1253-1255. Nakaki, S.I., Hind, D., Miyoshi, M., Nakayama, H., Moriyoshi, H, Morikawa, T., Itohara, K. Study on animal species (human, dog and cat) identification using a multiplex single base primer extension reaction in the cytochrome b gene. Forensic Sci Int., 2007, Mar 21, in press. Pfeiffer, I., Vőlkel, I., Täubert, H., Brenig, B. Forensic DNA-typing of dog hair: DNAextraction and PCR amplification. Forensic Sci Int., 2004, 141(2-3), 149-151. Savolainen, P., Arvestad, L., Lundeberg, J. A novel method for forensic DNA investigations:repeat-type sequence analysis of tandemly repeated mtdna in domestic dogs. J Forensic Sci., 2000, 45(5), 990-999. Voeman, H. Results of market investigation into the presence of dog and cat fur (in clothing) on the Dutch market.in: EU project number ND 05o520, 2006, 4-11. Wetton, J.H., Higgs, J.E., Spriggs, A.C., Roney, C.A., Tsang, C.S.F., Foster, A.P. Mitochondrial profilling of dog hairs. Forensic Sci Int., 2003, 133(3), 235-241.