Field-Flow Flow Fractionation (FFF) Jiří Pazourek Farmaceutická fakulta Veterinárn rní a farmaceutická univerzita Brno 27.11.2008 1
Co je to FFF? 2
Co je to FFF? 3
Co je to FFF? 4
5
Co je to FFF? Frakcionace tokem v poli (FFF) je eluční metoda formáln lně podobná kapalinové chromatografii fii. Nevyužívá ale chemickou afinitu, nepotřebuje ebuje vysoké koncentrace org.. rozpouštědel. Lze ji použít t k charakteriza terizaci, separaci a určen ení velikosti pro: makromole romolekulární polymery mikronové částice baktéri rie, viry, buňky (živé!) jíly / sedimenty 6
Co je to FFF? 7
HISTORIE 8
GEORGIUS AGRICOLA (1494-1555) 1555) Joachimsthal De re metallica libri XII Georgius Agricola, Basel, 1556. 9
Historie 10
11
Historie - J. Calvin Giddings (1930-1996) 1996) 12
Princip FFF 13
Instrumentace FFF připomíná HPLC, kde je kolona nahrazena FFF kanálem (channel) Nosič injektor POLE PC 12.34 PUMPA 254 nm Detektor FFF kanál odpad 2.000 ml/min průtokoměr 19.980g váhy 14
FFF: separační proces dávkování Sample Mixture Field w RELAXACE Diffusion Field SEPARACE l1 l2 15
Proč FFF separuj uje e? Chrom.mpg Fl_fff.mpg HPLC: FFF: 16
Unikátn tní rysy FFF R = t 0 / t R 6 D / U w Distribu Distribuční data lze spočítat po spojení FFF s LALLS, MALLS, ICP-MS, ICP-AES, AAS atd. 17
Operační prostor FFF 18
Operační prostor FFF 19
Techniky FFF Flow FFF Stěna/y je polopropustná ultrafiltrační membrána podepřena ena keramickou fritou Thermal FFF Stěny jsou kovové,, horní stěna je elektricky vyhřívána, na, spodní chlazena vodou Sedimentation FFF Kanál l je zabudován n v rotoru centrifugy (je využíváno odstřediv edivé pole) Electrical FFF Pole je vytvořena aplikací elektric trického napětí (1-10 10 V) skrze výšku kanálu 20
Toková FFF (Asym( Asym. Flow FFF) 21
Termáln lní FFF 22
Sedimentační FFF Kanál l v rotoru centrifugy Latexové částice, d = 100, 200, 320, 600 nm 23
Gravitační FFF Jak si udělat kanál? Typické rozměry ry délka 20-100 cm šířka 1-22 cm tloušťka 50-500 500 micronů 24
Teorie Např. je-li kromě pole dalším působícím faktorem pouze difúze působící proti koncentračnímu gradientu, za rovnováhy platí pro difúzní tok J x = D dc dx (1. Fickův zákon, D = difúzní koeficient) 25
Teorie a výsledný koncentrační profil je c(x) = c 0.e D Uw c 0 = koncentrace u akumulační stěny kanálu (x=0), U = rychlost analytu indukovaná polem, w = charakteristická výška kanálu. Celý děj se odehrává v kanále s laminárně proudící kapalinou, kde v důsledku viskozity existuje rychlostní profil v(x), nejčastěji parabolický (Newton, 1666): x v( x) = 6 v w x w 2 2 <v> = průměrná lineární rychlost kapaliny. 26
Co měřm ěříme? Protože retenční poměr R = u i v t R = 0 t r cx ( ). vx ( ) R = = cx ( ). vx ( ) se může obecně vyjádřit středními hodnotami < > w 1 w řešení lze odvodit s (1) a (2) w 0 cx ( ). vxdx ( ) 1 w cxdx 1 ( ). w vxdx ( ) 0 w 0 R R = 6 6 λ λ coth 1 2 λ 2 λ R = t 0 / t R 6 D / U w kde λ = D/ U w (rel. tloušťka zóny analytu). experimentálně pozorovatelná veličina R je přímo dána účinkem pole (U) a vlastností analytu (D). 27
Co měřm ěříme R = t0 t / tr (<1) me? (<1) 0.012 Retention ratio R 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 0 500 1000 1500 2000 2500 Particle Diameter / nm 28
SdFFF t0 R = t r R R = 6λ coth 6λ 1 2λ 2λ 29
Vybrané příklady technik FFF 30
Gravitational FFF ( 1g ) Both the walls are of glass (plexiglass( plexiglass) the field = Earth s s gravity 31
Separation of a mixture of non-porous silica gel particles. Experimental conditions: carrier liquid = water, flowrate = 0.10 ml/min, stop-flow time = 5 min, injection volume and concentration of each individual = 0.25 µl and 0.1 mg/ml, respectively. 0.35 R 0.30 0.25 0.20 0.62 µm 0.91 µm 1.21 µm 1.43 µm J. Pazourek, K.-G.Wahlund, J. Chmelík, Journal of Microcolumn Separation, 8 (5), 331 (1996) 0.15 Simulation (flowrate independent) 0 1 2 3 4 5 6 flowrate [ml/min] experiment A 254 flowrate 0.100 ml/min 1.43 µm 0.5 mau 1.21 µm 0.62 µ m 0.91 µ m 1.21 µ m 0.91 µm 1.43 µ m 0.62 µm 0 1 2 3 4 retention volume [ml] 0 1 2 3 4 retention volume [ml] 32
Applications Separation of the non-porous silica gel chromatographic support Monospher. A254 flowrate 0.200 ml/min 1.50 um 0.5 mau 0.93 um Experimental conditions: carrier liquid=water, flowrate=0.20 ml/min, stop-flow time=2 minutes. 0 5 10 t0 retention time [min] 33
Asymmetrical flow FFF 34
Asymmetrical flow FFF 35
splitt FFF (PREPARATIVNÍ ) 36
Trendy 37
Trendy 38
Trendy 39
Trendy - ThFFF www.chemie.de/articles/d/81965/. 40
Trendy 41
KONEC 42
FFF lidé Karin Caldwell (Utah, USA) P. Steve Williams (Ohio, USA) Kim Ratanathanawongs Williams (Colorado, USA) Martin Schimpf (Idaho, USA) Ron Beckett (Australia) Michel Martin (Paris,F) Philippe Cardot (Paris, F) Karl-Gustav Wahlund (Lund, S) Bengt Wittgren (Göteborg,S) Pierluigi Reschiglian (Bologna,I) Josef Chmelík (Brno, CZ) 43
Realita l1 l 2 a 1 a 2 44
Realita Velocity Vectors l1 l 2 Velocity Vectors a 1 a 2 45