Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, CT 06902, Spojené státy americké Tel.: +1 (203) 328-9500 nebo (888) 329-0255, Fax: +1 (203) 328-9599 WWW.IMMUCOR.COM Dokumentace k produktu a ostatní jazykové verze jsou k dispozici na: www.immucor.com MIA FORA - sada pro typizaci HLA pomocí NGS Určeno pro diagnostiku in vitro P Ř Í B A L O V Ý L E T Á K OBSAH Definice symbolů. 1 Odběr a příprava vzorku 4 Činidla podle katalog. čísla 2 Postup.... 5 Záměr pouţití 3 A. Dodané materiály.. 5 Souhrn a vysvětlení. 3 B. Poţadované, ale nedodávané materiály... 5 Principy postupu.. 3 Pokyny k pouţití. 5 Činidla... 3 Kontrola kvality.. 12 A. Identifikace. 3 Omezení postupu.. 12 B. Varování a upozornění. 3 Zvláštní chování 12 C. Pokyny pro uskladnění.... 4 Řešení problémů.. 14 D. Purifikace a aplikace. 4 Omezení licence.. 15 E. Indikace nestability. 4 Informace o výrobci.. 15 Poţadavky na nástroje... 4 Pouţité obchodní značky. 15 Definice symbolů Číslo šarţe Katalogové číslo Teplotní hranice Pouţitelnost do Sériové číslo SN Mnoţství pro <n> testů Varování Viz pokyny k pouţití Výrobce Autorizovaný zástupce pro Evropské společenství Zdravotnické zařízení pro diagnostiku in vitro Obsahuje CONT Evropská shoda Strana 1 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA Sada MIA FORA NGS HLA číslo SR-800-10377 obsahuje typizační sadu činidel MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365) a sadu magnetických kuliček (SR-800-10379). Typizační sada činidel MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365): a) Činidla PCR: obsahuje celkem devět (9) samostatných ampulek Činidlo Číslo výrobku Objem náplně Uskladnění 1 HLA-A PCR Mix SR 800 00326 2 HLA-B PCR Mix SR 800 00327 3 HLA-C PCR Mix SR 800 00328 4 HLA-DPA1 PCR Mix SR 800 00329 5 HLA-DPB1 PCR Mix SR 800 00330 450 µl -20 aţ -80 C 6 HLA-DQA1 PCR Mix SR 800 00331 7 HLA-DQB1 PCR Mix SR 800 00332 8 HLA-DRB1-S PCR Mix SR-800-00333 9 HLA-DRB1-L PCR Mix SR-800-00334 24 b) Činidla pro přípravu knihovny: obsahuje celkem (12) samostatných ampulek Činidlo Číslo výrobku Objem náplně Uskladnění 10 Fragmentační enzym SR-800-00335 67 µl 11 Fragmentační pufr SR-800-00336 168 µl 12 STOP pufr SR-800-00337 225 µl 13 Enzymový mix pro opravu konců SR-800-00338 34 µl 14 Pufr pro opravu konců SR-800-00339 168 µl 15 16 Enzym pro vytvoření poly-a konce Pufr pro vytvoření poly- A konce SR-800-00340 17 µl SR-800-00341 118 µl 17 Ligázový enzym SR-800-00342 34 µl 18 2X ligázový pufr SR-800-00343 917 µl 19 Mix enzym/pufr pro PCR SR-800-00344 84 µl 20 Amplifikační primer SR-800-00345 12 µl 21 Voda bez nukleázy SR-800-00362 85 µl -20 aţ -80 C 24 c) Deska s adaptorem (SR-800-00349): Popis Č. komponentu Objem náplně Uskladnění Deska s adaptorem Tři vyplněné sloupce na destičce s 96 jamkami SR-800-00349 5 µl/jamka -20 aţ -80 C Sada magnetických kuliček (SR-800-10379): a) Magnetické kuličky: obsahují jednu (1) ampulku Popis Č. komponentu Objem náplně Uskladnění Naplněná ampulka, kuličky Agencourt AMPure XP SR-800-00378 5 ml 2 aţ 8 C Strana 2 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
ZÁMĚR POUŢITÍ Sada pro typizaci HLA pomocí NGS MIA FORA TM slouţí k amplifikaci a sekvenování HLA genů HLA -A, -B, -C, -DRB, -1/3/4/5, - DQA1, -DQB1, -DPA1 a -DPB1 na sekvenční platformě NGS IIlumina. Software MIA FORA slouţí jako návod ke stanovení typu HLA z dat získaných pomocí sady MIA FORA NGS HLA. Test je určen k pouţití v laboratořích způsobilých k manipulaci s DNA pro amplifikaci a sekvenování. SOUHRN A VYSVĚTLENÍ Typizace PCR-amplifikovaných exonů genů HLA pomocí sekvenování je běţný laboratorní postup. Amplifikace PCR slouţí k obohacení cílových sekvencí a pro vybrané oblasti je stanovena následná typizace HLA. Ke stanovení typu HLA jsou pouţívány i jiné metody, jako je vyuţití sekvenčně specifických oligonukleotidových sond (SSOP) a testy sekvenčně specifických primerů (SSP). Systém MIA FORA pro typizaci HLA pomocí NGS je nová typizační metoda, která vyuţívá schopnosti zachytit všechny odpovídající oblasti lokusů HLA pomocí PCR dlouhých řetězců. Součástí sady je devět PCR master mixů obsahujících všechny komponenty poţadované k amplifikaci jednotlivých genů, včetně enzymů, pufrů, dntp (deoxynukleotid trifosfáty) a primerů pro PCR amplifikaci dlouhých řetězců. Amplifikovanou DNA je pak moţné dále zpracovat pomocí sady MIA FORA NGS HLA a získat knihovnu DNA pro sekvenování na sekvenční platformě Illumina. Na sekvenční platformě Illumina umoţňuje sada mnohočetně sekvenovat aţ 24 vzorků. PRINCIPY POSTUPU Typizační sada MIA FORA NGS HLA slouţí ke stanovení lokusů HLA třídy I a II sekvenováním celého genu nebo exonů a intronů nesoucích maximum informací. Typizační sada MIA FORA NGS HLA vyuţívá PCR dlouhých řetězců k zachycení a obohacení hlavních genů HLA, HLA -A, -B, -C, -DQA1, -DQB1, -DPA1, -DPB1 a -DRB1/3/4/5. Sada činidel pro přípravu knihovny MIA FORA NGS generuje knihovnu z amplifikované DNA k sekvenování na sekvenční platformě Illumina. Typizační software MIA FORA NGS HLA poskytuje sekvenci příslušných genů HLA a informace o fázi pro účely typizace HLA s vysokým rozlišením. ČINIDLA A. Identifikace Úplný seznam produktů a příslušných katalogových čísel viz tabulky v oddíle Činidla podle katalogového čísla. B. Varování a upozornění 1. Určeno pouze pro diagnostiku in vitro v Evropské unii. 2. Výsledky získané pomocí těchto souprav nelze pouţít jako jediný základ pro učinění klinických závěrů o stavu pacienta. 3. K manipulacím před a po PCR by měly být vyčleněny samostatné laboratoře nebo uzavřené laboratorní prostory. 4. K manipulacím před a po PCR pouţívejte různé pipety. 5. Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s takovými vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními. 6. Nikdy nepipetujte ústy. Zabraňte kontaktu činidel a vzorků s pokoţkou a sliznicemi. 7. Likvidaci pouţitých materiálů proveďte v souladu s místními předpisy pro likvidaci potenciálně nebezpečného biologického materiálu a/nebo v souladu s příslušnými předpisy daného ústavu. 8. Technologie PCR je citlivá na kontaminaci, a to především z vlastních produktů. Častým zdrojem kontaminace jsou aerosoly z amplikonů PCR generované během fáze po PCR. Proto je nutné zabránit nadměrnému stříkání a tvorbě aerosolů. Během práce se sadou je dále nutné dodrţovat standardní laboratorní opatření pro PCR, jako je otření pracovní plochy před zpracováním či přípravou PCR vzorků čerstvě připraveným 10% bělidlem, pouţití ultrafialového (UV) světla v krytech a biologicky bezpečných kabinetech mezi jednotlivými pouţitími, oddělení kroků před a po PCR s ohledem na čas a prostor, pouţití na alikvoty rozdělených PCR činidel, uplatnění pozitivních a negativních kontrol, atd. Pouţití konzistentní a pečlivé techniky ve spojení se začleněním a monitorováním kontrol zajistí ostraţitý a aktivní přístup ke kontrole a monitoringu kontaminace PCR. 9. Kaţdá laboratoř schválí a uplatní své vlastní postupy čištění. 10. Kontaminace činidel či vzorků můţe mít za následek chybné výsledky. Zabraňte kontaminaci produktu během pouţití. Nepouţívejte kontaminovaná činidla. 11. Kapaliny, které jsou součástí sady, pouţívejte ve stavu, v jakém byly dodány. Ředění a jiné úpravy mohou mít za následek chybné výsledky. Nemíchejte činidla z různých sad. 12. Nepouţívejte protékající a neoznačené ampulky. 13. Dříve zmrazené vzorky a činidla musejí být po rozmrazení a před zahájením testu důkladně promíchány a odstředěny. Zabraňte tvorbě pěny a bublin ve vzorcích. 14. Během rozmrazování uchovávejte všechny enzymy a master mixy na ledu nebo v kryo-bloku (2-8 C). 15. Před amplifikací zkumavku důkladně utěsněte, abyste zabránili vypařování. 16. Z důvodu rozdílů ve výkonnostních mechanismech termocyklerů mohou být získány odlišné výsledky, pokud jsou dané teplotní profily přenášeny mezi různými modely a značkami termocyklerů. V některých případech můţe být ohroţena specificita reakce a citlivost, coţ můţe vést k chybné interpretaci a analýze získaných dat. Alternativní termocyklery a profily musejí být předem schváleny uţivatelem. 17. Jiná, neţ uvedená doba inkubace a teplota, mohou mít za následek chybné výsledky. Strana 3 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
18. Odchýlení se od doporučených postupů pouţití můţe mít za následek neoptimální chování produktu. V závislosti na povaze a závaţnosti odchylky můţe dojít ke zmaření pokusu (vztahujícího se jak na samostatný vzorek, tak i na celý běh), anebo k získání chybných výsledků. Bylo například zjištěno, ţe nedostatečné/neaktivní čištění kuliček v průběhu pokusu můţe mít za následek zvýšený výskyt selhání adaptorů. 19. Doporučujeme provádět gelovou elektroforézu pro analýzu produktů amplifikace genu HLA podle velikosti. K vizualizaci produktů PCR by měl být pouţit ethidium bromid nebo gel red, ostatní barviva nejsou dostatečně intenzivní. 20. Během několika postupů v rámci protokolu jsou pouţity magnetické kuličky. Před zahájením vymývání je důleţité odstranit etanol a nenechat přitom kuličky usušit. Povrch magnetických kuliček musí být skelný a hladký, bez viditelných stop po kapalině. Vhodnou dobu sušení je moţné stanovit empiricky pro jednotlivá laboratorní prostředí (5-10 minut). 21. Pro kaţdé čištění kuliček pouţijte čerstvě naředěný 80% etanol. 22. Po kaţdém čištění kuliček nastává bezpečné období, během kterého je moţné uchovávat vzorky či knihovnu při -20 C aţ 4 dny. 23. Destičky PicoGreen chraňte před světlem, abyste zabránili vybělení. 24. Fragmentační reakce nesmí v ţádném případě přesáhnout dobu 20 minut a čištění kuliček musí proběhnout ihned poté, aby byl zajištěn odpovídající rozsah velikosti fragmentu. 25. Destička s poly-a koncem musí být přenesena přímo do kroku ligace adaptoru. 26. Pokud manipulujete s destičkou při přípravě adaptoru pro ligaci, pouţijte vţdy nové rukavice. Opatrně odstraňte film z destičky. Zkontrolujte, zda jamky ve sloupcích 1, 2 a 3 obsahují přibliţně 5 µl roztoku. 27. Amplifikovanou knihovnu je nutné purifikovat do 1 hodiny od amplifikace. 28. Postupy po amplifikaci knihovny by měly být prováděny v sekvenační místnosti nebo v AirClean PCR boxu, aby bylo zabráněno kontaminaci spojených adaptorů DNA finálním produktem obsahujícím sekvence clusteru Illumina. 29. Příprava na kvantifikaci knihovny pomocí qpcr nebo Quibit musí být provedena v PCR krytu za pouţití čerstvě připraveného ředicího pufru pro qpcr, aby bylo zabráněno kontaminaci. 30. Proveďte denaturaci vzorku pomocí 0,2 N čerstvého hydroxidu sodného. 31. Proveďte veškerá promývání sekvencera, tj. po provedení, průběţná a pravidelná. C. Pokyny pro uskladnění 1. Typizační sadu MIA FORA NGS HLA uchovávejte při teplotě -20ºC v mrazáku s ručním odmrazováním. 2. Komponenty nepouţívejte po překročení data exspirace. 3. Magnetické kuličky skladujte při teplotě 2 aţ 8 C. D. Purifikace a aplikace Viz Odběr a příprava vzorku. E. Indikace nestability 1. Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysráţely soli, před pouţitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí spirálového pohybu při pokojové teplotě (18 aţ 30 C). POŢADAVKY NA NÁSTROJE 1. Termocykler vybavený vyhřívaným víkem a nastavitelnou rampovou frekvencí, s minimálním teplotním rozsahem od 2 C do 100 C a přesností alespoň +/- 0,5 C. Podmínky pro volbu termocykleru je nutné přizpůsobit účelu optimalizace profilů. Schválen byl termocykler Veriti od Applied Biosystems, spuštěný ve výchozím reţimu s rampovou frekvencí 3,9ºC/sek. 2. Vhodná fluorescenční čtečka destiček s excitačním filtrem ~ 485 nm a emisním filtrem ~535 nm pro měření koncentrace DNA, schválena byla čtečka Victor X2, X3. 3. Vhodná metoda/nástroj na izolaci a purifikaci fragmentů DNA o velikosti párů bází cca 400-500. Schválen byl nástroj Pippin Prep TM. 4. Volitelný systém pro manipulaci s kapalinami pro poloautomatickou konstrukci knihovny. Schválen byl systém Biomek 4000. 5. Vhodná metoda/přístroj pro kvantifikaci knihoven, např. qpcr or Qubit. 6. Byla schválena sekvenční platforma Illumina. 7. Server a software MIA FORA NGS: Immucor, číslo komponentu SR-790-00017. ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKU Lidskou genomickou DNA je moţné purifikovat z plné krve nebo z buffy coat pomocí schválených metod splňujících níţe uvedené podmínky. DNA získaná z krve uchovávané v EDTA byla testována a prokázala vlastnosti potřebné pro tento test. DNA získaná z krve uchovávané v heparinu nemůţe být pro tento pokus pouţita. Izolovaná DNA by měla být v 10 mm Tris-HCl, ph 8,0-9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního činidla jako je EDTA nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mm. Konečná koncentrace DNA by měla být 5 aţ 15 ng/µl. Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 aţ 2,0. Vzorky DNA mohou být pouţity ihned po jejich izolaci nebo uskladněny aţ 1 rok při teplotě -20ºC. Vyhněte se opakovanému zmrazování / rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA. Alespoň 50 % vzorků genomické DNA musí mít fragmenty větší neţ 10 kb, aby byla zajištěna úspěšná PCR amplifikace dlouhých řetězců. Strana 4 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
POSTUP A. Dodané materiály (Podrobné informace naleznete v tabulce v oddíle Činidla podle katalogového čísla) Činidla PCR Činidla pro přípravu knihovny, destička s adaptorem, magnetické kuličky Ampure B. Požadované, ale nedodávané materiály, činidla a vybavní Termocyklery: schválen byl termocykler ABI Veriti Magnetický stojan pro vymývání malých objemů v destičkách s 96 jamkami: schválen byl Alpaqua Magnum FLX Magnetický stojan pro magnetickou separaci mikrocentrifugačních zkumavek: schválen byl DynaMag-2 Magnet Jeden stolní centrifuga na destičky a jeden mikrocentrifuga pro zkumavky Pipetory, multikanálové pipetory a špičky (1-20 µl, 20-200 µl, 1000 µl) Těsnící filmy pro PCR destičky. Schválen byl Accuseal Adhesive PCR film (E & K scientific kat. č. T796150, 4titude kat. č. 4ti-0500) 1,5 ml centrifugační zkumavky a PCR-prouţek zkumavky Laboratorní míchačka (vortex) Tuhé vysoké polokryté destičky s 96 jamkami (E & K Scientific kat. č. EK-75012, 4titude kat. č. 4ti-0770/C) Destička s 96 jamkami PP Black, V-dno, hluboké jamky (E & K Scientific kat. č. 21209, Greiner Bio-One kat. č. 651209) MicroAmp reakční destička s 96 jamkami (ThermoFisher kat. č. N8010560) Optický těsnící film MicroAmp, Advanced Adhesive (E & K Scientific kat. č. T796400, ThermoFisher kat. č. 4311971) Nádoby na činidla Bezbarvé těsnící polštářky Alumioniová těsnicí páska Papírky pro objektivy Filtrované (odolné vůči aerosolu) jednorázové pipetovací špičky v rozsahu od 0,1 μl do 1000 μl Etanol 200 10 mm Tris-HCl ph 8,0 100% Tween 20 Hydroxid sodný 1 N Voda bez obsahu nukleázy 1,5% agaróza, bez barviva, interní normy, Pippin Prep TM, 250 bp 1,5 kb, (Sage Science,CDF1510) PhiX Control, v3 (Illumina kat. č. FC-110-3001) Činidla pro fluorescenční určení koncentrace DNA: schválena byla testovací sada Quant-iT Picogreen dsdna Sada MiSeq V2, 300 cyklů(illumina kat. č. MS102-2002) MiniSeq, sada činidel se středními výstupy, cyklus 300 (Illumina cat# FC-420-1004) Přesná metoda/sada/přístroj pro kvantifikaci knihovny: jak schváleny byly, sada KAPA Library Quantification Kit a fluorometr Quibit POKYNY K POUŢITÍ Pokus pro 24 vzorků je moţné provést prostřednictvím manuálního protokolu popsaného níţe. Podrobné manuální protokoly k pokusu pro 8, 16 nebo 24 vzorků a automatizovaný protokol pro 24 vzorků s vyuţitím Biomek 4000 jsou k dispozici u vašeho odborného prodejce produktů Immucor. POZNÁMKY: Zvýšené opatrnosti dbejte během rozpipetovávání vzorku na potřebné díly (alikvotace). Pouţijte kalibrované pipety. V opačném případě hrozí ztráta činidla a selhání pokusu. Všechny teploty je nutné přesně dodrţovat. Magnetické kuličky přeneste před pouţitím do místnosti s pokojovou teplotou. Amplifikované produkty je možné uchovávat až 4 dny před použitím při -20ºC. Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování může mít za následek poškození amplifikovaného produktu a vést k chybným výsledkům určeným ke konstrukci knihovny. A. Purifikace genomické DNA Pomocí zvolené metody proveďte purifikaci genomické DNA. Vzorek DNA musí splňovat následující poţadavky: Vzorky genomické DNA musejí být získány extrakcí z plné krve nebo z buffy coat pomocí takové metody izolace DNA, která je schopná poskytnout DNA o vysoké molekulární hmotnosti. DNA musí být zředěna vodou bez obsahu nukleázy a uskladněna při teplotě -20 o C a méně. Výsledná koncentrace DNA by měla být v rozsahu 5-15 ng/µ, přičemţ všechny vzorky by měly mít stejnou koncentraci. V případě potřeby doplňte vodou bez obsahu nukleázy. Alespoň 50 % extrahovaných fragmentů genomické DNA by mělo mít velikost 10 kb a více, aby byla zajištěna úspěšná PCR o odpovídající délce. Strana 5 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
B. Amplifikace DNA (PCR) Příprava PCR 1. Vyplňte soubor s čárovými kódy vzorků (soubor Windows s hodnotami oddělenými čárkou (csv soubor) obsahující názvy vzorků a přidělené čárové kódy, jak můţete vidět na obrázku 1. Obr. 1. Příklad souboru s čárovými kódy vzorků 2. V softwaru MIA FORA vytvořte soubor s čárovými kódy vzorků s názvy vzorků a čárovými kódy a poté vytvořte samotný projekt. Název projektu budete potřebovat k označení běhu sekvencera. 3. Pomocí štítků označte tři tvrdé polokryté PCR destičky s 96 jamkami. 4. Připravte destičku na vzorky se 100 µl genomické DNA na jednu jamku pro vzorek o koncentraci 5-15 ng/µl po naředění vodou bez obsahu nukleázy. Vzorek by měl být seřazen do sloupců 1, 2 a 3 na destičce s 96 jamkami, jak je znázorněno na obrázku 2. Jamka A1 s 10 mm Tris-HCl ph 8,0 slouţí pro negativní kontrolu (NTC) a neobsahuje DNA, následuje vzorek 1 v B1, vzorek 2 v C1 atd. aţ do vzorku 23 v H3 (obr. 2, DESTIČKA SE VZORKY). 5. Rozmrazte PCR master mixy (P1-P9), promíchejte inverzí nebo krátce odstřeďte a nechte ustálit. 6. Odstřeďte destičku se vzorky od kroku 4 v odstředivce se stojanem na destičky po dobu 2 min tak, aby se genomická DNA nacházela na dně jamky. 7. Rozdělte 15 µl PCR mixů P1-P9 do sloupců 1-9 na kaţdé ze tří tvrdých polokrytých destiček s 96 jamkami tak, aby kaţdá z jamek daného sloupce obsahovala stejný PCR mix (obr. 2). 8. Při rozdělování buďte opatrní a zabraňte tvoření bublin v PCR master mixu. 9. Vzorky z destičky rozdělujte pomocí multikanálové pipety dle níţe uvedeného postupu (obr. 2): Sloupec 1 z destičky se vzorkem: 10 µl NTC a vzorky 1-7 ze sloupce 1 (A1-H1) do kaţdého z devíti sloupců PCR destičky 1. Sloupec 1 z destičky se vzorkem: 10 µl vzorků 8-15 ze sloupce 2 (A2-H2) do kaţdého z devíti sloupců PCR destičky 2. Sloupec 1 z destičky se vzorkem: 10 µl vzorků 16-23 ze sloupce 3 (A3-H3) do kaţdého z devíti sloupců PCR destičky 3. POZNÁMKA: vzorky je nutné promíchávat velmi jemně, aby nedošlo k tvoření bublin v PCR master mixu, viz obr. 2. 10. Utěsněte PCR destičky pomocí přilnavého PCR filmu. Krátce PCR destičky odstřeďte, umístěte do 3 různých termocyklerů a spusťte program MIA FORA HLA_PCR s vyhřívaným víkem, viz. tab. 1. BEZPEČNÉ OBDOBÍ Produkty PCR je moţné skladovat při teplotě -20ºC aţ 4 dny, dokud nebude zahájeno vyrovnávání genů. Strana 6 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
Obr. 2. Uspořádání vzorků a systém PCR Tab. 1. Podmínky termocykleru pro účely amplifikace Cykly (15) Cykly (20) Spuštění Denaturace Chlazení Prodlouţení Denaturace Chlazení Prodlouţení Konečné prodlouţ. Drţení 94 0 C/30s 94 0 C/1:15m 60 0 C/30s 66 0 C/7:30m 94 0 C/1:15m 60 0 C/30s 66 0 C/7:30m 66 0 C/10m 4 0 C/ 11. Nepovinné: Amplifikaci je moţné ověřit pomocí několika reprezentativních vzorků na 0,8% agarózovém gelu s obsahem ethidium bromidu nebo gel red. Elektroforéza by měla probíhat při 90 voltech po dobu 40 minut. Fragmenty PCR se mohou u jednotlivých vzorků lišit, coţ je způsobeno rozdíly mezi introny. Přibliţné velikosti produktů PCR jsou uvedeny v tabulce 2. Tab. 2: Velikosti produktů amplifikace Lokus HLA Velikost (kb) HLA-A 3,2 HLA-B 4,1 HLA-C 4,4 HLA-DPA 5,0 HLA-DPB 5,2 HLA-DQA 5,8 HLA-DQB 6,3 HLA-DRB1 0,9 HLA-DRB2 5,6 C. Vyrovnávání a slučování produktů PCR Koncentrace jednotlivých produktů PCR můţe být stanovena pomocí vhodného fluorescenčního činidla pro kvantifikaci DNA, jako je PicoGreen. V závislosti na fluorescenčním měření jsou produkty PCR ze všech devíti PCR reakcí pro jednotlivé vzorky vyrovnávány a slučovány v souladu s výstupem ze SironaQuant TM, k dispozici v systému MIA FORA NGS HLA. Sloučené vzorky jsou poté čištěny v rámci přípravy na fragmentaci. Strana 7 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
Vyrovnávání a slučování Obr. 3. Příprava pokusu PicoGreen 1. Proveďte kvantifikaci produktů PCR pomocí činidla PicoGreen : Uveďte činidlo Bring PicoGreen na pokojovou teplotu a rozřeďte pomocí pufru 1X TE (50 µl PicoGreen + 7450 µl 1xTE). Promíchejte a chraňte před světlem aţ do pouţití. Poznámka: Pokud pro PCR kvantifikaci pouţijete jiná činidla, respektujte postup uvedený v příslušném příbalovém letáku. 2. Připravte sériově ředěné standardy v mikrocentrifugačních zkumavkách pomocí 100 ng/µl kontroly dodané se sadou PicoGreen. Rozdělte 20 µl kaţdého standardu do PicoGreen jamek A10-E12 destičky 1 (černé, plně kryté měřicí destičky) podle obr. 3. Přeneste 20 µl pufru 1xTE do jamek F10, F11, F12 destičky PicoGreen 1 podle obr. 3. 3. Přidejte 20 µl naředěného PicoGreen do kaţdé jamky všech tří destiček PicoGreen, včetně jamek standardu na destičce 1 podle obr. 3. 4. Přidejte 19 µl pufru 1xTE do tří destiček PicoGreen ve stejném formátu jako destičky PCR. Přidejte 1 µl PCR produktu do tří destiček PicoGreen, aby rozloţení odpovídalo původním PCR destičkám a bylo získáno ředění 1:20 PCR produktů. Konečný objem je 40 µl ve všech měřených jamkách. 5. Odstřeďte destičku a inkubujte při pokojové teplotě po dobu alespoň 5 minut. Během inkubace chraňte destičky před světlem. 6. Změřte fluorescenci s filtrem s excitací ~ 485 nm/emise ~535 nm, 0,1 s (Victor X3) 7. Výsledný soubor uloţte podle níţe uvedeného stanoveného názvosloví: (Pozn: Pro Windows pouţijte Text Tab Delimited, pro MacOS: formátovaný text Windows). Projekt_SLOUPEC1_datum.txt (např. ProjektX_SLOUPEC1_123115.txt) Projekt_SLOUPEC2_datum.txt (např. ProjektX_SLOUPEC2_123115.txt) Projekt_SLOUPEC3_datum.txt (např. ProjektX_SLOUPEC3_123115.txt) Spusťte vyrovnávací program SironaQuant v softwaru MIA FORA. Doporučená hodnota je mezi 0,0035 a 0,0009 pmol. 8. Promíchejte PCR destičky a umístěte štítek na novou destičku pro následující krok, označenou Projekt_sloučené PCR_datum. 9. Před sloučením rozřeďte produkty PCR z kaţdého lokusu pufrem 10 mm Tris HCl ph 8,0 podle výstupu SironaQuant. 10. Sjednoťte produkty PCR ze všech 9 PCR reakcí pro jednotlivé vzorky přenesením objemů uvedených ve výstupu SironaQuant. 11. Utěsněte destičky a uskladněte je při -20ºC, pokud nehodláte ihned zahájit proces čištění. 12. Uveďte magnetické kuličky na pokojovou teplotu a spirálovým pohybem promíchejte směs kuliček, aby se všechny rovnoměrně rozpustily. 13. Přidejte 55 µl kuliček do kaţdé jamky sjednocených vzorků. Důkladně promíchejte DNA a kuličky opakovaným pipetováním (alespoň 10x). 14. Inkubujte směs kuliček DNA při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Na 5 minut přeneste destičku na magnet. 15. Opatrně odstraňte supernatant, aniţ byste narušili kuličky, zatímco je destička na magnetu. 16. Nechte destičku na magnetu pro účely promývací etanolové fáze. Přidejte 200 µl čerstvě naředěného 80% etanolu do kaţdé jamky a inkubujte 30 sekund, poté opatrně odstraňte etanol. 17. Ještě dvakrát proveďte promývání etanolem (celkem 3 promývání). Po třetím promývání odstraňte všechny stopy etanolu. 18. Sejměte destičku z magnetu a nechte kuličky usušit na vzduchu. Magnetické kuličky by měly mít skleněný povrch bez stop po kapalině. Vhodný čas sušení lze vypočítat empiricky v kaţdém laboratorním prostředí (5-10 minut). 19. Do kaţdé jamky přidejte 35 µl 10 mm Tris-HCl ph 8,0 o pokojové teplotě. Důkladně promíchejte pipetováním a inkubujte 5 minut. 20. Umístěte destičku na magnet a inkubujte 5 minut, dokud nebude roztok čirý. 21. S destičkou stále na magnetu přeneste 30 µl eluátu do nové PCR destičky s 96 jamkami označené: Projekt_vyrovnané_promyté_datum. Strana 8 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
BEZPEČNÉ OBDOBÍ Sloučené a promyté vzorky je moţné skladovat při -20ºC aţ 4 dny, dokud nebudou pouţity k fragmentaci. D. Konstrukce sekvenční knihovny a. Fragmentace 1. Předtím, neţ přikročíte k bodu 8, nastavte laboratorní časovač na 20 minut. 2. Rozdělte 20 ul stop pufru ze zkumavky 12 do všech jamek ve sloupci 11 nové destičky s 96 jamkami označené jako fragmentační destička. 3. Připravte fragmentační master mix přenesením 134 µl ze zkumavky 11 (fragmentační pufr) do zkumavky 10 (fragmentační enzym). Důkladně promíchejte krouţivým pohybem a krátce odstřeďte. 4. Rozpipetujte 23 µl fragmentačního master mixu připraveného během kroku 3 do kaţdé jamky ve sloupci 12 a vytvořte sloupec se zásobou master mixu. 5. Ze sloupce 12 přeneste 6 µl fragmentačního master mixu do kaţdé jamky ve sloupcích 1, 2 a 3 fragmentační destičky. 6. Přeneste 14 µl vzorku ze sloupce 1 sloučené destičky s promytými kuličkami z předchozí sekce (Projekt_vyrovnané_promyté_datum) do sloupce 1 fragmentační destičky. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x). 7. Přeneste 14 µl vzorku ze sloupce 2 sloučené destičky s očištěnými kuličkami z předchozí sekce (Projekt_vyrovnané_promyté_datum) do sloupce 2 fragmentační destičky. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x). 8. Přeneste 14 µl vzorku ze sloupce 3 sloučené destičky s očištěnými kuličkami z předchozí sekce (Projekt_vyrovnané_promyté_datum) do sloupce 3 fragmentační destičky. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x). 9. SPUSŤTE ČASOVAČ a inkubujte při pokojové teplotě po 20 minut. Délka reakce nesmí v žádném případě překročit 20 minut. 10. Po 20 minutách inkubace ihned přeneste 5 µl STOP pufru ze sloupce 11 do sloupců 1, 2 a 3 a důkladně promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x) po kaţdém přidání. 11. Rozpipetujte 200 µl magnetických kuliček ohřátých na pokojovou teplotu do všech jamek sloupce 10 fragmentační destičky se vzorkem, nebo do čisté PCR-prouţek zkumavky. 12. Ze sloupce 10 přidejte 40 µl magnetických kuliček do všech jamek s fragmentovanou DNA a pomalu promíchejte pipetováním nahoru a dolů (10x). Inkubujte směs kuliček DNA při pokojové teplotě po dobu 10 minut. 13. Přeneste destičku na 5 minut na magnet, aby se kuličky nalepily na stěny jamek, a pomocí pipety opatrně odstraňte supernatant. 14. Destičku nechte na magnetu pro promývání etanolem. Kaţdou jamku propláchněte 200 µl 80% etanolu, inkubujte 30 sekund a opatrně odstraňte tekutinu pomocí multikanálové pipety, aniţ by došlo k narušení kuliček. 15. Opakujte krok promývání etanolem, celkem tedy proběhnou 2 promývání. 16. Sejměte destičku z magnetu a nechte uschnout na vzduchu, aby se odpařil nadbytečný etanol a povrch magnetických kuliček získal skleněný vzhled. 17. Sejměte destičku z magnetu. Ke kuličkám přidejte 20 µl 10 mm Tris-HCl pufru ph 0,8 zahřátého na pokojovou teplotu, promíchejte pipetováním a inkubujte 5 minut mimo magnet. 18. Umístěte destičku na magnet a inkubujte 5 minut. 19. Přeneste 15 µl eluátu do nové tvrdé PCR destičky s 96 jamkami označené Projekt_fragmentované_promyté_datum a destičku utěsněte. Vzorky jsou nyní připraveny ke koncové opravě. BEZPEČNÉ OBDOBÍ Fragmentované a pročištěné vzorky je moţné skladovat při teplotě -20 C aţ do zahájení koncové opravy. Při teplotě -20 C je moţné bezpečně skladovat pevně utěsněné a důkladně promyté destičky aţ 4 dny. b. Oprava konců 1. Znovu označte předem fragmentovanou a očištěnou destičku Projekt_oprava konců_datum. 2. Připravte master mix pro opravu konců přidáním 136 µl ze zkumavky 14 (pufr pro opravu konců) do zkumavky 13 (enzym pro opravu konců), promíchejte spirálovým pohybem a krátce odstřeďte. 3. Rozpipetujte 18,5 µl master mixu pro opravu konců připraveného během kroku 1 do sloupce 12 destičky pro opravu konců, označené jako Projekt_oprava konců_datum, a vytvořte tak zásobní sloupec. 4. Ze sloupce 12 přeneste 5 µl End Repair master mixu do sloupců 1, 2 a 3 vyrovnané, fragmentované a promyté DNA označené Projekt_fragmentované_promyté_datum, připravené v předchozí části, a promíchejte pipetováním (5x). 5. Utěsněte destičku přilnavým PCR filmem a krátce odstřeďte, aby se veškerá kapalina dostala na dno jamky. 6. Umístěte destičku pro opravu konců, označenou jako Projekt_oprava konců_datum do termocykleru a spusťte program opravy konců MIA FORA, jak je znázorněno v tabulce 3. 7. Destičku uchovejte při teplotě -20 C aţ do přikročení k přidání poly-a konce. Strana 9 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
Tab. 3: Program termocykleru pro opravu konců Oprava konců MIA FORA 20 C po 30 min 70 C po 10 min 4 C drţení c. Přidání poly-a konce 1. Připravte master mix pro přidání poly-a konce přidáním 85 µl ze zkumavky 16 (pufr pro přidání poly-a konce) do zkumavky 15 (enzym pro přidání poly-a konce), promíchejte spirálovým pohybem a krátce odstřeďte. 2. Rozpipetujte 12 µl master mixu pro přidání poly-a konce připraveného během kroku 1 do sloupce 11 na destičce s opravenými konci a vytvořte zásobní sloupec. 3. Ze sloupce 11 přeneste 3 µl master mixu pro přidání poly-a konce do všech jamek ve sloupcích 1, 2 a 3 na destičce s opravenými konci označené Projekt_oprava konců_datum z předchozí sekce a promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x). Destičku označte Projekt_poly-A konec_datum 4. Umístěte destičku do termocykleru a spusťte program MIA FORA pro přidání poly-a konců podle tabulky. 5. IHNED PŘEJDĚTE K LIGACI ADAPTORU (do 30 minut). d. Ligace adaptoru Tab. 4: Program termocykleru pro přidání poly-a konců MIA FORA poly-a 37 C po 30 min 75 C po 20 min 4 C drţení 1. K manipulaci s destičkou s adaptorem pouţijte nové rukavice. Před odstraněním těsnícího filmu destičku krátce protřepte. Opatrně sejměte film z destičky s adaptorem. Zkontrolujte, zda jamky ve sloupcích 1, 2 a 3 obsahují cca 5 µl roztoku. 2. Připravte ligázový master mix přidáním 850 µl ze zkumavky 18 (ligázový pufr) do zkumavky 17 (ligázový enzym), promíchejte spirálovým pohybem a krátce odstřeďte. 3. Rozpipetujte 95 µl ligázového master mixu připraveného během kroku 2 do sloupce 10 destičky pro přidání poly-a konce označené Projekt_poly-A konec_datum z předchozí části a vytvořte zásobní sloupec. Destičku označte Projekt_ligace_datum. 4. Ze sloupce 10 přeneste 26 µl ligázového master mixu do všech jamek ve sloupcích 1, 2 a 3 destičky pro přidání poly-a konce a promíchejte pipetováním nahoru a dolů (alespoň 5x). 5. Přeneste 2,5 µl adaptoru do příslušných jamek na ligační destičce. 6. Důkladně promíchejte a utěsněte destičku PCR filmem. Krátce odstřeďte. 7. Umístěte ligační destičku do termocykleru a spusťte ligační program MIA FORA podle tabulky 5. e. Sjednocení produktů ligace adaptoru Tab. 5: Program termocykleru pro ligaci adaptoru Ligace MIA FORA 25 C po 30 min 65 C po 10 min 4 C drţení 1. Doplňte 20 µl z kaţdé jamky na destičce Projekt_ligace_datum z předchozí sekce do jedné 1,5 ml zkumavky typu Eppendorf. Zkumavku označte Projekt-datum-sjednoceno. 2. Přidejte 865 µl magnetických kuliček do mikrocentrifugační zkumavky označené Projekt-datum-sjednoceno. Důkladně promíchejte spirálovým pohybem. Inkubujte po dobu 10 minut. 3. Umístěte zkumavku na magnetický stojan, dokud nebude roztok zcela čirý. Odstraňte supernatant. 4. Nechte zkumavku na magnetu a přidejte 1 ml 80% etanolu a inkubujte 30 sekund. Odstraňte 80% etanol, aniţ byste narušili uchycené kuličky. 5. Opakujte čištění etanolem (krok 4), celkem tedy proběhnou 2 promývání. Odstraňte ze zkumavky co největší moţné mnoţství etanolu. 6. Sejměte zkumavku z magnetického stojanu a nechte kuličky usušit na vzduchu po dobu 5-10 minut, dokud povrch magnetických kuliček nezíská skleněný povrch. 7. Kuličky znovu umístěte do 63 µl 10 mm Tris-HCl ph 8,0 o pokojové teplotě. Spirálovým pohybem promíchejte a inkubujte 5 minut. 8. Umístěte zkumavku na magnet, dokud roztok nezíská čirý vzhled, a přeneste 60 µl eluátu obsahujícího vyčištěné vzorky adaptoru po ligaci do čisté mikrocentrifugační zkumavky. BEZPEČNÉ OBDOBÍ Strana 10 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
Sloučené a pročištěné vzorky adaptoru po ligaci (knihovna) je moţné skladovat při -20 C aţ do přistoupení k výběru velikosti po dobu aţ 4 dny. f. Výběr velikosti a amplifikace knihovny po výběru velikosti (Pippin Prep TM ) POZN.: Amplifikovaná knihovna by měla být pročištěna 1 hodinu od amplifikace. 1. Pomocí odpovídající metody proveďte výběr velikosti v knihově a izolujte fragmenty, cca 400-500 párů bází. Pokud pouţijete jiný produkt, neţ Pippin Prep, dodrţujte příslušný návod. 2. Smíchejte 30 µl z knihovny s 10 µl odpovídajícího markeru a umístěte do jednoho pruhu kazety Pippin. 3. Vytvořte a spusťte program pro výběr knihovny s velikostí fragmentů v rozmezí 400-500 bp. 4. Rozmrazte amplifikační moduly ze sady (knihovny), zkumavky 19, 20 a 21, a proveďte následující postup v PCR-prouţek zkumavce 0,2 ml: Smíchejte 25 µl amplifikační směsi ze zkumavky 19, 2 µ primerů ze zkumavky 20, 18 µl vody bez nukleázy ze zkumavky 21 a 5 µl eluátu vybrané velikosti. 5. Jemně promíchejte a nechte ustálit. Umístěte do termocykleru a amplifikujte s PCR knihovnou MIA FORA podle tabulky číslo 6. Tab. 6: PCR knihovna MIA FORA Cyklus (1) Cykly (12) Cyklus (1) Počáteční drţení Denaturace Chlazení Prodlouţení Konečné prodl. Drţení 98 0 C/30s 98 0 C/15s 65 0 C/30s 72 0 C/30 s 72 0 C/5m 4 0 C/ E. Příprava sekvenování POZNÁMKA: Všechny kroky po amplifikaci provádějte ve vyhraněné části laboratoře a pokud moţno pouţijte PCR kryt, abyste zabránili kontaminaci pracovní plochy a sekvenačních činidel. 1. Přeneste 50 µl amplifikované knihovny do mikrocentrifugační zkumavky. Přidejte do knihovny 50 µl magnetických kuliček ohřátých na pokojovou teplotu. Důkladně promíchejte a inkubujte 10 minut. 2. Po 10 minutách umístěte zkumavku do magnetického stojanu, dokud nezíská roztok čirý vzhled, cca 5-8 min. Odstraňte supernatant. 3. Stále na magnetickém stojanu přidejte 200 µl 80% etanolu a inkubujte 30 sekund. Odstraňte 80% etanol, aniţ byste narušili kuličky. 4. Opakujte promývání etanolem (krok 3), celkem proveďte 2 promývání. Odstraňte ze zkumavky tolik etanolu, kolik můţete. 5. Sejměte zkumavku z magnetického stojanu a nechte kuličky oschnout na vzduchu po dobu 5-10 minut, dokud povrch kuliček nezíská skleněný vzhled. 6. Znovu rozpusťte kuličky v 17 µl 10 mm Tris-HCl ph 8,0. Promíchejte spirálovým pohybem a inkubujte 5 minut. 7. Umístěte zkumavku na magnet, dokud nebude roztok čirý, a přemístěte 15 µl eluátu obsahujícího vyčištěnou amplifikovanou sekvenační knihovnu do čisté mikrocentrifugační zkumavky. BEZPEČNÉ OBDOBÍ Promyté vzorky mohou být uschovány při teplotě -20ºC aţ po dobu 4 dnů. 8. Stanovte koncentraci knihovny pomocí metod schopných poskytnout přesné měření koncentrace DNA. Immucor doporučuje buďto metodu qpcr nebo Qubit, které jsou schopné odhadnout koncentraci knihovny. 9. Kvůli charakteru sekvencera by koncentrace sekvencované knihovny měla být vyšší neţ 10 nm. Distribuce velikosti můţe být stanovena pomocí elektroforézy agarózového gelu či jiného systému kapilární elektroforézy za účelem ověření velikosti výsledných knihoven. 10. Rozřeďte knihovnu na 4 nm a poté připravte 10 nm (Quibit) nebo12 pm (qpcr) denaturované knihovny pro sekvenování pomocí MiSeq a 1,3pM (Qubit) denaturované knihovny pro sekvenovaní pomocí MiniSeq. V případě potřeby můţe být do knihovny přidána kontrola s 5% PhiX. 11. Umístěte denaturovanou knihovnu do kazety a spusťte sekvencer. 12. Postupujte podle pokynů Illumina pro sekvenování knihovny. Ujistěte se, ţe název souboru v listu vzorků odpovídá názvu projektu vygenerovanému během přípravy na dlouhé dosah PCR. F. Analýza dat Soubory fastq vygenerované pomocí nástroje sekvenování by měly být analyzovány prostřednictvím softwaru MIA FORA k vygenerování typu HLA. List se vzorky a příslušnými názvy a čárovými kódy, včetně příslušných souborů fastq, by měl být nahrán do projektového souboru softwaru MIA FORA. Při pouţívání softwaru MIA FORA dodrţujte návod pro uţivatele softwaru. VÝSLEDKY 1. Amplifikace PCR: Analýza agarózového gelu by neměla vykázat ţádný produkt v negativní (NTC) kontrole pro platný běh. Agarózový gel amplifikovaných produktů můţe vykazovat nejednotnosti ve velikosti, způsobené rozdíly v intronických sekvencích. Přibliţné velikosti prouţků naleznete v tabulce 2. 2. Příprava knihovny: Strana 11 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
Sada by měla vygenerovat knihovnu, jakmile bude hladina vstupní DNA v SironaQuant v rozsahu 0,0009 a 0,0035 pmol. Konečná koncentrace knihovny by měla být alespoň 10 nm a měla by být přesně kvantifikována před sekvenováním. Knihovny by měly být před denaturací naředěny na 4 nm. Shlukování (clustering) v sadách MiSeq a sadách MiniSeq se můţe různit v závislosti na přesnosti kvantifikace. Běţná hustota clusterů v knihovnách 8-12 pm se nachází v rozmezí 600-800 K/mm 2 pro MiSeq a 160-220 K/mm2 pro MiniSeq. Je nezbytně nutné provést přesnou kvantifikaci knihovny. Všechny produkty vzniklé po ligaci adaptoru musejí být umístěny do PCR krytu nebo do zvláštního prostoru, a všechna ředící činidla musejí být vždy čerstvě připravena, aby bylo zabráněno kontaminaci. 3. Typ HLA je vygenerován prostřednictvím softwaru MIA FORA NGS a je uveden ve zprávě. Dodrţujte pokyny uvedené v návodu pro uţivatele softwaru MIA FORA pro analýzu typu HLA. KONTROLA KVALITY Pro kaţdý test doporučujeme pouţít jednu negativní kontrolu a jednu známou (volitelnou) kontrolu, např. čistou vodu a předem stanovený vzorek. Zvýšené opatrnosti je třeba dbát při odstraňování těsnících filmů z destiček, destičky je před otevřením nutné protřepat. Pro kaţdý nový krok je nutné pouţít nový těsnící film. Pouţité pipetovací špičky je nutné umístit do vhodných nádob a zlikvidovat. Příprava na PCR musí proběhnout v místnosti vyčleněné pro postupy před PCR, mimo prostor, ve kterém probíhá manipulace s amplifikovanými produkty. Veškerá genomická DNA musí být ředěna vodou bez nukleázy. Po výběru velikosti a amplifikaci DNA je nutné provádět manipulace s amplifikovanou knihovnou v odděleném prostoru, nejlépe v PCR krytu, a pomocí oddělené sady pipet. Při všech postupech je třeba dbát zvýšené opatrnosti a zabránit kontaminaci pracovních ploch s amplifikovanými knihovnami. Pokus by měl proběhnout v souladu s postupy doporučenými v tomto příbalovém letáku a pomocí jiných postupů kontroly kvality, které jsou v souladu s místními, státními a federálními poţadavky, anebo s poţadavky akreditačních úřadů. OMEZENÍ POSTUPU 1. PCR a pokus popsaný v tomto příbalovém letáku vyţadují přesně kontrolované podmínky. Odchýlení se od ověřených parametrů můţe mít za následek znehodnocení produktu. 2. Je-li alespoň 50% původních fragmentů DNA menších neţ 10 kb, nemusí být vytvořeno dostatečné mnoţství PCR s dlouhými vzdálenostmi. 3. Je-li konečná koncentrace knihovny niţší neţ 10 nm, nemusí být generovány přesné výsledky sekvenování. 4. Kvůli nedostatku pokrytí v intronové oblasti budou pozorovány nejasnosti ve 4. poli. 5. Přísady PCR mixu mohou narušit běţné netoxické alternativy ethidium bromidu pouţívané při elektroforéze agarózového gelu a mohou mít za následek slabou intenzitu prouţků. 6. Zelené agarózové gely SYBR nefungují s PCR produkty. K vizualizaci PCR produktů by měl být pouţit ethidium bromid nebo GelRed. 7. DPB1 primer neamplifikuje exon 1 a exon 5. Z toho důvodu nebude sekvenován ţádný známý polymorfismus v těchto exonech a ve zprávě bude uveden jako nejasný. 8. Nedostatek genomických referenčních sekvencí pro DPB1 a nízké hladiny polymorfismu v intronu 2 (mezi exony 2 a 3) komplikuje provedení analýzy fázování pro heterozygotní vzorky. To můţe vést k nejasnosti v genotypu, kterou nelze vyřešit. 9. Forward primery pro DPB1 se překrývají s prvními základnami na exonu 2. Z toho důvodu nebude polymorfismus v těchto sekvencích identifikován sekvenováním. 10. DRB lokusy jsou amplifikovány jako dva fragmenty jeden amplifikuje exon 1 a druhý amplifikuje exony 2 aţ 6. Intron 1 není amplifikován v celém svém rozsahu. Fázování celého lokusu proto není moţné pro DRB1/3/4/5 a a případné polymorfismy přítomné v Intronu 1 budou mít za následek nejasnosti ve 4. poli. 11. Reverzní primer pro DRB exony 2 aţ 6 se překrývá s 3 -koncem exonu 6 a z toho důvodu nebude v těchto sekvencích polymorfismus determinován sekvenováním. 12. Ve většině případů produkty amplifikace exonu 1 DRB1/3/4/5 špatně mapují exon 1 ze známých referenčních sekvencí DRB5. Z tohoto důvodu, nebude pravděpodobně generován kontig pro exon 1 pro DRB5. Vzhledem k tomu, ţe nejsou známy ţádné polymorfismy exonu 1 pro DRB5, situace nevede k ţádné dvojznačnosti v typizaci HLA pro DRB5. 13. Z důvodu sloţité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál. ZVLÁŠTNÍ CHOVÁNÍ Klinické studie byly provedeny ve třech laboratořích s cílem vyhodnocení výkonu typizační sady MIA FORA NGS HLA. Výsledek pokusu byl porovnán s předchozí typizací, ve které byla tam, kde to bylo moţné, uplatněna typizace sekvenací (SBT) s vysokým rozlišením, a tam, kde to moţné nebylo, typizace s nízkým rozlišením. Vzorky byly vybrány testovacími laboratořemi tak, aby zastupovaly různé sady typů HLA, které se vyskytují v běţných postupech. Ve třech laboratořích bylo testováno celkem 206 vzorků ve 3 bězích, pro kaţdý byly pouţity dvě sady činidel. Typizace HLA byla provedena pro lokusy HLA-A, -B, -C, DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1 a -DRB 1/3/4/5. Celkem bylo v rámci těchto 206 vzorků vyhodnoceno 3 692 alel. Výsledky prokázaly, ţe typy HLA získané testováním pomocí MIA FORA bez přetestování neúspěšných a neodpovídajících lokusů, představovaly 99,34 %. Po přetestování neúspěšných a neodpovídajících lokusů byla celková shoda 99,74 %. Tab. 8: Shrnutí celkové shody Laboratoř Počet vzorků Počet testovaných lokusů Počet alel k rozboru shody Shoda po novém testování Lab. 1 68 748 1223 1220 (99,75 %) Lab. 2 69 759 1064 1063 (99,91 %)* Lab. 3 69 759 1241 1236 (99,59 %) *V této laboratoři neproběhlo přetestování. Jeden lokus DQB1 vykazoval nedostatečné údaje. Strana 12 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
Tab. 9: Shrnutí klinických testů podle jednotlivých lokusů Lokusy HLA Výchozí shoda Shoda po novém testování** HLA-A 100,00 % 100,00 % HLA-B 99,76 % 99,76 % HLA-C 99,51 % 100,00 % DPA1 99,72 % 100,00 % DPB1 99,44 % 99,72 % DQA1 99,26 % 100,00 % DQB1 98,48 % 99,27 % DRB1 98,54 % 99,03 % DRB3/4/5 99,43 % 100,00 % Celkem 99,34 % 99,74 % **Součástí přetestování byly případy označené ke kontrole, které nemohly být vyřešeny manuální inspekcí údajů. Přetestovány byly také případy, které nebylo moţné realizovat z důvodu nedostatečných údajů (11/1854 amplifikací). Pozn.: Podrobné informace o chování získáte na čísle 1-888-329-0255 společnosti Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Strana 13 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PROBLÉM MOŢNÁ PŘÍČINA ŘEŠENÍ Nepřítomnost prouţků na gelu po amplifikaci PCR Vícečetné nebo skvrnité prouţky po PCR amplifikaci Nízké hodnoty fluorescence pro všechny lokusy Nesprávný výběr velikosti DNA Kvalita či kvantita DNA Podmínky termocykleru Činidlo PicoGreen Pipetovací nástroj Poměr OD 260/280 menší neţ 1,65 Proveďte nové čištění DNA a zbavte se nečistot. Fragmentovaná DNA Nejméně 50 % DNA musí být větší neţ 10 Kb Proveďte novou extrakci DNA ze vzorku. DNA naředěná Tris-HCl nebo TE Vzorky řeďte vodou. Nízká koncentrace DNA v šabloně s Ujistěte se, ţe je koncentrace DNA 50-150 ng/reakci. Pokud jsou prouţky na agarózovém gelu z důvodu oslabené V agarózovém gelu byly pouţity alternativy fluorescence způsobené sloţením PCR mixu příliš slabé, ethidium bromidu pouţijte ethidium bromid. Opakujte PCR za pouţití zbytků činidel (potřebná dávka pro Výpadek amplifikace 4 vzorky). Zbytky činidel uskladněné při 2-8 o C jsou stabilní jeden týden. Rampová frekvence Ujistěte se, ţe pouţité rampové frekvence odpovídají hodnotám uvedeným v protokolu. Teplota Proveďte kalibraci PCR stroje a zkontrolujte výkon strojů. Kvalita DNA Ujistěte se, ţe je DNA naředěna vodou a není kontaminována. Vybělené snímky s činidlem PicoGreen Dodrţujte pokyny výrobce. Činidlo nesmí být vystaveno světlu. Nesprávné ředění činidla Nařeďte činidlo PicoGreen podle pokynů. Nesprávné ředění standardů Zkontrolujte profil promývání a ujistěte se, ţe promývání proběhlo bez chyb Nesprávná kalibrace nástroje Nařeďte standardy podle pokynů. Konzultujte oddíl řešení problémů Sage Science a vyhodnoťte, zda výkon nástroje odpovídá specifikacím. Pouţijte 2 µl 1 kb plus ladder (ThermoFisher) s cvičným protokolem se 400-600 páry bází. Pouţijte 15 µl naředěného produktu na agarózovém gelu a zobrazte ředění fragmentu 500 bp. qpcr R 2 < 0,95 Nízká koncentrace amplifikované knihovny Clustering MiSeq menší neţ bylo očekáváno Opakované pouţití pipetovací kazety Pipetovací kazeta můţe být pouţita jen jednou. KAPA PCR Způsobeno jednou krajní hodnotou Proveďte analýzu bez krajní hodnoty. Čistota magnetických kuliček Kontaminace činidel Etanol nebyl zcela odstraněn Nevhodně uskladněné kuličky Etanol nebyl čerstvě připraven Opakujte KAPA PCR s čerstvými standardy. Etanol odstraňte, kdyţ jsou destičky na magnetickém stojanu. Odstraňte všechny stopy etanolu, zejména po konečném promývání. Kuličky uchovávejte při teplotě 2 aţ 8 C NEZMRAZUJTE Před kaţdým pouţitím je třeba připravit čerstvý 80% Etanol Doba sušení můţe záviset na okolní teplotě a vlhkosti. Přesušené kuličky Důkladně kuličky sledujte a zabraňte jejich přeschnutí, protokol upravte podle potřeby. Pouţita nesprávná koncentrace Tris-HCl Ujistěte se, ţe koncentrace pufru Tris-HCl je 10 mm a ph 8,0 Pippin Prep neředí DNA Chyba ve fragmentaci během ligace Nesprávná kvantifikace knihovny Zkontrolujte ředění před a po získání produktů ligace adaptoru Amplifikovaný produkt ztracen během čištění kuliček Problémy při fragmentaci Kapa qpcr Fluorometr Quibit Amplifikujte 1 µl vyčištěné sloučené knihovny před pippin s polovinou činidel pro amplifikaci knihovny. Pouţijte amplifikované produkty (purifikace není nutná) na 2% agaróze a stanovte přítomnost či nepřítomnost skvrn na fragmentu. Proveďte novou amplifikaci 5 µl ředění. Pokud je knihovna >25 nm, můţe být produkt vizualizován pomocí 5 µl na agarózovém gelu. Purifikujte 20 µl 2-3 ligovaných vzorků a NTC pomocí protokolu s 36 µl kuliček. Propláchněte produkt v 10 µl a zkontrolujte fragmentaci na 2% agarózovém gelu. Pokud nedojde k fragmentaci, volejte technickou podporu, kde se dozvíte, jak problém odstranit. Respektujte pokyny výrobce, respektujte stanovené ředění a zkontrolujte, zda je křivka standardu správná a hodnoty Ct se nacházejí v lineárním rozmezí křivky standardu. Postupujte podle pokynů výrobců a věnujte zvláštní pozornost ředění. Pouţívejte standardní čerstvě naředěné roztoky. V případě, ţe se vzorek vymyká ze standardní křivky činidel širokého spektra, opakujte s testem vysoké citlivosti. Činidla Illumina Problém s flow cell, nástrojem či činidlem Kontaktujte technickou podporu IIlumina, kde zjistíte, jak odstranit problémy s činidlem a nástrojem. Strana 14 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)
OMEZENÍ LICENCE DŮLEŢITÉ ČTĚTE POZORNĚ: Tato licenční smlouva o uţívání značky ( Smlouva ) je právní smlouva uzavřená mezi vámi (dále jen Drţitel licence ) a společností Immucor Transplant Diagnostics, Inc. ( Immucor ) (samostatně Strana a společně Strany ), o pouţívání činidel uvedených v tomto dokumentu ( Činidla ). Pouţitím činidel souhlasí drţitel licence s dodrţováním podmínek uvedených v tomto dokumentu. 1. Pouţití činidel drţitelem licence. Immucor poskytuje uţivateli licence neexkluzivní, nepřenosné právo pouţívat pouze poskytnuté mnoţství činidel výhradně v souladu s postupy stanovenými v přiloţeném štítku a s výhradou omezení uvedených v tomto dokumentu. Na drţitele licence není převedeno vlastnické právo na činidla. Immucor si ponechává veškerá práva, která nejsou výslovně udělena v tomto dokumentu, ţádné licence zde nejsou uděleny. 2. Vyloučené pouţití. Drţiteli licence není uděleno povolení k jinému pouţití činidel, neţ je pouţití uvedené v oddíle 1 této smlouvy. Konkrétně není uţivateli licence podle této smlouvy uděleno ţádné povolení k pouţívání činidel pro účely přenosu, prodeje, zveřejnění či jinému umoţnění přístupu k činidlům nebo produktu Mia Fora třetí straně. Drţitel licence nemá právo vytvářet deriváty činidel, ani udělit povolení třetí straně k přípravě či prodeji derivátů činitel. Drţitel licence bere na vědomí, ţe některá činidla a jejich pouţití podléhají patentům třetích stran a licence na jejich pouţití byla udělena společnosti Immucor. Drţitel licence nesmí pouţít činidla jiným způsobem, neţ který je uveden v tomto dokumentu. 3. Zneuţití činidel a náhrada škody. V rozsahu stanoveném zákonem bude drţitel licence hájit společnosti Immucor, její pobočky, manaţery, ředitele, vedoucí pracovníky, zaměstnance, sponzory a jednatele (souhrnně Odškodněné strany ) proti vystavení veškeré odpovědnosti, ztrátám, škodám, stíţnostem a výdajům, včetně poplatků za právní zastoupení (souhrnně Odškodněné ztráty ), vyplývající z této smlouvy, včetně a bez omezení odškodněných ztrát vyplývajících z jakéhokoli pouţití licence jménem drţitele. Drţitel licence bude hájit zájmy odškodněných stran proti všem odškodněným ztrátám vyplývajícím z této smlouvy a majícím vztah k porušení této smlouvy, a nároky třetí strany v případě, ţe drţitel licence nebo pouţití činidel drţitelem licence porušuje nebo zcizuje patenty, autorská práva, ochranné známky, obchodní tajemství či jiné duševní vlastnictví této třetí strany. 4. Tato smlouva se vztahuje výhradně na činidla. Veškeré pouţití softwaru Mia Fora je předmětem platné Licenční smlouvy uzavřené s koncovým uţivatelem. Tato smlouva bude vykládána a prosazována v souladu s právními předpisy státu New York ve Spojených státech amerických. V případě, ţe kupující není ochoten přistoupit na podmínky této smlouvy, je společnost Immucor ochotna přistoupit na vrácení produktu. INFORMACE O VÝROBCI Výrobce: Immucor, 35 Technology Drive, Suite 100, Warren, NJ 07059. Spojené státy americké Tel.: +1 (908) 226-8200, Fax: +1 (908) 226-0800 Autorizovaný zástupce: lmmucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32 63303 Dreieich, NĚMECKO Tel.: +49-607 4-84200, Fax: +49-607 4-842099 Technický servis pro Evropu: Tel.: +32 (0)3 385 47 91 Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: Rev. 2, 03. listopad 2016 POUŢITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY MIA FORA a SIRONAQUANT jsou obchodní značky Sirona Genomics, Inc. Agencourt a Ampure jsou registrované obchodní značky Beckman Coulter, Inc. Všechny ostatní obchodní značky jsou majetkem příslušných vlastníků. Strana 15 ze 15 LC1618CECS.2 (11/16)