Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta STANOVENÍ ANEUPLOIDIÍ CHROMOSOMU 13, 18, 21, X A Y U PLODU POMOCÍ KVANTITATIVNÍ FLUORESCENČNÍ PCR, POROVNÁNÍ METODY S KLASICKÝMI CYTOGENETICKÝMI METODAMI Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Iveta Valášková Autor: Kamila ĎURIŠOVÁ Brno, duben 2010

Jméno a příjmení autora: Kamila Ďurišová Název bakalářské práce: Stanovení aneuploidií chromosomu 13, 18, 21, X a Y u plodu pomocí kvantitativní fluorescenční PCR, porovnání metody s klasickými cytogenetickými metodami Pracoviště: Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Iveta Valášková Rok obhajoby bakalářské práce: 2010 Souhrn: Ve své práci se zabývám genetickými metodami uţívanými v prenatální diagnostice. První část je teoretická. Popisuje moţnosti prenatální diagnostiky, nejčastější chromozomální aneuploidie a zaměřuje se na popsání dvou genetických technik jak karyotypování, tak kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce. Praktická část se zaobírá popisem provedení QF-PCR od izolace DNA ze vzorku aţ po vydání výsledku a dále srovnáním obou genetických metod. Klíčová slova: prenatální diagnostika, kvantitativní fluorescenční-pcr, mikrosatelity Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. 2

Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Ivety Valáškové a uvedla v seznamu literatury všechny pouţité literární a odborné zdroje. V Brně dne 30.04.2010... 3

Tímto bych chtěla poděkovat své vedoucí RNDr. Ivetě Valáškové za ochotu obětovat čas a poskytnout mi cenné rady při psaní mé bakalářské práce, a dále paní Bc. Renátě Spěšné za moţnost prohlédnout si všechny laboratorní techniky zblízka. 4

OBSAH Seznam pouţitých zkratek... 7 TEORETICKÁ ČÁST... 8 1. Úvod... 8 2. Prenatální diagnostika... 9 2. Prenatální diagnostika... 9 2. 1. Odběr choriových klků... 10 2. 2. Odběr plodové vody... 11 3. Chromozomové aneuploidie... 12 3. 1. Downův syndrom... 12 3. 2. Edwardsův syndrom... 13 3. 3. Patauův syndrom... 13 3. 4. Turnerův syndrom... 13 3. 5. Superfemale... 14 3. 6. Supermale... 14 3. 7. Klinefertelův syndrom... 15 3. 8. Mozaicismus... 15 4. Spontánní aborty... 17 5. Klasické cytogenetické metody... 18 6. Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce... 20 6. 1. Genetické DNA polymorfismy... 20 6. 1. 1. Jednobodový polymorfismus... 20 6. 1. 2. Variabilní počet tandemových repetic... 21 6. 1. 3. Mikrosatelity... 21 6. 2. Princip kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce... 22 6. 3. Výsledky kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce... 22 6.4. Artefakty kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce... 24 6.4.1. Stutter píky... 24 6. 4. 2. A píky... 25 6. 5. Výhody a nevýhody kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce... 25 6. 6. Současné studie kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce... 26 7. Polymerázová řetězová reakce... 29 8. Elektroforéza... 31 8.1. Kapilární gelová elektroforéza... 31 PRAKTICKÁ ČÁST... 33 9. Seznam pouţitých chemikálií... 33 10. Seznam pouţitých přístrojů... 33 5

11. Izolace DNA z plodové vody... 34 11.1. Postup izolace DNA... 34 12. Měření koncentrace a čistoty DNA... 35 12.1. Postup měření koncentrace DNA... 35 12.2. Postup měření čistoty DNA... 35 13. Polymerázová řetězová reakce... 36 13.1. Postup polymerázové řetězové reakce... 36 14. Fragmentační analýza... 37 14.1. Postup přípravy vzorku k aplikaci do genetického analyzátoru... 37 15. Výsledky QF PCR... 38 16. Příklady výsledků kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce... 43 17. Diskuze... 63 Seznam pouţité literatury... 68 Seznam elektronických zdrojů... 69 Seznam zdrojů obrázků... 71 Příloha č. 1... 72 Příloha č. 2... 73 6

Seznam použitých zkratek AFP alfa-1-fetoprotein AMC amniocentéza CVS odběr choriových klků DNA deoxyribonukleová kyselina FISH fluorescenční in situ hybridizace FSH folikuly stimulující hormon LH luteinizační hormon OLG FN Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice PCR polymerázová řetězová reakce QF-PCR kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce SNP jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism) STR mikrosatelity (short tandem repeats) VNTR variabilní počet tandemových repetic (variable number of tandem repeat 7

TEORETICKÁ ČÁST 1. Úvod Prenatální diagnostika je nezbytnou součástí dnešní medicíny. Umoţňuje budoucím matkám zjistit, zda jejich plod je zdravý nebo naopak postiţený některou z geneticky podmíněných chorob. Genetické prenatální vyšetření je invazivní a musí být podmíněno určitou indikací jako např. patologický biochemický skríning, ultrazvukový nález, pokročilejší věk matky aj. Klasickou genetickou metodou uplatňující se v prenatální diagnostice je karyotypování. Karyotypování umoţňuje analyzovat všechny chromozomy daného jedince a odhalit tak početní a strukturální odchylky chromozomů. Velkou nevýhodou této metody je doba potřebná ke kultivaci, přibliţně 14 dní. Kultivace se i tak ve všech případech nemusí povést a doba k tomu potřebná zvyšuje úzkost matky z očekávání výsledků vyšetření. Novější metodou je kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce. Vyuţívá stejný materiál jako klasické cytogenetické metody, ale je podstatně rychlejší. Při pouţití této techniky je výsledek k dispozici tentýţ nebo následující pracovní den. Metoda analyzuje nejčastější chromozomové aberace, tzn. numerické abnormality chromozomu 13, 18, 21, X a Y a případně chromozomy 15, 16 a 22 u spontánních abortů. Tento metodický postup zahrnuje metodu PCR následovanou kapilární elektroforézou, která je prováděna v automatickém genetickém analyzátoru. Současné studie se zabývají tím, zda je metoda QF PCR dostatečně spolehlivá a přesná a do jaké míry ji lze pouţít samostatně, bez doplnění o výsledek z klasického karyotypování. Cílem této práce je se seznámit s oběma genetickými technikami pouţívanými v prenatální diagnostice. Zaměřit se na jejich výhody a nevýhody a posoudit kvalitu QF-PCR testu, jeho přesnost, specifičnost a spolehlivost vzhledem ke starším cytogenetickým metodám. 8

2. Prenatální diagnostika Prenatální diagnostika zahrnuje soubor vyšetření, která můţe těhotná ţena podstoupit a zjistit, zda její dítě netrpí některou z geneticky podmíněných chorob. Tato diagnostika nemůţe však poskytnout pacientce 100% pravděpodobnost narození zdravého dítěte. Metody prenatální diagnostiky jsou poskytovány hlavně ţenám, které patří k rizikovým skupinám splňujícím některou z následujících podmínek: 1. věk matky je nad 35 let nebo pod 17 let, věk otce je vyšší neţ 45 50 let nebo součet věku obou rodičů je nad 70 let 2. pozitivní výsledek biochemického skríningu 3. u předešlého dítěte byla prokázána chromozomální aberace, příp. výskyt chromozomální aberace v rodině 4. předchozí gravidita skončila intrauterinní smrtí plodu nebo neonatální úmrtím 5. přímý styk s mutageny nebo teratogeny 6. zjištění vývojových vad ultrazvukem 7. výskyt nepřímých znaků chromozomální aberace plodu objevených ultrazvukem (např. nuchální projasnění, změny mnoţství plodové vody, ) 8. monogenně vázané nemoci v rodině 9. choroby matky fenylketonurie, diabetes mellitus [8] Z hlediska míry zásahu matčina těla při vyšetření je moţno metody prenatální diagnostiky rozdělit na dvě skupiny: 1. neinvazivní metody 2. invazivní metody K neinvazivním metodám řadíme ultrazvuk. Ultrazvuk slouţí k určení gestačního stáří plodu a odhalení jeho případných tělesných abnormalit. Anencefalii lze zjistit jiţ v 10. 12. týdnu, optimum vyšetření malformací je však v období 18. 20. týdne. V tomto termínu je moţno odhalit defekty nervové trubice, těţké skeletální dysplazie, rozštěp rtu a patra, mikroftalmii a strukturní abnormality mozku, břišních orgánů a srdce. [7] Invazivní postupy provádíme pouze tehdy, pokud jsme přesvědčeni, ţe riziko potratu plodu způsobené touto metodou je niţší neţ riziko narození těţce postiţeného dítěte. K invazivním postupům řadíme biopsii choriových klků, odběr plodové vody neboli amniocentézu, biochemický skríning, kordocentézu (odebrání vzorku fetální krve), fetoskopii (prohlédnutí plodu optickým vláknem - endoskopem) a biopsii embrya. 9

Pokud se díky výsledkům těchto vyšetření ţena rozhodne pro ukončení těhotenství, je pro ni nejbezpečnější přerušit ho do konce prvního trimestru. Všeobecně je však akceptován 24 týdenní limit. 2. 1. Odběr choriových klků Choriové klky jsou součástí vyvíjející se placenty a buňky zde přítomné jsou totoţné s buňkami plodu. Získaná tkáň choria slouţí k cytogenetickému, molekulárně genetickému a biochemickému vyšetření. [8] Odběr choriových klků je biopsií syncitiotrofoblastu. Tu je moţno provést dvěma způsoby: 1. transabdominálně tzn. skrze břišní stěnu 2. transcervikálně tzn. skrze pochvu, přes děloţní čípek Transabdominální přístup se pouţívá častěji. Samotné vyšetření trvá okolo 15 20 min. Vlastní odběr začíná ultrazvukovým vyšetřením, kdy zjistíme polohu plodu a placenty, aby nedošlo k jeho poranění a aby jehla byla zavedena do správného místa v děloze. Choriová tkáň je odebrána díky speciálně upravené ultratenké jehle. Pro kultivaci je třeba odebrat 10 20 mg tkáně a vloţit ji ihned do kultivačního média.[8] Jehlou nasátý vzorek tkáně je poté poslán do laboratoře, kde se dále zpracovává a probíhá dané genetické vyšetření. Z hlediska doby odběru choriových klků dělíme CVS na časnou a pozdní. Časná biopsie choria se provádí mezi 11. 12. týdnem gravidity, pozdní pak od 20. týdne gravidity. V tomto období se však upřednostňuje odběr plodové vody.[8] Přesnost a spolehlivost jednotlivých genetických vyšetření choriových klků jsou rozdílné v závislosti na typu genetické nebo chromosomové změny, pro kterou bylo vyšetření provedeno. Tato metoda nám slouţí k odhalení konkrétního onemocnění, pro které byla indikována. Zřídka se můţe stát, ţe odhalí i jiná onemocnění, případně vyšetření nemusí dojít ke konkrétním výsledkům a musí být opakováno.[21] Výsledky CVS můţe pacientka obdrţet za 3 dny, ale i za 2 3 týdny, závisí to na druhu onemocnění, pro které bylo vyšetření prováděno. Nejdříve je moţno provést diagnózu ve 12. týdnu těhotenství. Mezi rizika této metody řadíme: moţné krvácení, otok plodové vody, vznik děloţní infekce aj. Tato metoda také zvyšuje riziko spontánního potratu o 0,5 2 %, coţ celkově činí riziko okolo 7%. 10

2. 2. Odběr plodové vody Plodová voda je ţlutavě zbarvená tekutina, slabě alkalické reakce. Obsahuje 98 99 % tekuté sloţky a 1 2 % fetálních buněk. V tekuté sloţce se vyskytují organické i anorganické látky např. glukóza, močovina, kreatinin aj. Fetální buňky pochází z povrchu těla plodu, z respiračního, gastrointestinálního a urogenitálního traktu, z plodových obalů a povrchu pupečníku.[8] Plodová voda poskytuje příznivé prostředí pro plod a jeho vývoj. Chrání jej před zevními zásahy, umoţňuje mu dostatečnou pohyblivost, výměnu látek atd. Samotná obměna plodové vody je velmi rychlá a celkově jí ţena za celý průběh těhotenství vyprodukuje přibliţně 849 litrů. Z hlediska časového můţeme amniocentézu rozdělit na dvě skupiny: časnou a pozdní. Časná amniocentéza se provádí v období 12. 14. týdne gravidity. Mnoţství odebrané plodové vody určí gynekolog, zpravidla počet mililitrů odpovídá počtu týdnu těhotenství.[8] Pozdní amniocentéza se provádí nejlépe v 16. týdnu gravidity. Plodová voda se odebírá po lokální anestezii daného místa odběru. Za pouţití tenké jehly se provede vpich přes stěnu břišní do amnionové dutiny a nasaje se příslušný počet mililitrů této tekutiny. Vyšetření probíhá pod kontrolou ultrazvuku z důvodu správné lokalizace plodu a zabránění jeho poškození. Pro další zpracování buněk je u cytogenetických metod nutné je po určitou dobu kultivovat. První výsledky je moţno získat za 48 hodin, běţná kultivace trvá 14 dní. Buňky poté projdou genetickým rozborem a následně biochemickým. Riziko potratu po absolvování tohoto vyšetření se zvyšuje o 0,5 % 2%, přičemţ přirozené riziko v 16. týdnu činí 2,5% nebo 7%, pokud je hladina AFP vysoká.[7] druh vyšetření specifikace časové období amniocentéza časná 12. 14. t.g. pozdní 16. t.g. biopsie choria časná 11. 12. t.g. pozdní po 20. t.g. kordocentéza od 20. t.g. fetoskopie 17. 20. t.g. biochemický skríning 16. t.g. Tabulka 1: přehled prenatálních vyšetření 11

3. Chromozomové aneuploidie Chromozomové aneuploidie jsou častou příčinou spontánních potratů a postiţení narozených jedinců, proto se lékaři snaţí je odhalit metodami prenatální diagnostiky. Jedná se o numerické chromozomální poruchy.[5] Chromozomové aneuploidie řadíme ke genomovým mutacím. Nazýváme tak stav, kdy ve všech buňkách určitého organismu chybí nebo naopak přebývají chromozomy. Jedním z mechanismů vzniku této mutace je chyba v meióze, tzv. meiotická nondisjunkce. Během tohoto procesu dochází k poruše oddělení páru chromozomů u jednoho ze dvou meiotických dělení. V případě prvního dělení pak gameta s 24 chromozomy obsahuje pár, z nichţ jeden je paternálního a druhý maternálního původu. U druhého dělení gameta obsahuje obě kopie stejného původu maternálního nebo paternálního. [5] Většina chromozomových aneuploidií se projevuje jako trizomie (přítomnost jednoho chromozomu navíc). Monozomie je absence jednoho z páru chromozomu a nulizomie je nepřítomnost celého chromozomového páru. K aneuploidiím s širokým výskytem řadíme: Downův syndrom, Edwardsův syndrom, Patauův syndrom, Turnerův syndrom, Superfemale, Supermale, Klinefelterův syndrom. 3. 1. Downův syndrom Downův syndrom je nejznámější a nejčastější chromozomový syndrom. U tohoto syndromu se vyskytuje trizomie 21. chromozomu. Objevuje se u jednoho narozeného dítěte ze 700. Riziko postiţení dítěte je tím vyšší, čím vyšší je matčin věk. Pokud je matka starší 45 let, pravděpodobnost výskytu tohoto onemocnění je 1:40. [6] Fenotypový projev této choroby je velmi charakteristický. Projevuje se tělesnými malformacemi (menší hlava, mohutnější krk), anomáliemi obličeje (mongoloidní vzhled; obličej má ploché rysy; ve vnitřním koutku oka je výrazná kolmá koţní řasa, coţ způsobuje dojem šikmých očí, uši jsou menší, ústa pootevřená). [6] Délka ţivota pacientů s touto chorobou je zkrácená. Pokud ale nejsou přítomny vrozené vady kardiovaskulárního systému, mohou se doţít i více neţ 60 let. Lidé postiţeni kompletní formou trizomie 21. chromozomu jsou neplodní, u mozaikového typu této choroby byla reprodukce prokázána. [9] 12

3. 2. Edwardsův syndrom U Edwardsova syndromu nalézáme trizomii 18. chromozomu. Míra vzniku Edwardsova syndromu je cca 1:3000 početí a 1:6000 narození. Z toho 50 % je zjištěno v těhotenství s moţností, ţe plod nepřeţije prenatální období. [6] Riziko vzniku tohoto syndromu stoupá s věkem matky. K fenotypovým projevům tohoto onemocnění řadíme: mentální retardaci, neprospívání, malformace srdce, nápadně vystouplé záhlaví a ustupující čelist, nízce posazené uši a jejich malformace, kratší hrudní kost. Velmi typickým projevem u tohoto postiţení je zatnutí pěsti charakteristickým způsobem druhý a třetí prst jsou překříţeny přes třetí a čtvrtý. [5] Postnatální prognóza pro pacienty je velmi špatná. Zřídka se doţijí více neţ několika měsíců. Ţenské pohlaví je postiţeno aţ 4krát častěji neţ muţské, coţ je způsobeno častějším úmrtím plodu muţského pohlaví neţli ţenského. [9] 3. 3. Patauův syndrom Patauův syndrom je charakterizován přítomností třech chromozomů 13. Incidence trizomie 13. chromozomu je asi 1 na 20 000 aţ 25 000 porodů. Projevuje se mikrocefalií, holoprozencefalií (vývojová vada, kdy nedochází k rozdělení mozku na dvě párové hemisféry), mikroftalmií, popřípadě anoftalmií, kyklopií nebo hypotelorismem (oči jsou velmi blízko u sebe), rozštěpem rtu a patra, mikrognacií (velmi malá dolní čelist). Na dlaních je jedna výrazná opičí rýha, bývá polydaktylie, chodidla jsou ve tvaru houpacího křesla. Dále se můţe projevit kryptorchismus a srdeční vada. [6] Klinické příznaky této choroby jsou závaţné, polovina postiţených pacientů umírá během prvního měsíce svého ţivota. [5] 3. 4. Turnerův syndrom Podstatou tohoto onemocnění je nepřítomnost pohlavního chromozomu X, jedná se tedy o monozomii. Vyskytuje se s četností jednoho případu na 2 500 ţenských novorozenců. Jedinci s touto genetickou vadou se vţdy profilují jako ţeny, v prenatálním období a nejranějším dětství často bez významnějších příznaků. Proto bývá Turnerův syndrom často diagnostikován aţ dlouho po narození. [6] Přesto ţe je tato vada slučitelná se ţivotem, 99 % těhotenství postiţených touto vadou je spontánně potraceno. [9] 13

K typickým abnormalitám přítomných u tohoto onemocnění patří malá postava, dysgeneze gonád, neobvyklá facies, koţní duplikatura v krční oblasti, nízká hranice vlasů na šíji, široký hrudník s oddálenými bradavkami. Při narození se často vyskytují edémy zad a nohou, u plodu lymfedémy. [5] Postiţení pacienti mohou také trpět ucpáváním Eustachovy trubice, záněty středního ucha, výjimečně se objevuje i úplná ztráta sluchu. Zrak můţe být také poškozen např. šilhavost, krátkozrakost, pokleslost horních víček. [9] Pacientky postiţené Turnerovým syndromem podstupují specifickou, substituční terapii. Je nutno podstoupit léčbu růstovým hormonem, přispívá k nárůstu postavy o 6 aţ 10 centimetrů. [5] Některé pacientky s Turnerovým syndromem mohou otěhotnět. V 27 % případů však těhotenství končí spontánním potratem, 32 % narozených dětí má somatické nebo mentální abnormality a u 22 % se objevují chromozomové aberace. Kombinace substituční léčby a přenosu oplozeného vajíčka od dárkyně in vitro lze vyřešit neplodnost těchto pacientek. [9] 3. 5. Superfemale Tzv. XXX syndrom nebo také syndrom superţeny, nadsamice. Jedná se o trizomii chromozomu X. Vyskytuje se u 0,005 % ţen. [6] Karyotyp tohoto onemocnění je 47, XXX. Dva z těchto tří X chromozomů jsou inaktivované a později se replikují. Většina případů této aberace vzniká během prvního meiotického dělení u matky. [5] Vyšší věk matky, zvyšuje pravděpodobnost výskytu tohoto onemocnění. Pacientky jsou spíše normálního vzhledu. Mezi fenotypové odchylky řadíme vyšší postavu, sníţenou inteligenci, narušení funkce pohlavních ţláz (např. pozdější nástup menstruace), poruchy reprodukce. [9] 3. 6. Supermale Supermale je syndrom s výskytem jednoho chromozomu Y navíc, tedy XYY. Postiţení jsou muţi. Mohou být vyšší postavy s niţším IQ a často se projevuje sklon k agresivnějšímu chování. Asi polovina postiţených chlapců vyţaduje zvláštní pozornost, objevují se jazykové obtíţe a potíţe při čtení a hláskování. Skóre v IQ testech se pohybuje 10 aţ 15 bodů pod průměrem. Fertilita těchto pacientů většinou není nijak poškozena. 14

Nález tohoto onemocnění u plodu stále představuje jeden z největších problémů v prenatální diagnostice při genetickém poradenství. U jednotlivých případů lze těţko určit výsledný fenotyp do budoucna. [5] 3. 7. Klinefertelův syndrom Tento syndrom je gonozomovou aberací muţského pohlaví 47,XXY. Jedná se o druhou nejčastější extrachromozomální poruchu, postiţeni jsou jeden narozený chlapec na 500 jedinců. 75% XXY muţů neví o své nemoci, často je syndrom diagnostikován aţ v souvislosti s touhou zaloţit rodinu, případně naopak při prenatálním skríningu. Zároveň jen 80% všech nemocných s příznaky Klinefelterova syndromu má opravdu XXY chromozomy. [6] Aţ do puberty se nijak specificky toto onemocnění neprojevuje. Poté se objevují náznaky hypogonadizmu. Pacienti jsou vyššího vzrůstu s projevy feminizace. Zarůstání tváří a sexuální ochlupení muţského typu bývá jen slabě vyznačené. Pubické ochlupení je ţenského rázu. Často se objevuje gynekomastie a osteoporóza. [9] Hlavním dopadem onemocnění je narušení vývoje varlat a poruchy plodnosti, varlata jsou malá (mikroorchidismus) a měkká. Pacienti mají často nízké hodnoty testosteronu, ale vysoké hodnoty folikuly-stimulujícího hormonu (FSH) a luteinizačního hormonu (LH). [6] Drtivá většina muţů je sterilní, ačkoli existuje někdy moţnost pomoci díky asistované reprodukci. 3. 8. Mozaicismus Mozaicismem se nazývá stav, kdy se v celém organizmu jedince, příp. jen v určité jeho tkáni vyskytují různé buňky o dvou nebo více rozdílných buněčných konstitucích, které se vzájemně odlišují svou genetickou výbavou.[5, 9] Odlišné buněčné linie pochází z jedné a té samé zygoty. Nejčastější příčinou vzniku mozaicismu je nondisjunkce v časném postzygotickém mitotickém dělení. Podle toho, v kterých buňkách dojde ke vzniku mozaicismu ho dělíme na mozaicismus somatický a gonádový ( mozaicismus zárodečných buněk). [9] Interpretace mozaicismu v prenatální období je značně těţká. Míra vlivu mozaicismu na následný vývin jedince závisí na tom, kdy k nondisjunkci došlo, jaká je podstata chromozomální abnormality, která tkáň je postiţena a v jakém poměru jsou přítomny buňky 15

s odlišnou chromozomální sadou k buňkám s normálním karyotypem. Během prenatálního období nemusí odpovídat poměr buněk ve vyšetřované tkáni s chromozomovou abnormalitou poměru v jiných tkáních nebo celém embryu při časných vývojových stádiích. [5] V cytogenetice se klade důraz na odhalení pseudomozaicismu, který vzniká při kultivaci buněk. Pseudomozaiky bývají časté u buněčných kultur choriových klků. [5] 16

4. Spontánní aborty Časné potraty postihují aţ 15 % klinicky prokázaných těhotenství. Potrat embrya můţe být způsoben mnoha faktory, ale ze studií vyplývá, ţe aţ 60% spontánních potratů je způsobeno chromozomovými abnormalitami. [16] U mrtvě narozených dětí se vyskytují přibliţně v 6 % a u ţivě narozených dětí je to 0,6 %. S ohledem na to, ţe 50 % všech početí se potratí v průběhu prvních dvou týdnů intrauterinního vývoje, kdy ještě není gravidita stanovena, předpokládá se, ţe celková genetická zátěţ je větší. Výskyt chromozómových anomálií je nejvyšší u pacientek, které potratily v 1. trimestru gravidity. [9] Na rozdíl od ţivě narozených dětí, u potratů je moţno nalézt větší variabilitu chromozomových aberací. Důvodem tohoto jevu je přirozená selektivita. Nejčastější z chromozomových odchylek jsou trizomie v 54,8 %, poté triploidie a tetraploidie v 21 %. Konkrétně jde o chromozomy 13, 15, 16, 18, 21, 22 a X. [9, 16] Většina chromozomových abnormalit zjištěných při spontánních abortech se vyskytuje sporadicky a u rodičů není zjištěn zvýšený procentuální nález aberací v porovnání s ostatní populací. Při opakujících se potratech byla zjištěna chromozomová aberace u některého z rodičů v 3 % případů. Za těchto okolností je nutno udělat chromozomovou analýzu somatických buněk rodičů. [9] Cytogenetické testování spontánních potratů jsou velmi doporučované dokonce i u prvního zaznamenaného spontánního potratu. Identifikace moţného důvodu potratu významně sniţuje dlouhodobou psychickou zátěţ pacientky a umoţňuje genetickou konzultaci s páry před následným těhotenstvím. [16] Konvenční cytogenetické testování je drahé a zdlouhavé. Výsledek je často znemoţněn neúspěšnou kultivací, chybnou diagnózou kvůli materiální kontaminaci a přerostením buněk nebo nedostatečnou kvalitou chromozomálních preparátů. Buněčné kultury mohou selektivně získat normální karyotyp nebo abnormální karyotyp v závislosti na aktuální buněčné proliferaci. [16] Současné studie opakovaně prokázaly, ţe QF PCR umoţňuje rychlou, spolehlivou a relativně levnou techniku pro diagnostiku chromozomálních aneuploidií u prenatálních vzorků i abortů. QF PCR nevyţaduje buněčné kultury, vystačí s malým mnoţstvím tkáňového materiálu a nabízí výsledek v jediném pracovním dni. [16] 17

5. Klasické cytogenetické metody Klasickými cytogenetickými metodami se provádí karyotypování. Karyotypování se zabývá stanovením počtu chromozomů, jejich mikroskopickým vzhledem a segregací během meiózy a vztahem mezi chromozomovými nálezy a jejich fenotypovými projevy.[9] Karyotyp je soubor všech chromozomů v jádře buňky. Normální karyotyp se skládá z 23 párů chromozomů. Autozomy tvoří 22 párů a 23. pár jsou pohlaví chromozomy neboli gonozomy. U ţeny jsou gonozomy tvořeny dvěma chromozomy X, u muţe chromozomem X a Y. Karyotyp ţeny se zapisuje jako 46,XX; karyotyp muţe 46,XY. Při této metodě se pracuje s kondenzovanými chromozomy vyskytujícími se v metafázi. V těchto stádiích jsou nejlépe rozlišitelné a lze rozpoznat sesterské chromatidy spojené v centromeře.[5] Centromera je primárním zaškrcením chromozomu, rozdělující chromozom na dvě raménka: krátké (p) a dlouhé (q) raménko; je jedním z hlavních cytogenetických znaků. Pro získání dostatečného mnoţství metafázických chromozomů je nutná buněčná kultivace in vitro. Buněčné kultury lze získat např. z periferní krve, z koţní tkáně (fibroblasty), kostní dřeně. Kostní dřeň se získává velmi invazivním způsobem, ale obsahuje velké mnoţství buněk a proto není nutná dlouhodobá kultivace. Vyuţívá se hlavně v diagnostice hematologických malignit. Buňky plodu se získávají z amnionové tekutiny nebo z biopsie choriových klků.[5] Tkáňové kultury mohou být krátkodobé, během několika dní se získá potřebné mnoţství buněk např. periferní krev nebo dlouhodobé např. fibroblasty, kde růst buněk trvá několik týdnů.[9] U buněk kultivovaných in vitro se dodrţují optimální podmínky růstu např. teplota, ph a kultivační médium. Pro stimulaci aktivity buněk se do buněčné suspenze přidává fytohemaglutinin.[9] Po získání potřebného mnoţství buněk se ke směsi přidá kolchicin. Tato látka inhibuje vytvoření dělícího vřeténka, buňky se hromadí v metafázickém stádiu a chromatidy se rozestupují. Kolchicin se přidává 4 hodiny před ukončením kultivace buněk. K vhodnému hodnocení chromozomů je nutný jejich výskyt v jedné rovině. Pouţívá se hypotonizační roztok, rychlé vysušení suspenze buněk nebo tlak na krycí sklíčko, které je přiloţené na buněčné suspenzi.[9] Po ukončení kultivace se chromozomy fixují a barví. Fixace probíhá např. za pouţití kyseliny octové a methanolu po dobu 2 hodin. Techniky barvení chromozomů se nazývají pruhovaní. Obarvené chromozomy se pak hodnotí pod světelným mikroskopem. 18

Nejčastějším z barvení je metoda G-pruhování. Chromozomy se nejprve inkubují s trypsinem, který natráví bílkoviny a poté jsou obarveny Giemsovým barvivem. Kaţdý chromozomový pár se obarví charakteristickým způsobem: světlými a tmavými pruhy. R-pruhování zobrazuje světlé a tmavé pruhy na chromozomech opačně neţ G-pruhování. Pouţívá se v případě nutnosti zviditelnění konců chromozomů, které jsou při G-pruhování světlé. Při Q pruhování se pouţívá chinakrin. Chromozomy se barví specifickým způsobem, vznikají průhledné a neprůhledné pruhy a hodnotí se pod fluorescenčním mikroskopem. Průhledné pruhy jsou totoţné s tmavými G-pruhy. Q pruhování se vyuţívá u heteromorfismu.[5] Výhodou klasických cytogenetických metod je moţnost prohlédnutí celého karyotypu jedince a moţnosti zhodnocení strukturálních a numerických abnormalit jednotlivého chromozomu zvlášť. Nevýhodou těchto metod je jejich velká časová náročnost z důvodu buněčných kultivací, omezená schopnost detekovat určité chromozomální přestavby malého rozsahu (například mikrodelece) a neschopnost určovat původ marker chromozomů. 19

6. Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce byla vyvinuta v posledních 15 letech a je alternativní metodou umoţňující rapidní detekci nejčastějších aneuploidií. Tato metoda vstoupila na pole prenatální diagnostiky s cílem překonat potřebu kultivace fetálních buněk a dovolit tak rychlou prenatální diagnostiku. Trizomie chromozomu 13, 18 a 21, stejně jako pohlavní aneuploidie čítají podle různých studií od 80 % aţ po 98,6 % významných chromozomových aberací. OF-PCR technika umoţňuje detekci těchto aneuploidií během 24 hodin. Díky rychlé diagnostice je moţno rozhodnout o probíhajícím těhotenství v brzké době a v případě rozhodnutí o ukončení těhotenství pouţít méně traumatickou metodu. U negativního výsledku těchto chromozomových aneuploidií, zjištěného metodou QF-PCR, je zbytkové riziko výskytu jiných chromozomových poruch nízké.[10, 15, 17] QF-PCR není vyšetření cytogenetické, ale jedná se o DNA analýzu nekódujících oblastí, vykonanou na nekultivovaných plodových buňkách. Princip QF-PCR techniky je zaloţen na přítomnosti vysoce polymorfických, krátkých, tandemově opakujících se markerů specifických pro kaţdý chromozom.[22] 6. 1. Genetické DNA polymorfismy Za geneticky polymorfní je povaţován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v takových frekvencích, ţe i ta, která se vyskytuje zřídkakdy, má frekvenci alespoň 1 %.[19] Polymorfismus můţeme definovat také jako místo v sekvenci DNA, v němţ se jedinci od sebe odlišují.[22]na úrovni DNA se vyskytuje celá řada polymorfismů, které jsme schopni detekovat pouze za pouţití genetických molekulárních metod. Tyto polymorfismy se dělí do následujících skupin: jednobodový polymorfismus, variabilní počet tandemových repetic a mikrosatelity.[17, 19, 20] 6. 1. 1. Jednobodový polymorfismus Tento druh polymorfismus je nejčastěji způsoben bodovou mutací určitého místa DNA. Předpokládá se, ţe kaţdý 500. nukleotid v kódujících sekvencích a kaţdý 50. v nekódujících sekvencích jsou polymorfní.[19] Celý lidský genom pak obsahuje přibliţně 1,5 miliónu jednobodových polymorfismů.[22] SNP jsou o něco častější neţ jiné polymorfismy DNA a jsou rozloţeny rovnoměrně podél celého genomu. Tyto polymorfismy se pouţívají při 20

sestavování genetických map nebo pro hodnocení potenciálního významu určitého genu pro vznik onemocnění s komplexní dědičností.[5] 6. 1. 2. Variabilní počet tandemových repetic Jako repetitivní se označují sekvence, které se v genomové DNA vyskytují v mnoha kopiích. (PAP) Tato třída polymorfismů vzniká díky tandemové inzerci několika kopií určité sekvence DNA o velikosti 10 aţ 100 párů bazí. Bloky mají obyčejně rozsah 0,1 20 kb. (SLOV) VNTR je charakterizován větším mnoţstvím alel, jelikoţ délka fragmentu odvisí od toho, kolik kopií minisatelitu je zde přítomno.[5]vntr markery se preferenčně vyskytují v telomerických oblastech.[22]tyto markery, které se uţívaly v analýza k osobní identifikaci, jsou v dnešní době nahrazeny mikrosatelity.[5] 6. 1. 3. Mikrosatelity Mikrosatelity jsou častější a polymorfnější neţ VNTR sekvence a jsou rovnoměrně rozmístěny v lidském genomu.[5, 22] Tyto polymorfismy jsou tvořeny 2-6 bázemi a počet opakování repetic je 2 100 párů bazí.[22] Pro tento typ repetitivní DNA je charakteristická přítomnost velkého mnoţství alel[9]. Díky tomu je velmi pravděpodobná heterozygozita testovaného jedince v daném lokusu, zpravidla nad 70 %. V důsledku tak vysoké heterozygozity je moţné odlišit jednoho jedince od druhého, coţ se vyuţívá v diagnostice.[22] Výhodou těchto markerů také je, ţe jich desetitisíce v lidském genomu jiţ bylo zmapováno, a proto zbývá velmi malé mnoţství oblastí v lidském genomu, které bychom nemohli určit pomocí genetické vazby s pouţitím STR markerů. Tyto markery se pouţívají v QF PCR technice. STR markery se promyšleně vybírají, aby se minimalizovala moţnost získání neinformativních a nejednoznačných výsledků. Výběr markerů závisí i na příslušné populací. [17] Lokace STR markerů na cílových chromozomech je také brána v potaz, aby byla zvýšena moţnost detekování částečných trizomií.[10] K zajištění správné informovanosti testu QF- PCR se pro kaţdý chromozom pouţívají minimálně dva informativní STR markery. Jestliţe se ve výsledku objeví méně neţ dva informativní STR markery pro testovaný chromozom, provede se opětovné testování s dalšími, přidanými STR markery patřícími k danému chromozomu.[17] 21

U techniky QF-PCR se někdy můţe vyskytnout přednostní amplifikace jednoho chromozomu, jedná se zvláště o ty kratší úseky. Podle studií, zvýšený počet analyzovaných STR markerů na chromozom, které jsou přednostně vybrány dle vysokých heterozygotních hodnot, charakteru opakování a vhodnosti alelového rozpětí, minimalizuje fenomén přednostní amplifikace.[17] 6. 2. Princip kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce QF-PCR analýza zahrnuje amplifikaci, detekci a analýzu STR markerů.[17] Ze vzorku choriových klků nebo plodové vody se nejprve izoluje DNA pomocí standardně pouţívaných metod.[22] Poté probíhá modifikovaná PCR reakce. Pro PCR amplifikaci se pouţívají fluorescenčně značené primery pro konkrétní STR marker na konkrétním chromozomu. Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány na automatickém genetickém analyzátoru za pouţití principu kapilární elektroforézy. Primery produkující produkty o podobné délce bývají označeny odlišnými fluorochromy, aby mohly být amplifikovány ve stejné multiplexové PCR reakci. [10] 6. 3. Výsledky kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce Výsledky se zobrazují do grafu. Výsledný fluorescenční produkt je prezentován jako pík s určitou plochou, která je úměrná mnoţství DNA.[1] Relativní mnoţství kaţdé STR alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu píků, příp. jejich výšek. V případě normálního, diploidního jedince se zobrazuje signál dvou alel v poměru 1:1 o stejné výšce a ploše, se stejnou fluorescenční intenzitou (viz. obr. 1). Pokud se jedná o homozygota, výsledek se zobrazí jako jeden pík s dvojitým signálem. DNA amplifikovaná z trizomických jedinců vykáţe buď další pík navíc (tři různé alely) se stejnou plochou (viz. obr. 2) nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichţ jeden má dvojnásobnou plochu, neţ ten druhý (viz. obr. 3). Výsledek pro dvě alely se znázorní v poměru 1:2 nebo 2:1 a výsledek pro tři alely resp. tři píky v poměru 1:1:1. Jedinci homozygotní nebo monozomní jsou největším problémem pro testování abnormalit pohlavních chromozomů. Pokud pouţijeme STR markery specifické pro chromozom X, některé vzorky normální ţeny s karyotypem 46,XX se mohou prezentovat jako homozygotní QF-PCR výsledek, který nelze odlišit od vzorků s jedním chromozomem X, jako při Turnerově syndromu. Začlenění dalších STR markerů chromozomu X do analýzy redukuje 22

pravděpodobnost homozygotnosti, ale neeliminuje ji zcela. Problém monosomie X řeší 7X STR marker pro relativní kvantifikaci chromozomů 7 a X. Pro normální ţenu je poměr 7. chromozomu k X chromozomu 1:1. Pro normálního muţe a ţenu s monosomií X (Turnerovým syndromem) je typický poměr 2:1.[1, 22] Studie zabývající se přesností QF-PCR udávají ještě konkrétnější poměry výsledků. Normální výsledek je brán jako dizomický dialelický vzorek s alelovým poměrem od 1:0,7 do 1:1,4 s nejméně dvěma informativními STR markery na chromozom. Trizomický trialelický vzorek s alelovým poměrem 1:1:1 nebo trizomický vzorek s dvěma alelami a alelovým píkovým poměrem 2:1 dosahující podílu méně neţ 0,7 nebo více neţ 1,4 je povaţován za abnormální, kde odlišnost v alelové délce je menší neţ 20 párů bazí. V případech, kdy dochází k přednostní amplifikaci krátkých alel, je rozdíl ve velikosti mezi alelami často větší neţ 20 párů bazí. Takový marker se povaţuje za neinformativní. Podíl méně neţ 0,25 nebo vyšší neţ 4 není brán na vědomí, povaţuje se za artefakt PCR reakce a analýza se opakuje.[17] Obrázek 1: normální, diploidní jedinec, alely v poměru 1:1 Obrázek 2: abnormální, trizomický jedinec, alely v poměru 2:1 23

Obrázek 3: abnormální, trizomický jedinec, alely v poměru 1:1:1 QF-PCR dokáţe rozlišit i maternální kontaminaci. To se ve výsledku, resp. grafu zobrazuje jako dva odlišné genotypy a vzorek je obvykle nezaměnitelný s normálním, trizomickým nebo triploidiním výsledkem.[10] Graf také můţe znázornit vzorek s charakteristickými extra alelami nebo zkoseným podílem mezi píky pro všechny chromozomy. 6.4. Artefakty kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce Za určitých okolností můţe dojít k tomu, ţe se ve výsledcích znázorněných ve formě grafu objeví píky, které přímo nevyjadřují určitý chromozom, ale jsou v podstatě chybou reakce, tzv. artefakty QF PCR reakce. 6.4.1. Stutter píky Stutter píky jsou píky, které se nachází před samotnými píky STR alel. Jsou o několik repetic menší, neţ aktuální STR alela a jejich obsah je menší neţ 15 % obsahu alelového STR píku (viz. obrázek č. 4)[1] Obrázek 4: stutter pík (označený šipkou) před STR píkem 24

6. 4. 2. A píky - A píky jsou samostatné píky, vyskytující se před píkem STR alely. Tyto píky jsou o jeden pár bazí kratší neţ PCR produkt s plnou délkou (A + pík)[1] Obrázek 5: -A pík a +A pík, označené šipkami 6. 5. Výhody a nevýhody kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce Výhodou této metody je velmi krátká doba nutná k diagnostice. Analýza trvá méně neţ pět hodin. QF-PCR můţe být pouţita i u stálých tkání, kdyţto karyotypování vyţaduje čerstvé vzorky.[23] Umoţňuje také detekci Turnerova syndromu, odhalí kontaminaci mateřskými buňkami bez nutnosti společného testování rodičovských vzorků. Pro kaţdý chromozom jsou zahrnuty i velmi krátké STR úseky, díky nimţ lze analyzovat i částečně degradovanou DNA. Rapidní diagnostika byla úspěšná i v případech triploidie a dvojitých trizomií. Další z výhod QF-PCR je automatizace, nízká cena a široký záběr vzorků. [10] QF-PCR je určitým způsobem limitována. Tato technika není schopna vydat přesné výsledky u nebalancovaných vzorků s nízkou úrovní mosaicizmu. Tyto nesouhlasné výsledky mohou být přítomny díky nízkému procentu mozaiky a přítomnosti pouze jedné ze dvou buněčných linií v detekovatelné úrovni.[23]metoda není úspěšná u některých typů polypolidií a strukturálních abnormalit. Ve vzácných případech můţe být neinformativní pro všechny markery na jednom nebo více chromozomech. V takovém případě je nutno pouţít alternativní metodu buď metodu FISH nebo úplné karyotypování. 25

6. 6. Současné studie kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce V současné době byla provedena celá řada studií, které se snaţí o porovnání rychlé QF-PCR techniky s konvenčními cytogenetickými metodami. Zabývají se přesností a správností kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce vzhledem k úplnému karyotypování. Dle jedné studie je při uţití QF PCR jako samostatného testu šance nediagnostikování nejběţnějších chromozomových anomálií přibliţně jeden případ na 150 abnormálních karyotypů resp. jeden případ na 10-30 000 vzorků, závisejících na věkovém rozloţení. [15] Největší klinickou aplikací QF-PCR v rutinní prenatální diagnostice v České republice je studie autorky Putzové. Studie pouţila dvě testovací taktiky. První taktikou je testování moţnosti přítomnosti trizomie chromozomu 21. Tento test byl pouţit pouze v případech, které byly určeny jako potencionálně pozitivní pro Downův syndrom po provedení biochemického skríningu v sekundárním trimestru. Druhou taktikou je testování běţných aneuploidií navrţeno jinými indikacemi, jako jsou: ultrazvukový nález, mnohonásobné riziko Edwardsova syndromu, těhotenství v pokročilejším věku a úzkost matky. Celkově bylo analyzováno 6 349 vzorků, z toho 142 vzorků choriových klků a 6 207 vzorků plodových vod získaných od listopadu roku 2002 aţ po únor roku 2007. Test pro běţné aneuploidie (2M test) byl vykonán u 2 764 z 6 207 vzorků plodových vod a u všech vzorků choriových klků. T21 test (test pro trizomii 21. chromozomu) byl proveden u 3 443 z 6 207 testovaných vzorků plodových vod. Průměrný věk matek v 2M testu byl 32 let, s 27% skupinou mající přes 35 let. Průměr u T21 testu byl 31 let, 16 % přesahovalo 35 let. Průměrný těhotenský věk v čase testování byl 18,4 týdnů. Oba testy T21 i 2M test detekovali okolo 90 % klinicky významných chromozomových aberací (87,5% T21 a 93,5% 2M) ve srovnání s karyotypováním. Moţnost neurčení diagnózy metodou QF-PCR jakékoli chromozomové anomálie byl asi 1:90. Hodně z těchto nestanovených diagnóz bylo klinicky nevýznamných, přesto by se tyto výsledky měli konzultovat s rodinou a nabídnout jim všechny potřebné doplňující vyšetření. Riziko nediagnostikování některé z chromozomových abnormalit uţitím QF-PCR techniky spolu s ultrazvukem v druhém trimestru bylo 1: 1 513. S okolo 4 000 prenatálních testů vykonaných během jednoho roku hrozí ztráta třech takových případů ročně.[18] 26

Negativní výsledek z QF-PCR analýzy společně s negativním ultrazvukem posunuje zbytkové riziko významných fetálních chromozomových anomálií pod 1:1 500, coţ je důleţitý faktor pro zmenšení mateřské úzkosti. [18] Další studie se zabývala moţností aplikovat metodu QF-PCR ke stanovení běţných aneuploidií u potracených plodů. Shromáţdilo se 61 tkání z potracených plodů. Čtyřicet osm krevních vzorků od nepříbuzných, zdravých osob s průměrným věkem 35,2 roků ze Shanghaie se pouţilo jako kontroly. Pouze dva vzorky ukázaly odlišný výsledek neţ karyotypování a korespondenční podíl těchto metod byl 95 %, coţ ukazuje na spolehlivost metody a srovnatelnost s cytogenetickými metodami. [23] Velmi rozsáhlou studií je studie autora Vincenzo Cirigliano. Ta informuje o výsledcích skríningu 43 000 fetálních vzorků sbíraných po dobu 9 let ve 2 odlišných genetických centrech. Pouţívala se metoda QF-PCR i konvenční cytogenetické metody. Vzorky byly sbírány od února 1999 do března 2008. Většina vzorků byly plodové vody (37 544) a choriové klky (4 687) získané mezi 11. a 13. týdnem gravidity. Vyšetřilo se také 178 fetální krevních vzorků a 591 tkání potracených plodů. Nejběţnějšími indikacemi pro invazivní procedury byly: zvýšené riziko postiţení plodu díky pokročilému věku matky, pozitivní biochemický skríning mateřské krve, 6 % případů bylo také spojeno s nuchálním projasněním, úzkost rodičů s 22 % a abnormální ultrazvuk zajistily 7 % případů.[10] 41 019 tzn. 95 % vzorků bylo správně identifikováno jako chromozomálně normální za pomocí metody QF-PCR z 41 178 diagnostikovaných jako normální karyotypováním. 1 608 plodů bylo diagnostikováno jako chromozomálně abnormální z 1 741 abnormalit detekovaných technikou karyotypování. Ve vzorcích uvedených k vyšetření pro abnormální ultrazvuk QF-PCR detekovala 95% všech významných klinických chromozomových abnormalit. Rychlý test demonstruje 100% specifitu a detekci pro chromozomy 21, 18, 13, X a Y pentazomie a nemozaikové aneuploidie zahrnující oba gonozomy X i Y bez falešně negativních výsledků. [10] Studie Umberta Nicoliniho ukazuje vysokou přesnost QF-PCR metody vzhledem ke karyotypování. QF-PCR technika byla aplikována na rozlišných tkáních a minimálně dva STR markery, později aţ 6 STR markerů se pouţily pro testování kaţdého z potřebných chromozomů. Detekční podíl vybraných chromozomů 13, 18, 21 a pohlavních chromozomů byl 98,6 %. Pohlavní chromozomové aneuploidie byly ty, s nejvyšším falešně negativním podílem 7/74, 27

zatímco falešně negativní diagnózy u trizomií chromozomů 21, 18 a 13 byly 3/551; 3/222 a 0/80. QF-PCR metoda byla schopna detekovat 4 z 9 nebalancovaných strukturálních anomálií zahrnující testované chromozomy. Metoda nebyla schopna analyzovat 4 prstencové chromozomy a jednu nebalancovanou translokaci zahrnující chromozom 21. Pouze 45 % mozaicismu bylo úspěšně diagnostikováno. Jednalo se o vzorky s procentem abnormálních buněk větším neţ 30 %. [15] Výsledkem studií bývá často domněnka, ţe ţeny s normálním výsledkem ultrazvuku jsou v nízkém riziku co se týče postiţení plodu a odtud to podněcuje k tomu, ţe mohou podstoupit pouze QF-PCR metodu. Ţeny s fetálními strukturálními abnormalitami by mohly také benefitovat z QF-PCR vyšetření na běţné aneuploidie, ale obecnou shodou je, ţe by měly podstoupit úplné karyotypování.[15] 28

7. Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce je součástí QF-PCR techniky. Je to proces, který slouţí k amplifikaci určitého úseku DNA a získání tak jeho potřebného mnoţství pro následné vyšetřování. K namnoţení vybrané části DNA jsou zapotřebí primery, DNA polymeráza a volné nukleotidy. Primery jsou tvořeny skupinou nukleotidů, které jsou komplementární s poţadovaným úsekem na DNA, konkrétně ohraničují jeho začátek a konec. DNA polymeráza je enzym, který zajišťuje napojování volných nukleotidů na nově se tvořící vlákno. Tento enzym musí být termostabilní, vydrţí teploty i okolo 95 C. Mezi nejčastěji pouţívanou DNA polymerázu patří Taq polymeráza, která je izolována z bakterie Thermus aquaticus. Polymerázová řetězová reakce probíhá v přístrojích zvaných termocyclery, které mění teploty na základě jednotlivých fází. Samotná reakce probíhá ve třech stále se opakujících fázích. Jsou to: 1. Denaturace Teplota se pohybuje v rozmezí 94 98 C. Dvoušroubovice DNA je spojená vodíkovými můstky. Tyto vazby se uvolní, DNA se rozpadá na dvě samostatná vlákna. 2. Nasednutí primerů V této fázi se teplota sniţuje na 45-70 C. Na základě komplementarity primery nasednou na specifická místa na DNA. Od tohoto místa, se začíná tvořit nové vlákno. 3. Prodluţování vlákna Teplota se zvyšuje na 75-80 C. DNA polymeráza připojuje volné nukleotidy, komplementární k templátovému vláknu. Nové vlákno narůstá směrem od 5 konce k 3 konci. Na konci tohoto procesu máme tedy dvojnásobek původního mnoţství DNA. Konkrétně v prvním cyklu máme z jedné dvoušroubovice DNA následně dvě, v druhém cyklu ze dvou původních dvoušroubovic DNA budeme mít čtyři atd. Celý cyklus opakujeme asi tak třicetkrát, coţ nám poskytne dostatečné mnoţství poţadované části DNA. 29

94 98 C 45 70 C 75 80 C Obrázek 6: schéma PCR 1. denaturace, 2. nasedání primerů, 3. prodluţování vlákna, 30

8. Elektroforéza Elektroforéza patří mezi základní laboratorní techniky. Pouţívá se k oddělování různě odlišných molekul ve směsi. Konkrétně u QF-PCR se jedná o části DNA. Vzorek je umístěn na porézní látku jako je např. kousek filtračního papíru nebo polotuhý gel. Takto nanesený vzorek je pak přemístěn do roztoku, kterým prochází elektrické pole. Na základě odlišných vlastností molekul se jednotlivé látky rozdělí. Jestliţe mají dvě molekuly přibliţně stejný tvar i molekulovou hmotnost, látka s vyšším nábojem bude migrovat rychleji směrem k elektrodě s opačnou polaritou neţ látka s menším nábojem. [3] Tato technika se pouţívá např. k analýze nukleových kyselin nebo proteinů, odděluje různě odlišně velké fragmenty DNA a RNA řetězců a je neocenitelnou součástí dnešní molekulární genetiky. [3] Elektroforéza má celou řadu variací. Např. kapilární zónová elektroforéza, izotachoforéza, kapilární isoelektrická fokuzace, volná kapilární elektroforéza. K vytvoření STR profilů se pouţívá kapilární gelová elektroforéza. 8.1. Kapilární gelová elektroforéza Tato elektroforéza pracuje s kapilárou, např. křemennou. Ta je naplněna různými gely, záleţí na poţadované separaci. Gel je vyuţíván jako nosné médium, ale také jako prostředek k dělení molekul. Nejčastěji pouţívanou plnící látkou je agarósa nebo polyakrylamidový gel. [4] Gel má různé velikosti pórů, tzv. porosita. Vyuţívá se pro dělení molekul s podobným nábojem a molekulovou hmotností, ale různými velikostmi. Například dva polynukleotidové řetězce různých délek jsou oba záporně nabité (v důsledku přítomnosti fosfátových skupin), putují oba ke kladně nabité elektrodě. Molekulová hmotnost a náboj jsou přibliţně stejné, rozdělení v důsledku elektrického pole je minimální. Za pouţití gelu s různou velikostí pórů se dají tyto dva řetězce oddělit na základě velikosti. [3] Separace vzorku kapilární gelovou elektroforézou závisí na elektroforetickém pohybu nabitých částic gelovou matricí směrem k elektrodě, na porositě gelu, velikosti separovaných molekul, poměru velikosti molekul a náboje a fyzikální dimenze roztoku. Dále na velikosti napětí, délce a průměru kapiláry, ph a iontové síle elektrolytu. [11] 31

Detekce různě velkých molekul je provedena za pouţití fluorescenčního barviva, které se váţe na nukleové kyseliny. [3] Při pouţití fluorescenční detekce jsou fragmenty DNA před samotnou elektroforézou označeny pěti fluorescenčními barvivy pomocí sekvenační reakce. Kaţdé z nich odpovídá jedné z nukleotidových bazí (adenin, guanin, thymin, uracil). Na kapiláru se příčně svítí laserovým svazkem a světlo emitované barvivy při průchodu fragmentů se snímá čtyřmi detektory, z nichţ kaţdý své barvivo rozpozná přes příslušný optický filtr. Signál je převeden počítačovým programem a zobrazí sekvenci nukleotidů v analyzovaném fragmentu. [12] Rozlišovací schopnost této metody je vysoká. Polynukleotidy rozdílné od sebe o jeden pouhý nukleotid jsou tímto způsobem rozlišeny. [3] 32

PRAKTICKÁ ČÁST 9. Seznam použitých chemikálií Viz. Příloha 1 10. Seznam použitých přístrojů Viz. Příloha 2 33

11. Izolace DNA z plodové vody Do laboratoře je nejprve doručena odebraná plodová voda v injekční stříkačce. Mnoţství odebrané plodové vody je přímo úměrné počtu týdne gravidity např. je-li matka v 16. týdnu gravidity, odebírá se 16 ml této tekutiny. Pro molekulárně genetické metody se oddělí 1 ml do mikrozkumavky, zbytek tekutiny se pouţívá ke klasickým cytogenetickým metodám. Vzorek plodové vody v mikrozkumavce musí být řádně označen. Štítek obsahuje jméno a příjmení pacientky, její rodné číslo a identifikační číslo vzorku vytvořené danou laboratoří. 11.1. Postup izolace DNA 1. Centrifuga se dá vychladit na 4 C. 2. Po vychlazení centrifugy na optimální teplotu se dá vzorek zcentrifugovat. Centrifugace probíhá po dobu 10 min při 10 000 otáčkách a 4 C 3. Po centrifugaci se buňky s DNA usadí na dno, vytvoří se sediment. Obsah zkumavky se vylije, buňky jsou dobře přichycené a zůstanou na dně. K tomuto sedimentu se přidá 500 µl sterilní destilované vody a pořádně se promyje, aby došlo k rozptýlení buněk ode dna. 4. Takto připravený vzorek se dá opět zcentrifugovat, za stejných podmínek jako u první centrifugace. 5. Vzorek vyjmutý z centrifugy se opět slije a pořádně osuší do buničiny. Na dně zůstanou buňky s potřebnou DNA. K sedimentu se připipetuje 170 µl komerčně vyráběného roztoku Chelex. Před pouţitím se musí pořádně promíchat. Chelex slouţí k lyzaci buněk a vyvázání DNA. 6. Ke vzorku s Chelexem se přidá 20 µl proteinázy K. Proteináza K pracuje pouze při 56 C a proto se vzorek umístí do termostatu na jednu hodinu. Proteináza odštěpí všechny proteiny ve vzorku, aby neohrozily pozdější reakce. 7. Po hodinové inkubaci se vzorek musí aktivovat na termobloku při 96 C po dobu 8 minut. 8. Po aktivaci se vzorek stočí v centrifuze. Centrifugace probíhá při pokojové teplotě po dobu 5 minut a při 10 000 otáčkách. Během centrifugace se vzorek ve zkumavce rozdělí na dvě vrstvy. V dolní části zkumavky je Chelex, v horní části DNA. 34

12. Měření koncentrace a čistoty DNA Koncentrace i čistota DNA se měří po izolaci DNA ještě před dalšími reakcemi, abychom zjistili, zda je jí ve vzorku dostatečné mnoţství a zda není kontaminována proteiny nebo RNA. Měření probíhá ve spektrofotometru, proměřuje se při dvou vlnových délkách: 260 nm a 280 nm. 12.1. Postup měření koncentrace DNA 1. Prázdná mikrozkumavka se označí identifikačním číslem příslušného vzorku. Do takto označené mikrozkumavky se napipetuje 45 µl sterilní destilované vody a 3 µl vyizolované DNA. Obsah zkumavky se dobře promíchá pomocí pipety, poté na Vortexu a nakonec se dá na 1 minutu stočit do centrifugy při 10 000 otáčkách. 2. Spektrofotometr se zapne, nakalibruje a změří se blank (voda v kyvetě). 3. Po změření blanku se do kyvety přelije vzorek a změří se absorbance při 260 nm a 280 nm. Koncentrace DNA se vypočítá ze vzorce: c(dna) = 62,9 x A (260 nm) 36,0 x A (280 nm). Výsledek vychází v jednotkách µg/ml. Optimum koncentrace DNA je okolo 0,08 µg/µl. [14] 12.2. Postup měření čistoty DNA 1. Postup měření čistoty DNA je obdobný jako u měření koncentrace DNA. 2. Poměr změřených absorbancí A 1 (260 nm)/ A 2 (280 nm) udává čistotu DNA. Moţné výsledky: poměr A 1 /A 2 = 1,7;1,8 čistá DNA > 1,9 DNA znečištěná RNA nebo organickými látkami < 1,7 DNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami[14] 35

13. Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce slouţí k amplifikaci poţadovaného úseku DNA. Na OLG FN Brno se PCR reakce provádí dle Devyser Complete 54 testu. Součástí dodávaného setu jsou komerčně dodávané Devyser Complete Mixy (1, 2), které obsahují pufr, fluorescenčně značené primery a volné nukleotidy a dále PCR aktivátor, ve kterém se nachází polymeráza. Jeden Devyser Complete Mix je moţno pouţít na devět reakcí. Aby se neustále nerozmrazoval a opětovně nezamrazoval na oddělení OLG FN Brno se rozpipetovává do jednotlivých zkumavek alikvotů, které obsahují mnoţství Devyser Complete Mixu 1, resp. 2 a PCR aktivátoru potřebného pouze pro jednu reakci.[1] 13.1. Postup polymerázové řetězové reakce 1. Mikrozkumavky s Mixy a PCR aktivátorem se promíchají na Vortexu a krátce stočí v centrifuze. K připravení reakčního masteru mixu se k Devyser Complete Mixu 1, 2 přidá pipetou 10 µl PCR aktivátoru. Roztok se pořádně promíchá nejprve pipetou poté na Vortexu. 2. Napipetuje se 20 µl reakčního masteru mixu 1 a 2 do PCR mikrozkumavek. Mikrokumavky krátce stočíme. 3. Do mikrozkumavky se připipetuje 5 µl vzorku s izolovanou DNA. Mikrozkumavka se opět promíchá na Vortexu a chvíli se nechá centrifugovat. 4. Mikrozkumavka se vzorkem se vloţí do termocycleru a nechá se proběhnout PCR reakci, která je dokončena cca za 2 hodiny a 45 minut. 5. Po amplifikaci mikrozkumavky vyjmeme z přístroje a krátce stočíme. Obrázek 7: schéma amplifikace 36

14. Fragmentační analýza Fragmentační analýza se provádí v automatickém genetickém analyzátoru. Přístroj pracuje na principu elektroforézy v kapiláře. Analyzátor se musí nejdříve nakalibrovat barevnou sadou D s příslušným polymerem. [1] 14.1. Postup přípravy vzorku k aplikaci do genetického analyzátoru 1. Připraví se zaváděcí roztok smícháním 3 µl vnitřního standardu ( Gene-Scan-500 ROX) a 100 µl Hi-Di Formamidu. Roztok se promíchá na Vortexu. 2. Do jamek mikrotitrační destičky se napipetuje po 15 µl zaváděcího roztoku. 3. Do jamek se připipetuje 1,5 µl vzorku, kaţdý vzorek má zvláštní jamku pro Mix 1 a Mix 2. 4. Destička se uzavře. 37

15. Výsledky QF PCR Chromozom specifické krátké opakované sekvence DNA jsou amplifikovány PCR reakcí. Vizualizací fluorescenčně značených primerů, můţeme kvantifikovat produkty polymerázové řetězové reakce. Kvantifikací se rozumí výpočet plochy STR píku pomocí automatického DNA sekvenátoru. [1] Kaţdý z Devyser Complete Mixů obsahuje určité markery, vyskytující se na daném chromozomu s přesnou lokací a specifickou barvou fluorofru. Hodnotitelný rozsah pro výšku píků je mezi 50 a 6000 relativních fluorescenčních jednotek. Ostatní píky s odlišným rozsahem nejsou brány v potaz. [1] Tabulka 2: přehled markerů Devyser Complete Mix 1 [1] 38

Tabulka 3: přehled markerů Devyser Complete Mix 2 [1] 39

V případě analyzování materiálu z potracených plodů se kromě chromozomů 13, 18, 21, X a Y vyšetřují ještě chromozomy 15, 16 a 22, které jsou častou příčinou abortu, protoţe způsobují vady plodu neslučitelné se ţivotem. K testování těchto přídatných chromozomů se pouţívají Devyser Extend Mixy 1, 2 a 3, který obsahuje markery pro dané chromozomy. Název markeru Pozice Velikost markeru (bp) Barva fluoroforu 15 A 15q15.1 189-237 zelená 15 B 15q26.2 323-362 zelená 15 C 15q12 160-212 ţlutá 15 D 15q12 240-312 modrá 16 C 16q24.1 258-310 ţlutá 16D 16p11.2 242-290 zelená 16 E 16q13 317-352 modrá 16 F 16q11.2 365-401 modrá 16 G 16q22.3 122-154 ţlutá 22 A 22q13.1 127-167 zelená 22 B 22q13.1 405-467 modrá 22 C 22q11.2 367-415 zelená 22 D 22q12.1 192-236 modrá 22 E 22p13 115-175 modrá Tabulka 4: přehled markerů Devyser Extend Mix 1 [2] 40

Název markeru Pozice Velikost markeru (bp) Barva fluoroforu 13 A 13q12.12 232-323 zelená 13 B 13q21.32 365-425 modrá 13 C 13q31.3 425-474 ţlutá 13 D 13q13.3 413-479 zelená 18 A 18q11.31 190-230 zelená 18 B 18q12.3 180-228 ţlutá 18 C 18q12.3 298-350 modrá 18 D 18q22.1 325-403 zelená 18 I 18q21.31 360-415 ţlutá 21 A 21q21.3 150-207 modrá 21 B 21q21.1 220-285 modrá 21 C 21q22.3 256-353 ţlutá 21 D 21q22.13 440-492 modrá Tabulka 5: přehled markerů Devyser Extend Mix 2 [2] 41

Název markeru Pozice Velikost markeru (bp) Barva fluoroforu X 1 Xq26.2 120-170 zelená X 2 Xq13.1 230-260 zelená X 3 Xq26.2 262-315 ţlutá X 4 Xq21.33 290-340 modrá X 5 Xq26.1 392-430 zelená X 6 Xq28 430-500 modrá X 8 Xq21.31 100-140 modrá Y 1 Yp11.31 235 (+/- 3 bp) modrá Y 2 Yq11.223 346-380 modrá XY 1 XY 2 Xq22.22 Yp11.2 Xq21.3 Yp11.31 X = 105 Y = 111 (+/- 2,5 bp) zelená 180-222 modrá 7 X 7q34 Xq13 7 = 182 X = 202 (+/- 3bp) zelená T 2 Xq23 2p23.2 X = 114 2 = 118 (+/- 3 bp) ţlutá Tabulka 6: přehled markerů Devyser Extend Mix 3 [2] 42

16. Příklady výsledků kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce Obrázek 8: příklad testu Devyser Complete Mix 1 Na obrázku jsou testovány chromozomy 21, 18 a 13. Kaţdý z chromozomů je analyzován v několika markerech. Marker 21 A zobrazuje dva píky, stejně jako marker 13 B, 21 D, 18 A, 18 D a 13 D. Dva píky u těchto markerů svědčí o normální karyotypu jedince, tzn. ţe kaţdý chromozom se vyskytuje v páru a není zde přítomna ţádná odchylka. Markery 21 B, 18 C a 13 A jsou neinformativní, zobrazují pouze jeden pík. 43

Obrázek 9: pokračování testu Devyser Complete Mix 1 Obrázek 9 ukazuje analýzu dalších STR markerů na stejných chromozomech jako u předešlého obrázku. Dva píky opět svědčí pro normální karyotyp. Třetí pík u markeru 21 C je artefakt QF-PCR a nepočítá se do analýzy. Markery s jedním píkem jsou opět neinformativní. 44

Y Obrázek 10: příklad testu Devyser Complete Mix 2 V testu Devyser Complete Mix 2 se analyzují opět chromozomy 13, 18, 21 a pohlavní chromozomy. Marker XY2 zobrazuje dva píky ve stejném poměru, coţ znamená, ţe u plodu je přítomen jak X chromozom, tak Y chromozom, jedná se tedy o chlapce. Pro plod muţského pohlaví svědčí i STR marker Y, kde je zobrazen jeden pík, značí tedy přítomnost jednoho Y chromozomu. Ostatní markery mají opět dva píky resp. jedinec má dva chromozomy 13, 18, 21. 45

Obrázek 11: pokračování testu Devyser Complete Mix 2 Marker 18 J je neinformativní, má pouze jeden pík. Marker X 3 ukazuje na přítomnost jednoho X chromozomu. Markery chromozomu 21 a 13 mají korektní počet chromozomů. Z výsledků testů Devyser Complete Mix 1 a 2 vyplývá, ţe plod má normální karyotyp muţského pohlaví, tedy 46, XY. 46

Po zhodnocení výsledků analýzy QF-PCR se musí vydat report, který informuje o případných odhalených abnormalitách, o pohlaví plodu aj. Obrázek 12: příklad reportu QF-PCR analýzy 47

Obrázek 13: příklad testu Devyser Extend Mix 1 Obrázek 13 zobrazuje analýzu potraceného plodu. Z grafu vyplývá, ţe se jednalo o jedince s normálním karyotypem, kaţdý marker má dva píky. Na rozdíl od testu Devyser Complete se zde vyšetřují také chromozomy 15, 16 a 22. 48

Obrázek 14: pokračování testu Devyser Extend Mix 1 Na obrázku 14 se objevují opět dva píky u kaţdého markeru. Jde o zdravého jedince. 49

Obrázek 15: příklad testu Devyser Extend Mix 2 Aţ na marker 18 C, který má pouze jeden pík a stává se tímto neinformativním, jsou ostatní markery v pořádku. 50

Obrázek 16: pokračování testu Devyser Extend Mix 2 U markeru 21 C nacházíme 4 píky. První dva jsou však artefakty QF-PCR reakce. Odhalit tyto artefakty není lehké, závisí to hlavně na zkušenosti pracovníka. Obecně lze říci, ţe píky u markeru 21 C v porovnání s jinými výsledky se vyskytují ve větší vzdálenosti od začátku osy neţ píky artefaktů. 51

Y Obrázek 17: příklad testu Devyser Extend Mix 3 Na tomto obrázku se testují pohlavní chromozomy. U všech markerů analyzujích X chromozom se nachází dva píky, jedinec má tedy dva chromozomy X. U markerů pro chromozom Y není ani jeden pík. Plod je tedy ţenského pohlaví. 52

Obrázek 18: pokračování testu Devyser Extend Mix 3 Oba markery mají dva píky, nevyskytují se zde ţádné patologie. Výsledkem této analýzy je tedy normální karyotyp jedince bez chromozomových aneuploidií chromozomu 13,15, 16, 18, 21, 22. X a Y a jde o plod ţenského pohlaví. 53

Obrázek 19: příklad testu Devyser Extend Mix 1 s patologií Markery 22 D, 16 D, 15 B a 22 C mají pouze jeden pík, proto jsou neinformativní. Ostatní markery se v grafu zobrazují jako dva píky v poměru 1:2. To znamená, ţe jedinec je postiţen triploidií. 54

Obrázek 20: pokračování testu Devyser Extend Mix 1 s patologií Marker 16 G zobrazuje dva píky v poměru 1:2. Markery 15 C a 16 C ukazují tři samostatné píky. Všechny tyto markery svědčí pro zastoupení chromozomů v počtu tří. 55

Obrázek 21: příklad testu Devyser Extend Mix 2 s patologií Aţ na marker 13 B a 18 A, které jsou neinformativní poukazují všechny markery na přítomnost tří chromozomů. Píky jsou v poměru 1:2 nebo se zde nachází tři samostatné píky. 56

Obrázek 22: pokračování testu Devyser Extend Mix 2 s patologií Markery opět dokazují triploidii. 57

Y Obrázek 23: příklad testu Devyser Extend Mix 3 s patologií Devyser Extend Mix 3 se zabývá pohlavními chromozomy. Marker XY 2 vykazuje 2 píky pro X chromozom a jeden pík pro Y chromozom. Přítomnost Y chromozomu potvrzuje i marker Y ay 2, kde je vţdy vyobrazen jeden pík. 58

Obrázek 24: pokračování testu Devyser Extend Mix 3 s patologií Výsledek této analýzy je karyotyp 69, XXY. Plod byl postiţen triploidií a z toho důvodu došlo ke spontánnímu abortu. Odchylka je neslučitelná se ţivotem. 59

Obrázek 25: příklad testu Devyser Extend Mix 2 s patologií Na obrázku je znázorněn pouze Devyser Extend Mix 2, protoţe chromozomová aneuploidie se týká chromozomu 21, který je analyzován jen v tomto Mixu. Jedinec byl postiţen trizomií chromozomu 21. U všech markerů analyzující chromozom 21 lze vidět vţdy dva píky v poměru 1:2, coţ informuje o přítomnosti třech chromozomů 21. Ostatní markery mají dva píky, nejsou nijak odchýlené od normy. 60

Obrázek 26: pokračování testu Devyser Extend Mix 2 s patologií Jako na předešlém obrázku marker pro 21. chromozom, 21 C vykazuje píky v poměru 1:2. 61

Obrázek 27: příklad testu Devyser Complete Mix 1 kontaminovaného mateřskou krví, píky jsou nehodnotitelné 62