Prenatální diagnostika KBI/GENE Mgr. Zbyněk Houdek
Prenatální diagnóza Pod tímto pojmem se skrývá diagnóza genetických chorob v průběhu těhotenství. Tyto informace mohou vést k naplánování odpovídající lékařské, chirurgické, psychologické intervence nebo i k ukončení gravidity. Při těchto vyšetřeních hrají roli přesný časový plán, přesnost a bezpečnost.
Ultrazvukové vyšetření V Severní Americe a západní Evropě se toto vyšetření dělá u žen starších 35 let už ve 12. týdnu těhotenství, aby se určilo gestační stáří. Další ultrazvukové vyšetření se provádí v 18.-20. týdnu těhotenství, aby se zjistily možné tělesné odchylky plodu. Pokud jde o předčasné ukončení těhotenství, tak je pro matku bezpečnější, když je provedeno do konce 1. trimestru (do 13. týdne). V celé Evropě je předčasné ukončení těhotenství prováděno do konce 24. týdne, ale pokud jsou prokázány těžké abnormality plodu, je právně povolena hranice do 40. týdne těhotenství.
Neinvazivní postupy vyšetření Ultrazvukové zobrazení na monitoru je možno odhalit asi 300 malformací bez negativních vlivů pro matku i dítě. Optimální je toto vyšetření provést mezi 18.-20. týdnem těhotenství odhalení defektů u nervové trubice (NTD) a mozku (hydrocefalus, mikrocefalus), skeletální poruchy, rozštěpy rtů a patra, strukturální abnormality břišních org. a srdce. Je možno zjistit životaschopnost, věk a růst plodu, vícečetné těhotenství, lokalizaci placenty a objem amniové tekutiny. Rentgenové vyšetření by mělo být během těhotenství vzhledem k mutagennímu působení X-paprsků vyloučeno (výjimkou je vyšetření skeletálních poruch=dysplazií plodu). Magnetická rezonance se provádí při diagnostice anomálií vnitřních org. (např. malformace mozku).
Vyšetření krve Krevní sérum získané od matky obsahuje cenné indikátory, které mají vztah k postižení plodu Downovým syndromem (hladina alfafetoproteinu=afp, lidského choriového gonadotropinu=hcg a nekonjugovaného estriolu=ue3) a dalších trisomií 18. a 21. ch. Hladina AFP a UE3 se u matek s postiženým plodem snižuje, naopak u hcg se zvyšuje Triple-test odhalí až 60% těhotenství s D. syndromem. Pokud zjišťujeme zvýšený inhibin A a ultrasonografii záhlaví plodu, pak odhalíme i více než 80% plodů s D. syndromem.
Invazivní postupy K invazivnímu testování se přistupuje pokud je riziko postižení plodu vyšší než riziko potratu způsobené samotným zákrokem. Závažné okolnosti: Narození mrtvého plodu nebo narození dítěte s těžkým postižením. Prenatální vyšetření se provádí v případě: Věk matky v době porodu je vyšší než 35 let Nové nebo zjištěné chromozomální abnormality u předchozího dítěte Výskyt zjistitelné genetické poruchy a X-vázané choroby v rodině Zvýšená hladina AFP v séru matky anebo výskyt NTD v rodině Rodiče jsou přenašeči nebo jejich příbuzenství v rodinách s výskytem recesivní choroby Pro nemoc a medikace matky nebo její vystavení účinkům mutagenů Abnormální objem amniové tekutiny.
Biopsie choriových klků Odběr choriových klků (CSV) placenty, kterou provádíme v 10.-12. týdnu zavedením katetru přes děložní krček nebo transabdominální punkcí až do data porodu. Tyto zákroky je třeba kontrolovat ultrazvukem a jsou doprovázeny rizikem potratu, které je vyšší než spontánní potrat (7%). Z odebraného jaderného materiálu se dá stanovit karyotyp.
Amniocentéza Odběr amniové tekutiny se provádí zejména v 16.-18. týdnu těhotenství. Provádí se pro odhad koncentrace AFP a acetylcholintransferázové aktivity (riziko NTD). Nejprve určíme polohu placenty pomocí ultrazvuku, pak zavedeme asepticky jehlu přes břišní stěnu matky do amniové dutiny a odebereme 10-20 ml tekutiny s buňkami. Riziko potratu 0,5-2%. Možno stanovit karyotyp.
Kordocentéza Odběr krve z pupečníku plodu se provádí od 18. týdne opět zavedením tenké jehly (v ČR od 20. týdne). Tento zákrok je řízen pomocí ultrasonografie (riziko potratu 1 %) nebo fetoskopie (riziko potratu 3 %). Získaný materiál chromozomální analýza nebo vyšetření DNA. Fetoskopie prohlídka plodu pomocí endoskopu (optické vlákno) při vyšetření obstrukčních poruch močového měchýře nebo odběr pro prenatální diagnózu závažných kožních a jaterních poruch.
Preimplantační genetická diagnostika Provádí se v souvislosti s fertilizací in vitro. Z 6- nebo 10-buněčného embrya odebrat 1 nebo 2 bb. a použít je na přímé vyšetření metodami PCR nebo FISH. To umožňuje výběr zdravých embryí pro implantaci. Kultivace těchto bb. odporuje britskému zákonu o lidském oplodnění a embryologii z r. 1990.
Genetická prevence Preventivní genetika je založena na odhalování faktorů přispívajících ke genetickému riziku. Je možno vytipovat a rozpoznat rizikové jedince, kteří mohou být poučeni jak modifikovat životní styl nebo jim nabídnout preventivní terapii či lékařský dohled a okamžité nemocniční léčení. Populační screening se provádí u těchto nosičů: Autozomálně recesivní choroby s vysokým výskytem Relativně častá X-vázaná onemocnění Autosomálně dominantní poruchy s pozdní manifestací. Pro populační screening jsou vhodná onemocnění přesně definovaná a jejichž včasná diagnóza je pro postiženého prospěšná. Test by měl být snadno proveditelný, neinvazivní, dostupný, morálně přijatelný.
Novorozenecký screening Tímto screeningem mohou být odhaleny fenylketonurie (Guthrieo test), galaktosémie (enzymatické vyšetření) a kongenitální hypothyreoidismus (stanovení thyroxinu a thyreotropního h.) jejich nedostatek způsobuje mentální opoždění. Hlavně screening na fenylketonurii se rutinně provádí ve většině rozvinutých zemí. Diagnostika cystické fibrózy je založena na imunologické kvantifikaci trypsinu v krvi a je doplněna analýzou DNA (PCR). Srpková anémie je odhalována pomocí elektroforézy hemoglobinu, průkaz srpkovitých erytrocytů při nižších hladinách O 2 a řady testů DNA.
Screening onemocnění v dospělosti Onemocnění s pozdní manifestací, pro které by mohl být screening doporučen: Huntingtonova nemoc Myotonickou dystrofii Retinitis pigmentosa Jejich časná diagnóza může umožnit psychologickou, emocionální a finanční přípravu pacienta. Prediktivní testování pro zděděnou predispozici k nádorovým onemocněním karcinom prsu / ovárií.
Huntingtonova nemoc Základem Huntingtonovy chorei jsou nadbytečná opakování CAG v exonu zmnožení glutaminu v proteinu. Tato choroba je zákeřná svou pozdní manifestací mezi 30-50 rokem věku jedince, kdy dochází k progresivní degeneraci nervového systému s nekontrolovatelnými pohyby a mentálním úpadkem.
Myotonická dystrofie Myotonická dystrofie je multisystémová porucha, která postihuje kosterní i hladké svaly, ale také oči, srdce, endokrinní a centrální nervový systém. Nemocní mají obvykle diabetes, svalovou slabost a atrofie, myotonii a převodní poruchy srdeční. Začátek manifestace je typicky kolem 20 a 30 let, méněčasto kolem 40. Myotonická dystrofie je nejčastější dědičnou neuromuskulární poruchou vyskytující se v dospělosti. V diagnostice je dominantní molekulární genetika, která prokáže expanzi trinukleotidových a tetranukleotidových repeticí.
Retinitis pigmentosa Při dědičném onemocnění sítnice zvaném retinitis pigmentosa odumírají světločivné buňky, což vede k postupnému zhoršování zraku a v nejhorších případech až k oslepnutí. Toto onemocnění, kterým trpí tři ažčtyři miliony lidí na celém světě, je způsobeno mutacemi různých genů, z nichž většina hraje důležitou roli v procesu detekce světla, např. genu pro opsin.
Diagnostické využití sekvenování DNA Sekvenování DNA se může využít v genetické diagnostice pokud chceme identifikovat specifické patogenní mutace. Výsledkem sekvenování krátkého úseku určitého genu je barevná křivka, která u konkrétního heterozygota při substituci 1 báze dává v tomto místě 2 báze (1 báze=1 vlákno DNA). V případě heterozygotní inzerce nebo delece je obraz složitější a dochází k překryvu sekvencí (mutované a normální). Sekvenování se může také použít k vyhledávání mutací v dlouhých sekvencích DNA a to v případě, kdy mutace není známa a pak může být detegována široká paleta mutací. Přímé sekvenování se provádí při identifikaci mutací genů BRCA1 a BRCA2 u nádorového onemocnění prsu.
Diagnostické využití PCR Význam PCR pro genetickou diagnostiku tkví možnosti vytvořit velké množství specifických genových sekvencí, které se mohou podrobit další analýze. Primery se používají tak, aby vymezily konkrétní oblast genu nebo naopak mnohočetné oblasti: Diagnostika poruch tripletových repetic (Huntingtonova choroba). Přímé sekvenování genů. Detekce bodové mutace (srpková anémie). Kvantitativní PCR kvantitativní detekce delecí v dystrofinovém genu odpovědném za Duchenneovu muskulární dystrofii.
RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) Polymorfismus délky restrikčních fragmentů, je metoda založená na restrikčním štěpení DNA, elektroforetické separaci štěpů a hybridizaci se specifickou sondou (Southernův přenos). Mutace v restrikčním místě změní velikost restrikčních fragmentů a tedy i velikost proužků po hybridizaci. RFLP analýza je závislá na dostupnosti DNA sond pro detekci homologních sekvencí. RFLP markery na jaderné DNA jsou používány v genetické analýze pro sestavování RFLP map. Ve srovnání s metodami postavenými na amplifikační strategii však vyžaduje velké množstvíčisté DNA. Celý postup od izolace přes restrikci až k hybridizaci je poměrněčasově náročný. Tato metoda je současně používána k identifikaci různých genotypů, včetně lidského, a je hojně používána v soudním lékařství nebo k určování paternity. V genetické diagnostice se používá v případech, kdy v jednom rozsáhlém genu existuje pestrá škála mutací gen dystrofinu, který je odpovědný za vznik Duchennenovy svalové dystrofie.
Nothernový přenos (Northern blotting) Je to metoda zaměřená na studium transkripce, tedy mrna. Metoda je založena na detekci specifické mrna pomocí její hybridizace se specifickými značenými sondami. Zahrnuje elektroforézu b. RNA imobilizaci na membránu hybridizaci se specifickou sondou. Možnost zjistit přítomnost specifické mrna a odhadnout její velikost za předpokladu dostatečně specifické sondy. Tak můžeme získat informaci o relativní úrovni exprese určitého g. Nevýhody: určí pouze relativní mn. RNA, potřebné velké mn. RNA (10 µg RNA).
Southernův přenos Southernův přenos je metoda, kdy dochází k přenosu DNA na membránu a pak následuje hybridizace genomové DNA, která byla rozštěpena restrikční endonukleázou, rozdělena elektroforézou a přenesena z agarózového gelu na nitrocelulózový filtr. Vlastní hybridizace se provádí s radioaktivně nebo neradioaktivně značenou sondou v roztoku. Po ní následuje vizualizace pomocí autoradiografie. Při použití neradioaktivně (chemiluminiscenčně) značené sondy, je možná přímá vizualizace. Metoda informuje o přítomnosti úseků DNA homologních se sondou a přibližně i o jejich počtu. Využití S. přenosu v genetické diagnostice spočívá ve využití jako sondy sekvence DNA v blízkosti mutace. Přeruší-li mutace normální štěpné místo, zůstává tento segment intaktní. Přítomnost nebo nepřítomnost mutace se poté může určit srovnáním velikosti fragmentů příkladem je určení srpkové anémie.