CHORUS CALPROTECTIN 86600 (12 testů) Výrobce: DIESSE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Itálie
OBSAH 1 Úvod... 3 2 Princip testu... 3 3 Složení soupravy... 4 4 Další potřebné vybavení k provedení testu... 5 5 Skladování a stabilita komponent... 6 6 Bezpečnost práce... 6 7 Technické připomínky... 7 8 Vzorky a jejich skladování... 7 9 Pracovní postup.... 7 10 Validita testu... 8 11 Hodnocení výsledků... 8 12 Interpretace výsledků... 8 13 Charakteristika soupravy... 9 14 Literatura... 11 15 Vysvětlení symbolů... 12 2/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
Kvantitativní stanovení kalprotektinu ze stolice na přístroji Chorus/Chorus Trio pomocí jednorázového testovacího zařízení 1 Úvod Kalprotektin je protein přítomný v neutrofilech a jeho vysoká koncentrace ve stolici je příznakem zánětu. Vysoké hladiny tohoto proteinu jsou typicky pozorovány u pacientů s ulcerativní kolitidou (UC), Crohnovou nemocí (CD), kolikou, žaludečními a jícnovými neoplazmy. Zvýšené hodnoty toho proteinu navíc můžeme pozorovat u všech patologických stavů, které vyžadují aktivaci akutního nebo chronického zánětlivého procesu v gastrointestinálním traktu. 2 Princip testu Jednorázový test připravený k použití na přístrojích Chorus/Chorus Trio umožňuje stanovení kalprotektinu ve stolici. Test je založen na principu ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). Polyklonální protilátky jsou navázány na pevnou fázi. V průběhu inkubace vzniká vazba mezi kalprotektinem z vyšetřované stolice a imobilizovanými protilátkami. Po promytí, která eliminují nenavázané proteiny, se provádí inkubace s konjugátem. Konjugát je roztok s obsahem protilátek proti kalprotektinu značených křenovou peroxidázou. Po další sérii promytí, které odstraní nenavázaný konjugát, se přidá substrát reagující s peroxidázou. Intenzita barvy, která vznikne, je přímo úměrná koncentraci kalprotektinu v testované stolici. Jednorázový test obsahuje všechny reagencie nutné k provedení testu na přístrojích Chorus. Výsledky jsou vyjádřeny v jednotkách mg/kg. 3/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
3 Složení soupravy Souprava umožňuje provést 12 stanovení. Testovací jednotka 2 samostatná balení po 6 jednotlivých jednorázových testech Kalibrátor 2 6 ks 1 0,3 ml Roztok kalprotektinu, v pracovním ředění Pozitivní kontrola 1 0,6 ml Roztok kalprotektinu, v pracovním ředění Pracovní návod 1 ks Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu a ze samostatných balení odeberte stanovený počet jednorázových testů pro vlastní analýzu. Zbylé jednorázové testy vraťte zpět do obalu se sušidlem (silikagel gel obsahující oxid křemičitý), vytlačte vzduch a hermeticky uzavřete stisknutím uzávěru. Skladujte při +2 C až +8 C. 4/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
Obrázek 1 Schéma jednorázového testu Pozice 8 Pozice 7 Pozice 6 Pozice 5 Pozice 4 Místo pro štítek s čárovým kódem Prázdná pozice Mikrotitrační jamka s potaženými polyklonálními protilátkami Nepotažená mikrotitrační jamka TMB Substrát Tetrametylbenzidin 0,26 mg/ml a 0,01% H2O2 stabilizovaný v 0,05 mol/l citrátového pufru (ph 3,8) Pozice 3 Ředicí roztok vzorků Proteinový roztok obsahující 0,05% fenol, 0,02% Bronidox a indikátor přítomnosti séra Pozice 2 Konjugát Roztok monoklonálních protilátek značený peroxidázou ve fosfátovém pufru obsahujícím 0,05% fenol a 0,02%Bronidox Pozice 1 Prázdná jamka Do této jamky se přidá vyšetřovaný vzorek 4 Další potřebné vybavení k provedení testu Tyto reagencie nejsou součástí balení. Promývací roztok 83606 Čistící roztok 83609 Sanitační roztok 83604 83608 Destilovaná nebo deionizovaná voda Běžné laboratorní sklo: odměrné válce, zkumavky atd. Mikropipety na přesný odběr 50 až 200 μl roztoku Jednorázové rukavice Roztok chlornanu sodného (5 %) Nádoby na potenciálně infekční materiál 5/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
5 Skladování a stabilita komponent Reagencie se musí skladovat při teplotě +2 C až +8 C. V případě skladování při nesprávné teplotě se musí zopakovat kalibrace a validovat test pomocí kontrolního séra (viz 10, Validita testu). Datum exspirace je uvedeno na každé komponentě a na štítku soupravy. Po otevření mají reagencie omezenou stabilitu. Jednorázový test 4 týdny při teplotě +2 C až +8 C Pozitivní kontrola 4 týdny při teplotě +2 C až +8 C Kalibrátor 4 týdny při teplotě +2 C až +8 C Extrakční roztok 3 měsíce při teplotě +2 C až +8 C 6 Bezpečnost práce Souprava je určena pouze pro diagnostické účely in vitro. Tato souprava obsahuje materiály lidského původu, které byly testovány a vykázaly negativní výsledky při použití metod schválených FDA pro stanovení přítomnosti HbsAg a anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátek. Protože však žádný diagnostický test nemůže poskytnout úplnou záruku, že infekční agens nejsou přítomna, je třeba s veškerým materiálem lidského původu zacházet tak, jako by byl potenciálně infekční. Při zacházení s materiálem lidského původu je nutné dodržovat všechny místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Likvidace zbytků pro provedení testu S použitými vzorky, kalibrátory, jednorázovými testy je třeba zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem a likvidovat je v souladu s platnou legislativou. Zdravotní a bezpečnostní informace 1. Nepipetujte ústy. Používejte rukavice na jedno použití a ochranu očí. Po umístění jednorázového testu do přístroje CHORUS si důkladně umyjte ruce. 2. Pro zjištění informací o chemikáliích použitých v tomto testu využijte prosím Bezpečnostní list, který je na vyžádání k dispozici. 3. Neutralizované kyseliny nebo jiný tekutý odpad by se měl dekontaminovat přidáním dostatečného množství chlornanu sodného tak, aby konečná koncentrace dosahovala minimálně 1,0 %. Pro zajištění účinné dekontaminace ponechejte tento odpad 30 minut v 1% chlornanu sodném. 4. Rozlitý potenciálně infekční materiál je třeba okamžitě odstranit pomocí absorpčního papírového ručníku a kontaminovanou oblast umýt, například 1,0% chlornanem sodným, a to předtím, než budete v práci pokračovat. Chlornan sodný nepoužívejte na rozlité tekutiny s obsahem kyseliny, ty musíte nejprve otřením vysušit. 6/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
5. Materiály použité k čištění potřísněných povrchů, včetně rukavic, se musí likvidovat jako potenciálně životu nebezpečný odpad. Materiály obsahující chlornan sodný nevkládejte do autoklávu. 7 Technické připomínky Pro získání spolehlivých výsledků je nutné přesné dodržování návodu. Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu (+18 C až +30 C) a test proveďte do 60 minut. Zkontrolujte a dodržujte následující informace: Substrát obsažený v pozici 4 je bezbarvý. Nepoužívejte jednorázové testy, které toto nesplňují. Testovaný vzorek je dokonale na dně jamky rozprostřen. Zkontrolujte zdali všechny reagencie v testu jsou přítomny a jestli není jednorázový test poškozen. Nepoužívejte testy, které nemají reagencie. Jednorázové testy jsou určeny pro použití na přístroji Chorus. Důkladně dodržujte pokyny pro použití a řiďte se návodem k obsluze přístroje (verze Softwaru 3.2.1 a následné verze). Chorus přístroj správně nastavený (viz návod k obsluze). Neměňte čárový kód umístěný na držadle jednorázového testu. Nepoužívejte testy s poškozenými štítky s čárovými kódy. Defektní čárové kódy lze vložit do přístroje manuálně. Během skladování a použití nevystavujte jednorázové testy silnému světlu ani výparům chlornanu. Nepoužívejte jednorázový test po uplynutí expiračního data. Zkontrolujte, zdali je na přístroj připojen Promývací roztok (Ref. 83606). 8 Vzorky a jejich skladování Jako vzorek k vyšetření je použit vzorek stolice. Zachází se s ním v souladu se všemi opatřeními předepsanými správnou laboratorní praxí. Čerstvý vzorek lze skladovat 4 dny při +2 C až +8 C. Stolici je možné uchovávat při -20 C. Neskladujte vzorky v mrazácích s funkcí vlastního rozmrazování. Rozmrazené vzorky je potřeba před použitím důkladně protřepat. 9 Pracovní postup. 1. Otevřete balení, vyjměte požadovaný počet jednorázových testů a zbytek uzavřete zpět do sáčku poté, co vytlačíte vzduch. 2. Zkontrolujte stav jednorázového testu (viz 7 Technické připomínky). 7/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
3. Pipetujte 50 μl vzorku do pozice 1 každého testu. Při každé změně šarže soupravy použijte jednorázový test pro kalibraci a pipetujte 130 µl Kalibrátoru do pozice 1. Pokud použijete Pozitivní kontrolu, pipetujte 130 µl Pozitivní kontroly do pozice 1. 4. Jednorázový test umístěte do přístroje. Proveďte kalibraci (je-li nutná) a vlastní stanovení podle pokynů uvedených v návodu k obsluze Chorus přístroje. 5. Připravte extrakční roztok v pracovním ředění. Smíchejte 1 ml koncentrovaného roztoku s 1,5 ml destilované vody. Použijte pro vzorky s koncentrací větší než 250 mg/kg. 10 Validita testu Pomocí pozitivní kontroly ověřte správnost získaných výsledků. Použijte je v souladu s instrukcemi uvedenými v návodu na obsluhu. Pokud test ukáže, že se hodnota pozitvní kontroly pohybuje mimo přijatelné rozmezí, kalibraci je třeba opakovat. Předchozí výsledky budou automaticky opraveny. Pokud je výsledek pozitivní kontroly i nadále mimo přijatelné rozmezí, kontaktujte prosím technickou podporu: Tel: +39-0577-319554 Fax: +39-0577-366605 Email: scienticsupport@diesse.it 11 Hodnocení výsledků Přístroj Chorus vyjadřuje výsledky v mg/kg vypočítané na základě grafu, který je uložený k příslušné šarži v přístroji. Hodnocení výsledků je popsáno v tabulce (Tabulka 1). Tabulka 1 Hodnocení výsledků mg/kg menší než 40 Hodnocení negativní 40 až 60 hraniční větší než 60 pozitivní V případě hraničního výsledku zopakujte test. 12 Interpretace výsledků Všechny pozitivní výsledky vyžadují pečlivou interpretaci. Test nelze použít pouze jako jedinou metodu pro stanovení klinické diagnózy. Nález je třeba vždy interpretovat pouze v kontextu s výsledky ostatních laboratorních testů a s klinickým obrazem 8/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
pacienta. K vyhodnocení je zapotřebí přístroje Chorus/Chorus Trio, příslušný Softwaru 1.2.3 a následné verze. 13 Kalibrační rozmezí Kalibrační rozmezí se pohybuje v oblasti 12,5 až 250 mg/kg. Jestliže se objeví vzorky s výsledkem stanovení nad 250 mg/kg je nutné tyto vzorky naředit extrakčním roztokem. 14 Referenční rozmezí Klinické studie (4,9) ukazují, že se normální hodnoty kalprotektinu ve stolici pohybují na hladině 25 mg/kg. 15 Charakteristika soupravy 15.1 Diagnostická citlivost a specifita Pro stanovení citlivosti a specifity bylo využito srovnání výsledků na jiné referenční soupravě. Při srovnání bylo testováno 42 vzorků. Výsledky srovnání jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 2). Tabulka 2 Výsledky srovnání zařazení testovaných vzorků Referenční souprava DIESSE Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní 23 0 23 Negativní 1 18 19 Celkem 24 18 42 Souprava vykazuje 100% specifitu (CI95% 82,4 až 99,8) a 95,8% citlivost (CI95% 79 až 99,1). Shoda mezi oběma metodami je vynikající s Cohen Kappa 0,96. 9/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
15.2 Přesnost měření Intra-assay: všechny testované vzorky byly změřeny; průměr naměřených hodnot, směrodatná odchylka a variační koeficient (%) každého vzorku jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 3). Tabulka 3 Intra-assay stanovení Vzorek Průměr (mg/kg) Intra-assay Variační koeficient (%) 1 Méně než 12,5-2 52,2 4,3 3 105 5,4 4 47,1 4,2 5 63,8 8 6 55,9 5,6 7 95,1 12,2 8 67 4,2 Inter-assay: všechny testované vzorky byly analyzovány; průměr naměřených hodnot, směrodatná odchylka a variační koeficient (%) každého vzorku jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 4). Tabulka 4 Inter-assay stanovení Vzorek Průměr (mg/kg) Inter-assay Variační koeficient (%) 1 Méně než 12,5-2 49,7 5,8 3 101,2 9,5 4 43,9 13,7 5 74,5 14 10/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
Přesnost mezi jednotlivými šaržemi a přesnost mezi použitými přístroji: všechny testované vzorky byly analyzovány; průměr naměřených hodnot, variační koeficient (%) každého vzorku jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 4). Tabulka 5 Přesnost mezi šaržemi a přesnost mezi přístroji Vzorek Průměr (mg/kg) Přesnost mezi šaržemi Variační koeficient (%) Přesnost mezi použitými přístroji Průměr (mg/kg) Variační koeficient (%) 1 12,6 0,8 13,6 14,9 2 54,9 9,8 51,5 8 3 119,5 10,6 109,4 12,1 4 55,4 14,4 50,5 14,5 5 87,9 7,3 84,6 14,4 16 Literatura 1. Jan Däbritz, Jason Musci, Dirk Foell. World J Gastroenterol 2014 January 14; 20(2): 363-375. 2. Tamara Pang, StevenT. Leach,Tamarah Katz, Andrew S. Day and CheeY. Ooi. Fecal biomarkers of intestinal health and disease in children January 2014. 3. Frank S. Lehmann, Emanuel Burri and Christoph Beglinger. The role and utility of faecal markers in inflammatory bowel disease Ther Adv Gastroenterol 2015, Vol. 8(1) 23 36. 4. J Tibble, K Teahon, B Thjodleifsson, A Roseth, G Sigthorsson, S Bridger, R Foster, R Sherwood, M Fagerhol, and I Bjarnason. A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn's disease.gut. 2000 Oct;47(4):506-13. 5. Røseth A.G. et al.: Assessment of the neutrophil dominating protein calprotectin in feces. Scand J Gastroenterol 1992; 27: 793-798. 6. Røseth A.G. et al.: Correlation between faecal excretion of Indium-111-labelled granulocytes and calprotectin, a granulocyte marker protein, in patients with inflammantory bowel disease. Scand J Gastroenterol 1999; 34:50-54. 7. BunnS.K. et al.: Fecal clprotectin: Validation as a non invasive measure of bowel inflammation in childhood inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001; 33: 14-22. 8. Limburg P.J. et al.: Fecal calprotectin levels predict colorectal inflammation among patients with chronic diarrhea referred for colonscopy. Am J Gastroenterol 2000; 95: 2831-2837. 9. Sohnle P.G. et al.: The zinc-reversible antimicrobial activity of neutrophil lysates and abscess fluid supernatants. Journal of Infectious Diseases 1991; 164: 137-142. 11/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015
17 Vysvětlení symbolů Použít do data Nepoužívat opakovaně Čtěte přiložené dokumenty Výrobce Počet testů Skladovací teplota Čtěte návod k použití Biologická rizika Katalogové číslo Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Číslo šarže Diesse Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy Tel. 0577-587111 12/12 Rif. IO-09/353-C; IFU 86600 Ed. 19.05.2015