ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgG OD024 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: 420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgG ELISA souprava pro kvalitativní a semikvantitativní detekci protilátek třídy IgG proti nukleárnímu antigenu1 (EBNA1) viru Epsteina a Barrové (EBV) v lidském séru nebo plazmě. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Test se používá též při diagnostice Burkittova lymfomu, nasofaryngeálního karcinomu, oportunních (oligo nebo polyklonálních) lymfomů. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. 3. PRINCIP TESTU: ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgG je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický rekombinantní antigen, který představuje imunodominantní epitop EBNA1. Jsouli v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA dvojstripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým rekombinantním antigenem STRIPS Ag 2 x 6 ks 1,3 ml Standardu A=negativní kontrolní sérum, r.t.u. 1) STA/CTRL 2 lahvičky 1,3 ml Standardu D=Standard 1 (kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1 2 lahvičky 1,3 ml Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum) r.t.u. ST E/ST 2 2 lahvičky 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát antiigg Px) r.t.u. CONJ 2 lahvičky 55 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 2 lahvičky 60 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 2 lahvičky 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 2 lahvičky 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 2 lahvičky Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1
Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISAVIDITEST TMBO, TMBBF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 L séra 500L ředicího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku 450 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10 o C. d. Konjugát antiigg Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 L jednotlivými kontrolními séry a ředěnými testovanými séry takto: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce DIL. Dále naplňte dvě jamky po 100 L Standardem D ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku negativním kontrolním sérem ST A/CTRL a zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2. S3, ) viz Tab 1. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum ST E/ST 2. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Pro ověření správnosti kalibrace, návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 30 minut (/ 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem antiigg Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu antiigg Px r.t.u. Inkubujte 60 minut (/5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (/ 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. 2
g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620690 nm. Tab 1.: Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL b ST D/ST 1 c ST D/ST 1 d ST A/CTRL e S1 f S2 g S3 h S... 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodno kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu Standardu D ST D/ST 1 ze dvou jamek. 2. Stanovte cutoff hodnotu. Cutoff hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Standardu D vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Standardu D se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 100% cutoff jsou negativní a séra s hodnotou OD > 130% cutoff jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cutoff hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cutoff hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 1,00 Negativní 1,00 1,30 / 1,31 3,00 3,01 6,00 > 6,00 3
Příklad: Získaná OD Standardu D = 1,023; 1,101 Průměrná hodnota OD Standardu D = 1,062 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor Standardu D = 0,18 Cutoff hodnota = 1,062 x 0,18 = 0,191 Hodnota indexu = 0,800 / 0,191 = 4,19 Pozn.: Hodnocení / znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Ležíli sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 12 týdny později. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: VCA VCA VCA EA (D) EBNA1 EBNA1 Stadium EBV infekce IgG IgM IgA IgG IgG IgM EBV negativní Primární EBV infekce (časná fáze) / Primární EBV infekce (transientní fáze) Primární EBV infekce (fáze rekonvalescence) Seropozitivní bez známek aktivní EBV infekce Reaktivovaná EBV infekce Anomální výsledek antiebna1 EBV IgG, antiebna1 EBV IgM může mimo jiné ukazovat na autoimunní chorobu. Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům EBV nabízí VIDIA tyto soupravy: ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgM; ELISA VIDITEST anti VCA EBV IgG, IgM a IgA; ELISA VIDITEST antiea (D) EBV IgG a IgM; Pro konfirmaci výsledků lze použít IFVIDITEST antivca EBV IgG a IgM; IFVIDITEST anti EA EBV (DR nebo D) IgG. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér by měly být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy reprodukovatelnosti (interassay) a během testuopakovatelnosti (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 4
10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A σ CV opak. 16 0,614 0,021 3,4 % 16 1,566 0,060 3,9 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů) n A σ min max CVrepro 16 0,618 0,059 0,513 0,744 9,5% 17 1,071 0,072 0,965 1,214 6,9% 16 2,454 0,096 2,306 2,630 3,9% 16 1,404 0,062 1,303 1,501 4,4% 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním vzorků vybraných z populace, kde byl očekáván pozitivní výsledek na IgG proti EBNA1 EBV (krevní dárci, pacienti po infekční mononukleose). Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy. Diagnostická citlivost je 94,7%. Specifita testu byla stanovena ze vzorků krevních dárců, kde byl očekáván EBNA1 IgG negativní výsledek (krevní dárci, imunodeficientní pacienti, pacienti ve fázi primoinfekce inf. mononukleosy). Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 95,6%. 10.4. Správnost testu 10.4.1. Test ředění Vzorky s vysokou, střední a nízkou koncentrací specifických protilátek byly po naředění na pracovní koncentraci dále ředěny 1,5krát, 2,25krát; 3,375krát; a 5,063krát ředicím roztokem a analyzovány. Naměřené hodnoty se odchylují od teoretické hodnoty maximálně o / 15%. 10.4.2. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.5. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. 5
11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti HIV1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Staneli se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISAVIDITEST, pokud není v návodu uvedeno jinak. b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. c. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. d. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti IgG Px jsou konzervovány ProClinem 300. e. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. f. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 6
13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě 2 až 10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. c. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě 18 až 28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě 2 až 10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 7
14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte Standardy a testovaná séra (100 L / jamku) Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Aplikujte konjugát antiigg Px r.t.u. (100 L / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 L / jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte stop roztok (100 L / jamku) Změřte absorbanci při 450 / 620690 nm do 20 minut Doporučená literatura: Dillner J. et al.: Antibodies against a synthetic peptide identify the EpsteinBarr virus nuclear antigen, Proc. Natl. Acad..Sci.U.S.A. 81: 4652 4656, 1984. Geltosky J.E. et al.: Use of synthetic peptidebased ELISA for the diagnostic of infectious mononucleosis, J. Clin. Lab. Analysis 1: 153 162, 1986. Rumpold H. et al.: The glycinealanine repeating region is the major epitope of the EpsteinBarr nuclear antigen1, J. Immunol. 138: 593 599, 1987. Smith R.S. et al.: A synthetic peptide for detections antibodies to EpsteinBarr virus nuclear antigen in sera from patients with infectious mononucleosis, J. Infect. Dis. 154: 885 889, 1986. Roubalová K., Horáček J., Němeček V. et al: Doporučené metody ve virologické diagnostice; Acta Hygien Epidemiol. Microbiol 2000;1, 1112 Sumaya CV: Serologic and virologic epidemiology of Epstein Barr virus: Relevance to chronic fatigue syndrom. Rev.Infect.Dis.1991;13 (Suppl): 1925 Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu. Datum poslední verze tohoto návodu: 02/2015 8