ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Mikrobiologie a hydrobiologie: Klasické metody barvení Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D. 217 17 5642 Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování: 2015 1
Mikrobiologie a hydrobiologie: Klasické metody barvení Obecně: Z důvodu podobnosti indexu lomu pozorovaných mikroorganismů a vody, jsou některé struktury velmi obtížně viditelné (usnadněním je optický systém fázového kontrastu). Proto se vyvinuly některé barvicí metody usnadňující tuto identifikaci a jejich smyslem je zdůraznit některé struktury, popř. je odlišit od jiných struktur. Barvicí techniky můžeme využít různým způsobem a k různým účelům. V praxi existuje barvení sloužící k diagnostice mikroorganismů. Obecné barvicí metody nás informují o velikosti a morfologii bakteriální buňky a mají diagnostický význam. Příkladem je Gramovo barvení, anebo Neisserovo atd. Barvení probíhá přímou aplikací barviv na fixovaný nátěr vzorku (suspenze bakterií, mikroorganismu apod.), ponechá se působit a po odlití přebytečného barviva se nátěr opláchne vodovodní vodou. Barvení sloužící ke studiu cytologických vlastností zahrnují např. barvení bičíků, kapsulí, cyst, spor, volutinových inkluzí, intracelulárních lipidů, glykogenu a granulózy, polysacharidových inkluzí, jaderného preparátu. Metoda 1: Gramovo barvení Podstata zkoušky: Barvení podle Grama je základní postup používaný při určování bakterií, které umožňuje rozlišit dle typu buněčné stěny na tzv. grampozitivní a gramnegativní. Principem je barvení fixované bakteriální kultury roztokem krystalové violeti a Lugolova roztoku a následné odbarvení působením organického rozpouštědla, např. etanolu nebo acetonu. Grampozitivní bakterie zůstanou fialově obarvené i po působení organického rozpouštědla, zatímco gramnegativní se odbarví. Aby byly i odbarvené gramnegativní bakterie lépe pozorovatelné pod mikroskopem, dobarví se kultura vhodným světlejším barvivem, nejčastěji safraninem na červeno. Přístroje a pomůcky: Bakteriologické kličky. Bunsenův kahan. Mikroskop s imerzním objektivem. Mikroskopická krycí skla. Pasteurovy pipety. Podložní mikroskopická skla se speciálně upravenou matnou plochou (umožňuje popsání vzorku fixem pro další jeho identifikaci). Střička s vodovodní vodou (popř. demineralizovanou vodou). Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Barvicí sada určená pro Gramovo barvení (obsahuje roztoky krystalické violetě, Lugolova roztoku, acetonu a safraninu). 2
Imerzní olej (1,25 index lomu světla). Postup zkoušky: Na povrch odmaštěného podložního mikroskopického skla se přenese bakteriální suspenze bakterií (pipetou či kličkou, záleží na typu matrice, ze které se identifikace provádí). Gramovo barvení vyžaduje poměrně přesnou práci, nejčastější problémy bývají způsobené příliš hustou nebo naopak nedostatečně hustou kulturou bakterií, příliš dlouhou fixací v plameni anebo nedostatečným odbarvením etanolem. Pokud to práce dovoluje, je lepší nechat preparát zaschnout na vzduchu, anebo v termostatu. Doporučením je provést i tzv. roztěr suspenze (vzorku) po povrchu podložního skla např. s pomocí krycího sklíčka. Krycí sklíčko se postaví na podložní sklo téměř kolmo ke kapce vzorku a pomalým pohybem po povrchu podložního skla se rozetře do tenké vrstvy, která se nechá pozvolna zaschnout anebo se fixuje v plameni. Fixovaný preparát se převrství roztokem krystalové violeti, nechá se působit po dobu 60 sekund. Přebytečné barvivo se slije a opláchne vodou. Dále se převrství Lugolův roztok, nechá se působit po dobu 60 sekund. Přebytečné barvivo se slije a opláchne vodou. K odbarvení se použije aceton anebo etanol. Odbarvujte do té doby, dokud odtéká barvivo. Opláchne se vodou, přebytečná voda se vysuší odcáknutím a nebo jemným odsátím buničitou vatou. Na vzorek se kápne roztok safraninu a nechá se působit 60 sekund. Opláchne se vodou, opatrně se vysuší a následuje mikroskopická analýza. Mikroskopování probíhá při 100 zvětšení objektivu, tento objektiv je imerzní. Na vybrané místo v preparátu, které se bude pozorovat, se kápne imerzní olej (viz obr. 1). Vyhodnocení: Gram-pozitivní bakterie (grampozitivní, G + ) jsou tmavě fialově anebo modře zabarvené. Gram-negativní bakterie (gramnegativní, G - ) jsou červené anebo růžové. Poznámka: Důvodem různého chování bakterií ke Gramovu barvení je rozdílná struktura buněčné stěny. Grampozitivní bakterie mají peptidoglykanovou vrstvu velice silnou (20-80 nm), navíc vyztuženou tzv. teichoovou kyselinou. Teichoová kyselina je tvořena polyglycerolfosfátem nebo polyribitolfosfátem navázaným na aminokyseliny nebo sacharidy peptidoglykanu. Teichoová kyselina může tvořit až 50 % sušiny buněčné stěny. Na povrchu peptidoglykanové vrstvy mají grampozitivní bakterie navázané další polysacharidy složené zejména z monosacharidů glukózy, manózy a galaktózy. Struktura těchto polysacharidů je specifická pro různé taxonomické skupiny grampozitivních bakterií (tyto polysacharidy jsou také první strukturou bakteriální buňky, na kterou reaguje imunitní systém při průniku bakterie do organismu vyšších živočichů). Gramnegativní bakterie mají peptidoglykanovou vrstvu velice tenkou (1-3 nm) a bez teichoové kyseliny. Nad touto vrstvou mají ale ještě tzv. vnější membránu, která je složena zejména z fosfolipidů, bílkovin a lipopolysacharidů. Tyto lipopolysacharidy představují opět první bakteriální strukturu, na kterou reaguje imunitní systém. Mezi peptidoglykanovou vrstvou a vnější membránou je tzv. periplazmatický prostor, ve kterém jsou mj. umístěny některé enzymy. Ve vnější membráně jsou poměrně časté póry tvořené bílkovinou porinem, které pronikají skrz periplazmatický prostor a peptidoglykanovou vrstvu až k cytoplazmatické membráně. Krystalová violeť i jod jsou nízkomolekulární látky, které snadno projdou buněčnou stěnou i cytoplazmatickou membránou mrtvé buňky. Uvnitř buňky pak spolu reagují za vzniku polymeru, který už ale při odbarvení přes tlustý a hustý peptidoglykan grampozitivních 3
bakterií zpět neprojde, naopak přes tenký a řídký peptidoglykan gramnegativních bakterií ano. Aplikace organického rozpouštědla pomůže odbarvení gramnegativních bakterií ještě tím, že vede k rozpuštění vnější lipidové membrány. I proto se gramnegativní bakterie odbarví a grampozitivní ne. Obr. 1. Vzorek aktivovaného kalu po obarvení Gramovo metodou. Detekce přítomnosti G + a G - bakterií. Foceno při použití imerzního objektivu 100. 4
Metoda 2: Neisserovo barvení Podstata zkoušky: Neisserova metoda slouží jako důkaz přítomnosti polyfosfátů, tj. energetických zdrojů v buňce. Metoda spočívá v rozlišení buněk/vláken na světle hnědá až žlutavá jako Neisser-negativní (N - ) a tmavě šedomodrá až fialová jako Neisser-pozitivní (N + ). Součástí činidla je methylenová modř selektivně se vázající na anionická místa polymerního polyfosfátového řetězce, čímž vzniká požadovaná barevná reakce. Používá se významně u vzorků aktivovaných kalů k identifikaci vláknitých mikroorganismů. Přístroje a pomůcky: Bakteriologické kličky. Bunsenův kahan. Mikroskop s imerzním objektivem. Mikroskopická krycí skla. Pasteurovy pipety. Podložní mikroskopická skla se speciálně upravenou matnou plochou (umožňuje popsání vzorku fixem pro další jeho identifikaci). Střička s vodovodní vodou (popř. demineralizovanou vodou). Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Barvicí sada určená pro Neisserovo barvení obsahuje 3 roztoky. Barvicí roztoky se musí před použitím zfiltrovat a připravují se na dobu 3 až 6 měsíců. Roztoky I. a II. se před vlastním barvením míchají v poměru 2:1 (2 díly roztoku I. a 2 díly roztoku II., např. 2 ml roztoku I. a 1 ml roztoku II.). Tato směs se připravuje vždy čerstvá! Roztok I. 0,1 g methylenová modř 5 ml etanol 5 ml kyselina octová 100 ml destilovaná voda Roztok II. 3,3 ml krystalová violeť (10% roztok v 95% etanolu) 6,7 ml etanol 100 ml destilovaná voda Roztok III. 33 ml bismarckova hněď (1%) 66,7 ml destilovaná voda Alternativně lze použít 0,33% vodný roztok chrysoidinu Y. Imerzní olej (1,25 index lomu světla). 5
Postup zkoušky: Na povrch odmaštěného podložního mikroskopického skla se přenese bakteriální suspenze bakterií (pipetou či kličkou, záleží na typu matrice, ze které se identifikace provádí). Pokud to práce dovoluje, je lepší nechat preparát zaschnout na vzduchu, anebo v termostatu. Doporučením je provést i tzv. roztěr suspenze (vzorku) po povrchu podložního skla např. s pomocí krycího sklíčka. Krycí sklíčko se postaví na podložní sklo téměř kolmo ke kapce vzorku a pomalým pohybem po povrchu podložního skla se rozetře do tenké vrstvy, která se nechá pozvolna zaschnout anebo se fixuje v plameni. Fixovaný preparát se převrství na dobu 30 sekund směsí roztoku I. a II. (např. 2 ml roztoku I. a 1 ml roztoku II.). Po opláchnutí destilovanou vodou se dobarví roztokem III. během 1 minuty. Opláchne se vodou, opatrně se vysuší a následuje mikroskopická analýza. Mikroskopování probíhá při 100 zvětšení objektivu, tento objektiv je imerzní. Na vybrané místo v preparátu, které se bude pozorovat, se kápne imerzní olej (viz obr. 2). Vyhodnocení: Neisser-negativní (N - ) buňky/vlákna mají světle hnědou až žlutavou barvu. Neisser-pozitivní (N + ) buňky/vlákna jsou tmavě šedomodrá až fialová. Obr. 2. Vzorek aktivovaného kalu po obarvení Neisserovo metodou. Detekce přítomnosti N + a N - bakterií. Foceno při použití imerzního 100 objektivu. 6
Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 7