Průtoková cytometrie Flow Cytometry

Podobné dokumenty
Jana Nechvátalová Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně

Principy a instrumentace

Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice

Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

Specifická imunitní odpověd. Veřejné zdravotnictví

laboratorní technologie

METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY. Veřejné zdravotnictví

Změny v parametrech imunity v průběhu specifické alergenové imunoterapie. Vlas T., Vachová M., Panzner P.,

Funkční testy: BasoFlowEx Kit FagoFlowEx Kit

Obsah. Seznam zkratek Předmluva k 5. vydání... 21

Interpretace výsledků měření základních lymfocytárních subpopulací očima (průtokového J ) cytometristy a klinického imunologa

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

Progrese HIV infekce z pohledu laboratorní imunologie

Marcela Vlková Jana Nechvátalová. FN u sv. Anny v Brně LF MU Brno

Obsah. Seznam zkratek Předmluva k 6. vydání... 23

ÚVOD DO TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE

Helena Langhansová. 30. listopadu 2011

SKANÁ imunita. VROZENÁ imunita. kladní znalosti z biochemie, stavby membrán n a fyziologie krve. Prezentace navazuje na základnz

Nastavení metod pro imunofenotypizaci krevních. EXBIO Praha, a.s.

Imunitní systém.

2) Vztah mezi člověkem a bakteriemi

Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii

Nespecifické složky buněčné imunity. M.Průcha

OBRANNÝ IMUNITNÍ SYSTÉM

Průtoková cytometrie

VZTAH DÁRCE A PŘÍJEMCE

IMUNOGENETIKA I. Imunologie. nauka o obraných schopnostech organismu. imunitní systém heterogenní populace buněk lymfatické tkáně lymfatické orgány

Imunopatologie. Viz také video: 15-Imunopatologie.mov. -nepřiměřené imunitní reakce. - na cizorodé netoxické antigeny (alergie)

Jan Krejsek. Funkčně polarizované T lymfocyty regulují obranný i poškozující zánět

Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách

Atestační otázky z oboru alergologie a klinická imunologie

Intracelulární detekce Foxp3

Metody vyšetření imunity

Funkce imunitního systému

Podrobný seznam vyšetření - imunologie

Využití mnohobarevné průtokové cytometrie pro vyšetření lymfocytárních subpopulací Jana Nechvátalová

Imunitní odpověd - morfologie a funkce, nespecifická odpověd, zánět. Veřejné zdravotnictví

Imunitní systém člověka. Historie oboru Terminologie Členění IS

Vyšetření imunoglobulinů

PREZENTACE ANTIGENU A REGULACE NA ÚROVNI Th (A DALŠÍCH) LYMFOCYTŮ PREZENTACE ANTIGENU

Protinádorová imunita. Jiří Jelínek

T lymfocyty. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

Variabilita takto vytvořených molekul se odhaduje na , což je více než skutečný počet sloučenin v přírodě GENETICKÝ ZÁKLAD TĚŽKÉHO ŘETĚZCE

Fluorescenční mikroskopie

F l u o r e s c e n c e

nejsou vytvářeny podle genetické přeskupováním genových segmentů Variabilita takto vytvořených což je více než skutečný počet sloučenin v přírodě

Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE

Imunopatologie. Luděk Bláha

Co jsou imunodeficience? Imunodeficience jsou stavy charakterizované zvýšenou náchylností k infekcím

Fluorescence (luminiscence)

VK obecně o akreditaci, důležité kapitoly normy ISO MV obecně o validaci a verifikaci Marcela Vlková ÚKIA, FN u sv.

Metody vyšetření imunity

Mechanismy a působení alergenové imunoterapie

SEZNAM LABORATORNÍCH VYŠETŘENÍ

Interpretace sérologických nálezů v diagnostice herpetických virů. K.Roubalová

MUDr Zdeněk Pospíšil

Přístroje v hematologické laboratoři

Vybrané imunologické metody

Krevní skupiny a jejich genetika. KBI / GENE Mgr. Zbyněk Houdek

KAZUISTIKY V BUNĚČNÉ IMUNOLOGII. UŽIVATELSKÉ SETKÁNÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE BECKMAN COULTER Ing. Pavla Plačková

Subpopulace B lymfocytů v klinické imunologii

Ivana FELLNEROVÁ Katedra zoologie PřF UP v Olomouci

RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie, PřF UP Olomouc

Podrobný seznam vyšetření - imunologie

III/2- Inovace a zkvalitnění výuky prostřednictvím IVT

Mimodřeňová expanze plazmocytů do CNS u mnohočetného myelomu

rní tekutinu (ECF), tj. cca 1/3 celkového množstv

IMUNOLOGIE: VELKÝ OBOR OD MOLEKUL K PACIENTŮM CCA 20 NOBELOVÝCH CEN

Fluorescenční mikroskopie

Luminiscence. Luminiscence. Fluorescence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) chemicky (chemiluminiscence)

Analýza buněčných populací pomocí průtokové cytometrie

15 hodin praktických cvičení

laboratoři i s podobnými záhadami?

Antigeny. Hlavní histokompatibilitní komplex a prezentace antigenu

Nanostruktury a zobrazovací metody v medicíně

Příspěvek k hodnocení prognostického potenciálu indexu proliferace a apoptózy plazmatických buněk u mnohočetného myelomu

RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie PřF UP Olomouc

T lymfocyty. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

Pavlína Tinavská Laboratoř imunologie, Nemocnice České Budějovice

Vícebarevná průtoková cytometrie v klinice

Metody testování humorální imunity

Luminiscence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) fluorescence, fosforescence. chemicky (chemiluminiscence)

IMUNITNÍ SYSTÉM OBRATLOVCŮ - MATKA PLOD / MLÁDĚ VÝVOJ IMUNITNÍHO SYSTÉMU OBRATLOVCŮ CHARAKTERISTUIKA IMUNITNÍHO SYSTÉMU OBRATLOVCU

Okruhy otázek k atestační zkoušce specializačního vzdělávání v oboru Alergologie a klinická imunologie

Abnormality bílých krvinek. MUDr.Kissová Jarmila Oddělení klinické hematologie FN Brno

OBMI OKBHI Laboratorní příručka OKBHI Příloha č. 3 Podrobný seznam vyšetření - IMUNOLOGIE

Souvislost výživy s obranyschopností organismu. Lenka Konečná

Jak analyzovat monoklonální gamapatie

Příloha č.4 Seznam imunologických vyšetření

Praktický kurz Praktický kurz monitorování apoptózy a autofágie u nádorových prostatických buněk pomocí průtokové cytometrie

Jaké máme leukémie? Akutní myeloidní leukémie (AML) Akutní lymfoblastická leukémie (ALL) Chronické leukémie, myelodysplastický syndrom,

Příloha č.4 Seznam imunologických vyšetření. Obsah. Seznam imunologických vyšetření

SPECIFICKÁ A NESPECIFICKÁ IMUNITA

6. T lymfocyty a specifická buněčná imunita

Role BAFF cytokinu v transplantačních reakcích. Mgr. Zuzana Sekerková RNDr. Alena Sekerková

Tematické okruhy k SZZ v bakalářském studijním oboru Zdravotní laborant bakalářského studijního programu B5345 Specializace ve zdravotnictví

imunitní reakcí antigeny protilátky Imunitní reakce specifická vazba mezi antigenem a protilátkou a je podstatou imunitní reakce

Imunologické metody fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test

Teorie protinádorového dohledu Hlavní funkcí imunitního systému je boj proti infekcím

Transkript:

Průtoková cytometrie Flow Cytometry

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE (fluorescenční metoda) Měření fyzikálně-chemických vlastností buněk během jejich průchodu laserovým paprskem Nejčastěji imunofenotypizace krevních leukocytů a buněk kostní dřeně (povrchové znaky i intracelulární) Standardní metoda analýzy částic (většinou buněk) v suspenzi Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda, umožňuje současné měření několika parametrů na velkém množství částic

Cluster Designation (Cluster of Differentiation) buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické molekuly znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky a její aktivace CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen číslem (CD1, CD2, CD3, ). V současné době je na lidských leukocytech charakterizováno asi 400 znaků. Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul. Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce. Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech, trombocytech či jiných buněčných populacích. CD8 CD4 TCR

Znak: buněčná populace: CD3 CD4, CD8 CD19, CD20, CD21 CD16/CD56 CD14/HLA-DR T-lymfocyty B-lymfocyty NK buňky Monocyty HLA-DR; CD25; CD69 Aktivační znaky

T-lymfocyt B-lymfocyt CD19 Ig Ig http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/generalbiology/immunology/recognition/tcell/tcellcomplex/tcellcomplex.htm

Průtokový cytometr 1.FLUIDNÍ SYSTÉM 2.OPTIKA 3.ELEKTRONIKA http://www.abdserotec.com/resources/flow-cytometry-ebook/principles-of-the-flow-cytometer/signal-processing.html

1. FLUIDNÍ SYSTÉM Zajišťuje transport bb. v nosné tekutině (pod tlakem) do průtokové komory. Buňky se pohybují jedna za druhou na základě hydrodynamické fokusace - nosná tekutina (destil. voda, komerční tekutiny) bývá do komory přinášena tenkou Kapilárou pod větším tlakem než suspenze částic, které jsou tak udržovány jen v úzké centrální části proudu. Zrychlení vznikající při výstupu vodního paprsku z komůrky nutí částice pohybovat se jedna za druhou. http://withfriendship.com/user/mithunss/flow-cytometry.php

Velikost buněk: Forward Scatter Přímý rozptyl - úměrný velikosti buňky 15µm

Granularita buněk: Side Scatter Boční rozptyl indikátorem vnitřní buněčné struktury (granularity)

2. OPTIKA Excitační část laser Sběrná část systém čoček, zrcadel a optických filtrů zachycující fluorescenci částic vyzářenou po jejich projití světelným paprskem http://www.semrock.com/flow-cytometry.aspx

3. ELEKTRONIKA Převádí optické signály (fluorescenci) na signály elektronické (fotonásobiče, fotodiody). Po zesílení signálu a dalším zpracování dojde k jeho digitalizaci pro počítačovou analýzu http://healthcare.analog.com/static/imported-files/microsites/healthcare/pop_blood_analysis_fc.html

Průtokový cytometr Speciální počítačové programy umožňují zobrazit a vyhodnotit výsledky analýzy každá vyšetřená buňka má přiřazené hodnoty parametrů (0 max) a buňky jsou vyhodnocovány kolektivně, tedy jako populace (Opto)elektronika převádí optický signál na elektrický, ten zpracovává a údaje jsou posílány do počítače Sběrná optika (čočky, zrcadla, filtry, světlovodná vlákna) třídí světelný signál Podle barvy se světlo a přivádí ho na jednotlivé detektory Laser Excitační optika (lasery, světlovodná vlákna, zaostřovací a tvarovací prvky) přivádí budící záření do komory Systém hnací tekutiny přináší vzorek do komory kde jsou buňky jedna po druhé vyšetřovány laserovým paprskem Zkumavka se suspenzí buněk

velikost granulocyty lymfocyty monocyty granularita

POLYKLONÁLNÍ PROTILÁTKY protilátky vznikající při přirozené odpovědi imunity na antigen jsou polyklonální. jsou zaměřené proti různým epitopům antigenu a tvořeny mnoha klony B lymfocytů - na rozdíl od monoklonálních nejsou zcela totožné MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY protilátky jsou produktem jediného klonu B lymfocytů (klony vzniklé fúzí buněk produkujících protilátky a myelomových buněk, jež schopnost produkce svého vlastního imunoglobulinu ztratily) jsou naprosto totožné a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu http://www.accessexcellence.org/rc/vl/gg/monoclonal.php

Fluorochromy: - Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty FITC, Cyaniny, Texas Red, řada Alexa, řada Pacific and Cascade, AmCyan, Propidium iodide, 7-AAD, CFSE, - Fluorescenční proteiny Fluorescence Phycoerythrins (B, R), Allophycocyanin, PerCP, GFP a jiné fluorescenční proteiny Schopné absorbovat fotony budícího záření (např. 488 nm) a následně (10-8 s) emitovat fotony s delší vlnovou délkou (v tomto případě 500 800 nm). Fluorescenční světlo má tedy jinou barvu

Fluorescence Barva pohlceného a vyzářeného světla se liší Stokesův posuv - rozdíl mezi vlnovými délkami emisního a excitačního maxima (nm) Energie (E) Absorbční spektrum Emisní spektrum Vlnová délka (λ) Část energie se přemění na energii vibrační Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii E = h.c/

CD3 CD4

CD4-RD1 CD3 - CD4 + CD3 + CD4 + CD3 - CD4 - CD3 + CD4 - CD3-PC5

Krevní diferenciál Eo - eozinofily Mono monocyty GADJ - lymfocyty CD45 = znak pro leukocyty

Vyšetření lymfocytů periferní krve ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 58-85 30-60 15-35 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 6-20 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech)

Hodnocení nálezu jednotlivých subpopulací Snížení/ zvýšení subpopulace CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ CD19+ CD19+ CD3+ CD3+ CD4+ CD4+ CD8+ CD8+ onemocnění při imunosupresi např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii) u některých pacientů s CVID B buněčná leukémie při expozici člověka toxickými chemikáliemi T buněčná leukémie u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV) autoimunity, alergie autoimunity (roztroušená skleróza, systematický lupus erythematodes-sle) u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV)

Vyšetření: Příklady klinických a experimentálních aplikací průtokové cytometrie Povrchových antigenů Intracelulárních antigenů Buněčná DNA Protilátky Funkcí imunofenotypizace, HLA-B27, receptory pro cytokiny myeloperoxidáza kinetika buněčného cyklu, hodnocení apoptózy nekrózy. stanovení hladin terapeutických protilátek test blastické transformace lymfocytů, fagocytóza a oxidační vzplanutí, NK-cytotoxicita Aktivita enzymů, vnitřní prostředí buněk.

HLA-B27 asociace HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění, jako jsou záněty kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkých kostí rukou, nohou a šlach, dále lupénka (psoriasis), vyrážek, chronické bolesti spodní části zad a spondyloarthropatie, z nichž nejznámější je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění osového skeletu a kloubů - Bechtěrevova nemoc). negativní pozitivní

Test aktivace bazofilů (bazotest) funkční test umožňující vyšetření aktivace basofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE) - CD203c založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění. Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je zprostředkovaná protilátkami IgE. IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace. Při dálším setkání s alergenem alergen přemostí IgE, to vede k aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c na aktivovaných bazofilech. ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní) - sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů negativní pozitivní Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno