Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Název bakalářské práce Hodnocení výtěžnosti bioetanolu při uplatnění různých postupů přípravy a zcukřování obilných rmutů Vedoucí bakalářské práce: Dr. Ing. Luděk Hřivna Brno 2008 Vypracoval: Pavel Šťastný 1
2
3
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Hodnocení výtěžnosti bioetanolu při uplatnění různých postupů přípravy a zcukřování obilných rmutů, vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně dne 12.5. 2008 Podpis diplomanta 4
PODĚKOVÁNÍ Mé poděkování patří především mému vedoucímu bakalářské práce Dr. Ing. Luďku Hřivnovi za pomoc při tvorbě mé práce. Dále chci poděkovat Dr. Ing. Tomášovi Gregorovi za pomoc v laboratoři, a také mým rodičům, bez nichž by tato práce nemohla vzniknout. 5
Abstrakt Tato práce se zabývá problematikou výroby bioetanolu. Je zde vypracováno využití různých surovin pro danou výrobu a jsou zde popsány různé technologie výroby. V praktické části se tato práce zabývá posouzením průběhu ztekucování a zcukřováním zápary pomocí kombinace třech specifických enzymů: Optimash XL, spezyme ethyl a fermenzyme ethyl s následným vyhodnocením výtěžnosti. V pokusech bylo dokázáno, že tyto enzymy jsou vhodné pro přípravu sladkých zápar. Výtěžnost bioetanolu byla 32,9 la/100 kg sušiny, což je průměrný výsledek. Abstract: This thesis deals with bioethanol production. It provides an analysis of various raw materials utilized for bioethanol production, as well as a description of a number of the production technologies. The second and practical, part of the thesis is concerned primarily with one main issue. The issue studied evaluates the utilizing a combination of three specific enzymes: Optimash XL, spezyme ethyl a fermenzyme ethyl. The experimentes have proved, that the enzymes are suitable for preparation of sweet solutions. The bioethanol extraction was 32,9 la/100 kg of dry mass, what is average issue. Klíčová slova: bioetanol suroviny obiloviny enzymy kvašení Keys words bioethanol raw materials cereals enyzmes fermentation 6
Seznam tabulek, obrázků a grafů Tab. 1 Obsah monosacharidů a dalších cukrů v ovoci Tab. 2 Složení bramborové hlízy Tab. 3 Průměrné výnosy plodin a náklady na produkci lihu z jednotlivých plodin Tab. 4 Technologické znaky pro pšenici a tritikale Tab. 5 Obsah škrobu ve významných obilninách pro výrobu bioetanolu Tab. 6 Teploty mazovatění (želatinace) Tab. 7 Závislost barevné reakce roztoku jodu na délce amylosového řetězce Tab. 8 Bílkoviny obilovin a jejich složení Tab. 9 Působení enzymů používaných pro zcukřování škrobu Tab. 10 Složení výpalků Tab. 11 Dávkování enzymů a optimální podmínky ztekucování a zcukřování škrobu Tab. 12 Mechanické vlastnosti a chemické složení zrna pšenice Eurofit Tab. 13 Absolutní hodnoty obsahu sacharidů v průběhu přípravy zápary Obr. 1 Působení α-amylázy Obr. 2 Působení β- amylázy Obr. 3 Působení glukoamylázy Obr. 4 Embdenovo-Meyerhofovo schéma etanolové glykolýzy Obr. 5 Kvašení glukózy v alkalickém prostředí (Neubergovo schéma) Obr. 6 Buňka kvasinek Obr. 7 Kvasné křivky kvašení zápar Graf č. 1 Odbourávání oligosacharidů Graf č. 2 Odbourávání maltotriózy Graf č. 3 Odbourávání maltózy Graf č. 4 Odbourávání glukózy 7
OBSAH 1.0 ÚVOD 11 2.0 LITERÁRNÍ PŘEHLED 12 2.1 Bioetanol a jeho produkce v ČR 12 2.2 Suroviny využitelné pro výrobu bioetanolu 12 2.2.1 Suroviny cukernaté 12 2.2.1.1 Ovoce 13 2.2.1.2 Cukrovka 13 2.2.1.3 Cukrová třtina 13 2.2.1.4 Melasa 14 2.2.1.5 Dextroner 14 2.2.1.6 Surový cukr 14 2.2.2 Škrobnaté suroviny 15 2.2.2.1 Brambory 15 2.2.2.2 Pšenice 16 2.2.2.3 Žito 16 2.2.2.4 Oves 16 2.2.2.5 Ječmen 16 2.2.2.6 Kukuřice 17 2.2.2.7 Tritikale 17 2.2.3 Lignocelulózové suroviny 17 2.3 Obiloviny jako surovina pro výrobu bioetanolu 18 2.3.1 Morfologická skladba zrna 19 2.3.1.1 Endosperm 19 2.3.1.2 Obalové vrstvy 19 2.3.1.3 Klíček 20 2.3.2 Chemické složení zrna 20 2.3.2.1 Voda 20 2.3.2.2 Sacharidy 20 2.3.2.3 Bílkoviny 22 8
2.3.2.4 Tuky 23 2.3.2.5 Minerální látky 23 2.3.2.6 Vitaminy 23 2.4 Výroba obilných zápar 23 2.4.1 Enzymy používané k zcukření polysacharidů obilného zrna 24 2.5 Prokvášení zápar 27 2.5.1 Mechanismus etanolového kvašení 27 2.5.2 Kvasinky v kvasném průmyslu 29 2.5.2.1 Morfologie a cytologie kvasinek 29 2.5.2.2 Chemické složení kvasinek 30 2.5.2.3 Výživa kvasinek 31 2.5.2.4 Činitelé ovlivňující činnost kvasinek 31 2.6 Průmyslová výroba lihu z obilovin 32 2.6.1 Příprava sladké zápary 32 2.6.2 Zakvašování a kvašení sladké zápary 32 2.6.3 Destilace zralé zápary 33 2.7 Produkty lihovarského průmyslu 34 2.8 Laboratorní kvasná zkouška 34 3.0 CÍL PRÁCE 35 4.0 MATERIÁL A METODIKA 36 4.1 Materiál 36 4.1.1 Charakteristika použité odrůdy pšenice 36 4.1.2 Charakterizace použitých enzymů 36 4.1.3 Kvasinky 37 4.2 Metodika 37 4.2.1 Rozbor zrna 37 4.2.2 Příprava zápary 38 4.2.3 Kvasná zkouška 39 4.3 Vyhodnocení výsledků 39 9
5.0 VÝSLEDKY A DISKUSE 40 5.1 Vyhodnocení kvality použité suroviny 40 5.2 Vyhodnocení průběhu zcukřování zápar 41 5.3 Vyhodnocení výtěžnosti 46 6.0 ZÁVĚR 47 7.0 LITERATURA 48 10
1.0 ÚVOD Výrobu lihových nápojů (víno, pivo) znali již staří Egypťané, od nichž se rozšířila do celého světa. Nicméně se nevědělo až do konce 17. století, z jakých látek etanol vzniká a jak probíhá jeho tvorba. Až koncem 17. století zjistil Becher, že alkoholické kvašení probíhá pouze ve sladkých tekutinách. Objasnit tvorbu alkoholu se podařilo až počátkem 19. století Gay Lussakovi. U nás se etanol začal ve větším množství produkovat začátkem 19. století a to z brambor, později s rozvojem cukrovarnictví také z melasy, která měla vliv na vznik průmyslového lihovarnictví. Nejvyšší rozmach průmyslové výroby lihu v tehdejším Československu byl ve třicátých letech, kdy bylo zavedeno povinné mísení lihu s pohonnými hmotami. V posledním desetiletí naší doby dochází nejen u nás, ale i ve světě k rozvoji lihovarnického průmyslů a to z důvodu výroby bioetanolu, který má postupem času nahradit vyčerpatelná fosilní paliva. Další výhodou výroby bioetanolu je možnost zpracovávat havarované ovoce, námelové žito, namrzlé brambory, plesnivé obilí apod.. Nevýhodou zůstává fakt, že bioetanol lze snadno převést na potravinářský líh, a tak ho nezákonodárně lépe zpeněžit. V Evropě patří k nejvyšším producentům bioetanolu Francie, Polsko a Nizozemí. Nutno však poznamenat, že zemědělské plochy zatím nejsou pro výrobu bioetanolu v Evropě nijak vysoké, např. v roce 2005 země EU využili z celkové zemědělské plochy 25 milionů ha pouze 1,8 milionu ha této půdy. Z mimoevropských států je jedním z nejvyšších producentů Brazílie, kde se bioetanol vyrábí z cukrové třtiny a USA, kde se vyrábí bioetanol z kukuřice. Česká republika zatím ve výrobě biopaliv zaostává, přičemž nejvhodnějšími plodinami pro výrobu bioetanolu v našich podmínkách přichází pšenice, tritikale a nově také kukuřice. Tato práce se zabývá problematikou hodnocení výtěžnosti bioetanolu. Významnou roli totiž při získávání bioetanolu nehraje pouze surovina, ale také zvolené technologické postupy přípravy rmutu a právě touto problematikou se zabývá tato práce. 11
2.0 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Bioetanol a jeho produkce v ČR Bioetanol je kvasný líh, který se využívá jako přídavek k benzínu a dále jej lze využívat také k farmaceutickým nebo chemickým účelům (www.biom.cz). V dnešní době se u nás začíná bioetanol vyrábět z podnětu Evropské unie. Tento podnět vychází ze směrnice č.2003/30/es o mísení benzínu s bioetanolem, kdy má v ČR dosáhnout podíl bioetanolu v benzínu 2 % v roce 2005 (skutečnost byla 1,4 %), 4,25 % v roce 2008 a 5,75 % v roce 2010 (Jevič, 2006). U nás přichází v úvahu vyrábět bioetanol zejména ze pšenice, tritikale, kukuřice, brambor, cukrovky a havarovaného ovoce (Pelikán, 1996). Výhodou bioteanolu je oproti benzínu hořlavost při nižší teplotě a také to, že při hoření uvolňuje méně CO. Jeho nevýhodou je naopak, že má nižší výhřevnost a tím zvyšuje spotřebu. Další nevýhodou je prozatím jeho vysoká cena, a také to, že bioetanol lze snadno upravit na potravinářský líh (Kára, 2001). 2.2 Suroviny využitelné pro výrobu bioetanolu K výrobě lihu lze použít suroviny, obsahující přímo zkvasitelné cukry nebo polysacharidy, které lze převést enzymatickou hydrolýzou na zkvasitelné cukry. Tyto suroviny se dají rozdělit na cukernaté, škrobnaté a lignocelulózové (Tab.3) (Pelikán, 2001). 2.2.1 Suroviny cukernaté Jedná se o suroviny, které obsahují přímo zkvasitelný cukr tj. zejména glukóza a fruktóza. 12
2.2.1.1 Ovoce Ovoce se zpracovává na etanol pouze v letech nadúrody, při poškození sklizně škůdci nebo předčasném opadu. Jinak se ovoce zpracovává na výrobu ovocných pálenek (slivovice, meruňkovice atd.), a tedy s ním nelze pro výrobu bioetanolu běžně počítat (Hamrová, 1988). Ovoce obsahuje zejména glukózu, fruktózu a sacharózu, kdy poměr těchto jednotlivých cukrů závisí zejména na druhu ovoce, a dále také na způsobu pěstování, klimatu a stupni zralosti viz. Tab.1 (Pelikán, 2001). Tab. 1 Obsah monosacharidů a dalších cukrů v ovoci ( Velíšek, 2001) Ovoce Glukóza Fruktóza Sacharóza cukry celkem jablka 1,8 5,0 2,4 11,1 hrušky 2,2 6,0 1,1 9,8 meruňky 1,9 0,4 4,4 6,1 švestky 3,5 1,3 1,5 7,8 2.2.1.2 Cukrovka Cukrovka obsahuje 17,5 % sacharózy. Tuto sacharózu lze využít pro výrobu bioetanolu buď ze zahuštěné šťávy, což by ale zdražilo výsledný produkt přibližně třikrát. Z tohoto důvodu se využívá k výrobě bioetanolu difúzní šťáva, čímž nám odpadá odpařování, a tedy výsledný produkt se nám třikrát nezdraží. Tento druhý postup nám umožňuje počítat s cukrovkou pro výrobu bioetanolu. 2.2.1.3 Cukrová třtina V dnešní době činí základ pro výrobu bioetanolu v Brazílii. Zisk z jednoho hektaru představuje přibližně 5300 6500 hl/ha (Petr, 2007). Její velkou výhodou je, že obsahuje přímo zkvasitelnou sacharózu a lze ji pěstovat po jednom výsevu po dobu 5 let. Nevýhodou je, že se jedná o teplomilnou plodinu, a tedy ji nelze v našich podmíkách při výrobě bioetanolu uplatnit. 13
Bioetanol vyrobený z této suroviny je ve srovnání s bioetanolem vyrobeným ze zemí mírného pásma podstatně levnější. 2.2.1.4 Melasa Melasa vzniká při výrobě řepného nebo třtinového cukru jako matečný sirob (Hamrová, 1988). Je to viskózní, tmavohnědá kapalina, která je pro další výrobu cukru neekonomická. Obsahuje nejméně 46 % sacharózy, 0,2 1 % rafinózy, invertní cukr 0,1 0,25 % a 30 % necukrů, které jsou tvořeny anorganickými látkami (10 %), nejvíce jev nich zastoupen draslík, v menší míře vápník, sodík a jiné minerální látky a látkami organickými (20 %), tj. kyselina asparagová, glutamová, betain a organické kyseliny a jejich soli. Melasa poskytuje velice dobré médium pro kvasinky při výrobě lihu, a proto se nejvíce využívá v průmyslových lihovarech (Pelikán, 2001). Její využití na biopalivo je ale nereálné z důvodu stále klesající produkce cukru v ČR. 2.2.1.5 Dextroner Dextroner je matečný louh po krystalizaci glukózy, vyrobené kyselou nebo enzymovou hydrolýzou škrobu. Využívá se na výrobu lihu pouze v kombinaci s obilím nebo bramborami (Hamrová, 1988). Obsahuje 60 % sušiny, její ph má být 3 3,5 a z cukrů obsahuje převážně glukózu, proto je velmi snadno zkvasitelná (Pelikán, 2001). 2.2.1.6 Surový cukr Jedná se o dražší produkt, lze jej tedy využívat pouze při nadbytku a to ve zpracování s ostatními surovinami. Pokud je nezbytné ho zpracovat samostatně, přidává se do zápary sladové mléko (Pelikán, 2001). 14
2.2.2 Škrobnaté suroviny U těchto surovin je vždy nutné nejprve přeměnit pomocí enzymových preparátů nezkvasitelný škrob, popř. i celulózu na zkvasitelné cukry, které posléze mikroorganismy fermentují na etanol. 2.2.2.1 Brambory Dříve byly u nás nejvyužívanější surovinou, ale dnes pro problémy s odpadní vodou a malou výtěžností vzhledem k obilí, se s nimi pro výrobu bioetanolu nepočítá (Petr, 2006). Jejich výhodou ovšem je, že lze zpracovat i brambory havarované nebo vytříděné při posklizňové úpravě konzumních brambor. Jejich škrobnatost nesmí být nižší než 16 % (Pelikán, 2001). Průměrně brambory obsahují 25 % sušiny a z toho připadá 2 % dusíkatých látek, 0,7 % vlákniny, 0,2 % tuku, 18 % škrobu a 1 % popelovin (Tab.2). Obsah se liší v závislosti na klimatu, odrůdě a technice pěstování (Adler, 1971). Tab. 2 Složení bramborové hlízy ( Adler, 1971) rozpětí % Voda 63,2 86,9 Sušina 13,1 36,8 Škrob 8,0 29,4 N látky 0,7 4,6 Cukry celkem 0,1 8,0 Vláknina 0,2 3,5 Tuk 0,04 0,96 Minerální látky 0,4 1,9 15
2.2.2.2 Pšenice Pšenice je velmi výhodná pro zpracování na bioetanol pro vysoký obsah škrobu a nahé obilky. Pšenice obsahuje v průměru 65 70 % škrobu v závislosti na odrůdě. Teoretická výtěžnost bioetanolu se pohybuje pro pšenici okolo 38 44 la na 100 kg sušiny zrna (Aufhamer, 1994), ale v praxi se dosahuje okolo 34 39 la na 100 kg sušiny zrna. Výhodnější pro zpracování jsou moučnatá zrna než sklovitá, protože dochází k uvolnění škrobových zrn z bílkovinné matrice (Lindhauer a Zwingelberg, 1997). 2.2.2.3 Žito Žito obsahuje průměrně okolo 58 60 % škrobu. Jeho výhodou je, že má nahé obilky, obsahuje málo vlákniny a je také ceněno pro nízký obsah bílkovin. Nevýhodou je velká viskozita připravené zápary pro vysoký obsah pentosanů. V současné době se s ním pro výrobu bioetanolu nepočítá, protože rentabilita výroby je při minimálním obsahu 65 % škrobu v obilce. 2.2.2.4 Oves Oves se pro výrobu lihu využívá jen ojediněle, protože obsahuje vysoký podíl pluch (23 45 % hmotnosti zrna) (Hamrová, 1988). Obsah škrobu je také nízký a to pouze 40 %. Výhodou ovsa je, že obsahuje hodně tuku, a tedy zabraňuje pěnění zápar bez přidání jiných látek (Dyr, 1956). 2.2.2.5 Ječmen Ječmen se na výrobu bioetanolu nehodí, protože má pluchaté obilky. Pluchy tvoří na zápaře tlustou vrstvu tzv. deku, čím dochází k prodloužení destilace a také ke kontaminaci nežádoucími mikroorganismy. 16
2.2.2.6 Kukuřice Nejvíce je využívána pro tvorbu bioetanolu v USA, kde výroba představovala 42 milionů litrů bioetanolu v roce 2006. U nás se v dnešní době začíná o této plodině pro výrobu etanolu vážně uvažovat. Její hlavní výhodou je vysoký obsah škrobu v zrnu (až 75 %), který je tvořen glukózovými jednotkami s pravidelnými vazbami, což umožňuje snadné zcukření pomocí enzymových preparátů. Dále kukuřice obsahuje vyšší podíl tuku, což stejně jako u ovsa zabraňuje pěnění zápary bez přidání jiných látek. Její nevýhodou je ale vysoká náročnost vláhy, hnojiv a pesticidů ( Petr, 2007). 2.2.2.7 Tritikale Jedná se o křížence pšenice a žita. Obsah škrobu je okolo 64 68 %. Na rozdíl od svých rodičů, má vyšší aktivitu amylotických enzymů, čímž dochází k rychlejšímu získávání vysoce extraktivních zápar (Wesenber, 1990). Velkou výhodou tritikale je, že není náročné na pěstování, a lze jej tedy využít i pro pěstování v horských oblastech (Petr, 2006). 2.2.3 Lignocelulózové suroviny V dnešní době se dostávají lignocelulózové suroviny do popředí zájmu, čemuž napomohla výroba obchodních celulázových preparátů, které hydrolyzují celulózu až na glukózu. Tyto enzymové preparáty jsou vyrobeny z geneticky modifikovaných hub, které umí velmi rychle a efektivně štěpit celulózu (Petr, 2007). Mimo těchto enzymů lze využít i enzymy z bakterie rodu Zymomonas a Escherichia Coli jak uvádí Zaldivar (2001). Jako suroviny lze uplatnit zejména slámu ze zemědělství a zbytky dřevozpracujících závodů (piliny, štěpky). 17
Tab. 3 Průměrné výnosy plodin a náklady na produkci lihu z jednotlivých plodin ( Petr, 2004) Plodina Náklady Výnos Náklady Náklady Výnos Výnos lihu [na 1 t škrobu na 1ha [na 1 t lihu [t/ha] [t/ha] škrobu tis. [t/ha] [tis. Kč] tis. Kč] Kč] Pšenice 4,8 2,8 1,3 17,7 6,3 11,1 Tritikale 4,1 2,4 1,1 15,9 6,6 11,4 Kukuřice 6,6 3,5 1,4 26,4 7,6 14,7 Brambory 23,0 4,6 2,2 44 9,6 15,7 Cukrovka 45,0 7,7 3,6 40,5 5,3 8,8 2.3 Obiloviny jako surovina pro výrobu bioetanolu V současné době obiloviny představují v našich podmínkách hlavní surovinu pro výrobu bioetanolu. Na to, která obilovina je nejvýhodnější pro výrobu bioetanolu, má hlavní vliv morfologické složení obilky a zejména její chemické složení. Tyto rozdíly jsou dány zejména druhem obiloviny, odrůdou dané obiloviny, v menší míře poté vlivem výživy, počasí a podnebí. Pro toto posouzení se využívají ukazatele lihovarnické kvality: Vlhkost stanovuje se vážkově Hmotnost tisíc zrn stanovuje se odpočítáním 2 x 500 zrn Objemová hmotnost pomocí obilného měřiče Podíl plných zrn pomocí prosévadel např. Steineckerovo prosévadlo N látky podle Kjehdala Obsah škrobu stanovuje se polarimetricky Pádové číslo stanovuje se v automatické viskolázni Průběh mazovatění škrobu pomocí amylografu 18
Pro každou surovinu jsou hodnoty jiné, jako příklad můžeme uvést hodnoty pro pšenici a tritikale (Tab.4): Tab. 4 Technologické znaky pro pšenici a tritikale ( Diviš, Šimůnek, Voleský 2004) Kritéria Pšenice Tritikale Vlhkost % max. 14 14 obj. hmotnost kg/hl min. 73 68 příměsi v % max. 12 12 nečistoty v % max. 3 3 číslo poklesu v s 150 300 150 300 obsah škrobu v % min. 58 60 2.3.1 Morfologická skladba zrna Každá obilka se skládá z endospermu, klíčku a obalových vrstev. Hmotnostní podíl jednotlivých částí zrna je rozdílný u jednotlivých obilovin (Pelikán, 2001). 2.3.1.1 Endosperm Zaujímá 84 86 % hmotnosti zrna a obsahuje zejména škrob, tedy tato část je pro výrobu bioetanolu velice důležitá. Dále také obsahuje bílkoviny, které jsou důležité pro pekařské využití (Kučerová, 2004). 2.3.1.2 Obalové vrstvy Od endospermu jsou odděleny vrstvou aleuronových buněk, obsahujících bílkoviny, minerální látky, tuky a vitaminy. Obalové vrstvy tvoří 8 14 % hmotnosti zrna a mají dvě hlavní části oplodí a osemení. Oplodí (perikarp) tvoří pokožka (epidermis), buňky podélné (epikarp), buňky příčné (mesokarp) a buňky hadicové (endokarp). Osemení (perisperm, testa) je tvořeno vrstvou barevnou a hyalinní (skelnou). 19
Vrstvy jsou složeny z vlákniny (celulózy a hemicelulózy) a minerálů, tedy jsou důležité z výživového hlediska (Zimolka, 2004). 2.3.1.3 Klíček Jinými slovy embryo, představuje vlastní zárodek nové rostliny. Jeho velikost závisí na druhu obilného zrna a je nejvíce kolísající složkou zrna. Např. u pšenice tvoří 2,5 3,0 % hmotnosti zrna, naopak u kukuřice tvoří 12 15 % hmotnosti zrna. Obsahuje jednoduché cukry, bílkoviny, vitaminy B 1, E a tuk, který je pro zpracování na bioetanol důležitý, protože jeho vysoký obsah snižuje pěnivost zápar. Nejvyšší podíl tuku v klíčku má oves a hlavně kukuřice (Pelikán, 2004). 2.3.2 Chemické složení zrna Obilné zrno obsahuje vodu, sacharidy, dusíkaté látky, tuky, minerální látky a vitaminy. 2.3.2.1 Voda Voda je nezbytnou složkou obilného zrna, protože se podílí na biochemických a fyziologických procesech, které probíhají během růstu, dozrávání a skladování (Pelikán, 2001). Na výrobu bioetanolu nemá zrno obsahovat více jak 14 % vody. 2.3.2.2 Sacharidy V obilce se nacházejí ve formě monosacharidů, oligosacharidů a polysacharidů. Monosacharidy a oligosacharidy jsou zastoupeny glukózou, fruktózou, sacharózou a maltózou. Vyskytují se zejména v klíčku, kde poskytují energii klíčícímu zrnu a dále v periferních vrstvách endospermu (Zimolka, 2004 ). Polysacharidy jsou zastoupeny škrobem, který poskytuje zásobní energii pro rostliny. Každá rostlina má jiný obsah škrobu (Tab. 5). Nejvíce škrobu se nachází v amyloplastech, kde je uložen v nerozpustných micelách nazývaných škrobová zrna nebo také škrobové granule, které mají druhově specifický 20
tvar, což má důležitou vlastnost při mazovatění škrobu. Kruger (1989) uvádí, že škrob je druhý nejrozšířenější sacharid v přírodě. Škrob je složen z amylózy ( 20 25 %), což je lineární polysacharid, barvící se roztokem jodu do modra (Tab.7) a stáčející se do levotočivé šroubovice, v němž jsou zbytky α-d-glukózy spojeny 1 4 glykosidovými vazbami a amylopektinu (75 % 80%), ve kterém se spojují kratší lineární řetězce α-(1 4) glukanu vazbami (1 6), čímž vzniká větvená molekula. Amylóza je ve vodě rozpustná na rozdíl od amylopektinu, který pouze bobtná, a proto lze stanovovat mazovatění škrobu neboli maximální hodnotu želatinace v závislosti na teplotě (Tab.6). Kromě rozpustnosti je při výrobě bioetanolu důležitá vlastnost amylózy barvit se roztokem jodu modře, čímž lze snadno sledovat stupeň zcukření (Zehnálek, 2007). Dále se z polysacharidů vyskytují celulózy a hemicelulózy, a to v buněčných stěnách, kde fungují jako opěrné pletivo (Pelikán, 2001). Tab. 5 Obsah škrobu ve významných obilninách pro výrobu bioetanolu ( Velíšek, 2002) obilnina škrob (%) pšenice 59 72 žito 52 57 ječmen 52 62 oves 40 56 kukuřice 65 75 Tab. 6 Teploty mazovatění ( želatinace) ( Velíšek, 2002) Zdroj škrobu Teplota mazovatění ve C počáteční konečná pšenice 52 64 kukuřice 62 72 21
Tab. 7 Závislost barevné reakce roztoku jodu na délce amylózového řetězce (Kosař, 2000) počet glukózových jednotek barevná reakce s jodem 45 modrá 40 modrofialová 36 fialová 31 červená 12 červenohnědá 9 žádná 2.3.2.3 Bílkoviny Obsah bílkovin v obilném zrnu je 9 16 % a jsou obsaženy hlavně v endospermu a aleuronové vrstvě. V obilovinách se vyskytují tyto bílkoviny: protoplasmatické (albuminy a globuliny) a zásobní (prolaminy a gluteliny) (Tab. 8). Protoplasmatické bílkoviny jsou tvořeny bílkovinami katalytickými, enzymaticky aktivními a bílkovinami stavebními. Zásobní bílkoviny tvoří podstatnou část obilních bílkovin a určují technologickou, nutriční, krmnou a biologickou hodnotu zrna (Pelikán, 2001). Tab.8 Bílkoviny obilovin a jejich složení (Velíšek, 2002) obilovina albuminy (%) globuliny prolaminy gluteliny pšenice 14,7 7,0 32,6 45,7 žito 44,4 10,2 20,9 24,5 ječmen 12,1 8,4 25,0 54,5 oves 20,2 11,9 14,0 53,9 kukuřice 4,0 2,8 47,9 45,3 22
2.3.2.4 Tuky Vyskytují se nejvíce v klíčku a aleuronové vrstvě. Podíl 72 85 % tvoří nepolární tuky a kolem 15 26 % tvoří polární lipidy (Kučerová, 2004). 2.3.2.5 Minerální látky Minerální látky se nacházejí v obilném zrně v rozmezí 1,5 % 3,0 %. Největší množství minerálních látek se nachází v klíčku a obalových vrstvách. Nejvíce jsou zastoupeny K, P, Mg (Pelikán, 2001). 2.3.2.6 Vitaminy Katalyzují četné životně důležité biochemické procesy. Nejvíce vitaminů je v klíčku a v aleuronové vrstvě. Naopak endosperm je na vitaminy velmi chudý. Největší význam mají vitaminy B 1, B 2, kyselina nikotinová a vitamin E, který je v zrnu obsažen v poměrně značném množství, zejména v klíčku. 2.4 Výroba obilných zápar Při přípravě bioetanolu z obilovin je potřeba nejprve převést hydrolýzou nezkvasitelný škrob na zkvasitelné cukry, které jsou poté mikroorganismy fermentovány na etanol. Na průběh hydrolýzy má vliv granulace mletí, protože čím je granulace meliva hrubší, tím dochází k horšímu ztekucování a zcukřování škrobu. Rozklad škrobu lze provádět dvěma způsoby, a to kyselou hydrolýzou nebo enzymovou hydrolýzou, kdy výchozí rovnice je pro oba způsoby stejná: (C 6 H 10 O 5 ) a + n H 2 O n C 6 H 12 O 6 Kyselá hydrolýza se dnes již nevyužívá, protože je obtížněji regulovatelná než hydrolýza enzymová, při které lze navíc využít i enzymy pro zcukření celulózy a tím zvýšit výtěžnost (Velíšek, 2002). 23
Pro vyšší účinek enzymů je důležité mechanické narušení struktury endospermu (Kreipe, 1981). Např. Kent a Evers (1994) uvádí, že při narušení struktury endospermu mletím, dochází k porušení bílkovinné matrice, uvolnění škrobových zrn a tím mohou být lépe zcukřeny pomocí enzymů. Jak již bylo výše naznačeno, dnes se pro výrobu bioetanolu využívá hydrolýza škrobu pomocí enzymů tzv. enzymová hydrolýza. Tato operace se provádí tzv. rmutováním, kdy se k rozemletému zrnu přidá voda a příslušné enzymy. Po procesu zcukření škrobu, popř. jiných polysacharidů, se připravená zápara zakvasí příslušným mikroorganismem. Po 72 h kvašení při teplotě 30 C se vzniklý etanol oddestiluje a zjistí se výtěžnost. 2.4.1 Enzymy používané k zcukření polysacharidů obilného zrna K výrobě bioetanolu lze využít těchto enzymů (Tab.9) viz níže. α - amyláza (EC 3.2.1.1.) α-amyláza hydrolyzuje 1,4-α-D-glukosidové vazby uvnitř polysacharidové molekuly (Obr.1), takže vznikají dextriny o nízké molekulové hmotnosti, oligosacharidy a glukóza. Přičemž barva komplexu s jodem se mění přes fialovou, hnědou až k bezbarvé a zároveň klesá viskozita škrobového mazu. Tento enzym se také nazývá ztekucující nebo také endoamyláza, protože působí uvnitř makromolekuly škrobu (Hamrová, 1988). Komerčně jsou využívány α-amylázy produkované bakteriemi např. Bacillus subtilis nebo plísňové enzymy např.aspergilus niger (Vodrážka, 1996). β - amyláza (EC 3.2.1.2) Stejně jako α-amylázy hydrolyzují 1,4-α-D-glukosidové vazby, ale od neredukujícího konce, takže odštěpují molekuly maltózy (Obr.2). Tento enzym se proto nazývá zcukřujícím enzymem. Na rozdíl od α-amylázy mají β-amylázy charakter exoenzymů. 24
Působení β-amyláz je popsáno v pokusu Maneliuse (1997), který podrobil směs lineárních a větvených dextrinů škrobu působení β-amylázy. Lineární dextriny byly hydrolyzovány až na maltózu, avšak amylopektiny nebyly téměř dotčeny. Glukoamyláza (EC 3.2.1.3) Stejně jako β-amyláza je glukoamyláza exoenzym, hydrolyzují 1,4-α-D-glukosidové vazby od neredukujícího konce, ale navíc štěpí i vazby 1,6-α-D ve větveném amylopektinu (Obr.3). Tedy tímto enzymem je možno zcukřit škrob až na glukózu (Hamrová 1988). Komerčně se využívají enzymy např. z rodů Aspergillus a Endomycopsis. Pululanázy (EC 3.2.1.41) a Izoamylázy ( EC 3.2.1.68) Tyto enzymy štěpí vazby 1,6-α-D v amylopektinu. Pululanázy se dělí na pululanázy I a II, kde pululanáza typu II je schopna na rozdíl od pululanasy I štěpit i vazby 1,4-α-D v amyláze. Výhodou pululanázy II je, že dokáže rozštěpit škrob bez nutnosti nasazení jiných enzymů. Izoamylázy se liší od pululanáz neschopností hydrolyzovat pululan. Celulázy Tyto enzymy umí štěpit celulózu na zkvasitelné cukry, které jsou obsaženy zejména v obalových vrstvách. Tyto enzymy se dnes již běžně využívají a získávají se z geneticky modifikováných hub (Petr, 2007). Proteázy Kromě enzymů štěpící polysacharidy na jednoduché sacharidy se ještě přidávají proteázy, které štěpí bílkoviny, a dodávají tak pohotověji dusík pro výživu zkvašujících mikroorganismů. 25
Tab.9 Působení enzymů používaných pro zcukřování škrobu ( Antranikian, 1997) Enzym štěpené vazby specifické reakce výsledný produkt α-amyáza 1,4-α-D uprostřed molekuly větvené oligosacharidy, lineární dextriny, lineární oligosacharidy a glukóza β-amyláza 1,4-α-D od neredukujícího konce maltóza a větvené polymery glukoamyláza 1,4-α-D a 1,6-α-D od neredukujícího glukóza konce isoamyláza 1,6-α-D náhodně lineární dextriny pululanáza I 1,6-α-D náhodně lineární oligosacharidy pululanáza II 1,4-α-D a 1,6-α-D náhodně maltóza, glukóza Obr. 1 Působení α-amylázy (Hamrová, 1988) Obr.2 Působení β- amylázy ( Hamrová, 1988) maltóza 26
Obr.3 Působení glukoamylázy ( Hamrová, 1988) glukóza 2.5 Prokvášení zápar Jak bylo výše popsáno, připravená zápara se musí zakvasit příslušným mikroorganismem, který produkuje ze zkvasitelných cukrů etanol. Pro tento účel se využívá kvasinek popř. bakterií. Tento proces ovlivňuje celá řada podmínek zejména druh mikroorganismu, a dále přítomnost či nepřítomnost kyslíku, teplota a ph (Šilhánková, 2002). 2.5.1 Mechanismus etanolového kvašení Pod pojmem kvašení se rozumí všechny reakce aerobních i anaerobních mikroorganismů, jejichž konečnými produkty jsou látky energeticky bohatší než voda a CO 2. Tedy lze rozlišit dva typy kvašení a to, pravé kvašení a nepravé kvašení. Etanolová fermentace patří mezi kvašení anaerobní, při němž při využívání substrátu glukózy, se energie uvolňuje podle rovnice: C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2. což lze také popsat pomocí Embdenovo-Meyerhofovo schéma etanolové glykolýzy (Obr.4) Nutné je si při výrobě lihu uvědomit, jak poukazuje Pelikán (2001), že takto reakce běží pouze v kyselém prostředí, naopak v alkalickém prostředí se tvoří mimo etanolu také glycerol a octová kyselina (Obr.5). Mimo etanolu jsou přítomné i některé vyšší alkoholy, např. propanoly a butanoly, které vznikají z mastných kyselin a aminokyselin (Velíšek, 2002). Pokud chceme přeměnu popsat podrobně, musíme vyjít z mechanismu glykolýzy, kdy je glukóza přeměněna na pyruvát, který se v anaerobním prostředí pomocí enzymu pyruvátdekarboxyláza dekarboxyluje na acetaldehyd, který je následně pomocí alkoholdehydrogenázy redukován na etanol (Koutník, 2001). 27
Tento anaerobní proces odbourávání glukózy používají kvasinky rodu Sacharomyces. Vzhledem k tomu, že tyto mikroorganismy jsou fakultativně anaerobní, za přítomnosti kyslíku by se pyruvát odboural až na CO 2 a H 2 O (Rychtera, 1991). Jsou-li pomocí kvasinek zkvašovány disacharidy, což se týká zejména sacharózy ve třtině pro výrobu bioetanolu viz výše, probíhá rovnice pro etanolové kvašení takto: C 12 H 22 O 11 + H 2 O 4 C 2 H 5 OH + 4 CO 2 Co se týče fermentativních schopností anaerobních bakterií, tak velkou nevýhodou je, že při zkvašování tvoří mnoho vedlejších produktů, čímž snižují výtěžnost a jakost produktu. Obr. 4 Embdenovo-Meyerhofovo schéma etanolové glykolýzy Co se týče fermentativních schopností anaerobních bakterií, tak velkou nevýhodou je, že při zkvašování tvoří mnoho vedlejších produktů, čímž snižují výtěžnost a jakost produktu. 28
Obr. 5 Kvašení glukózy v alkalickém prostředí (Neubergovo schéma) 2.5.2 Kvasinky v kvasném průmyslu V kvasném průmyslu lze využít kvasinek a bakterií, jak bylo popsáno. Ovšem nejvíce jsou využívány kvasinky. V lihovarské praxi se uplatňují pouze kmeny kvasinek, náležející k řádu Endomycetales do čeledi Endomycetaceae, rodu Saccharomyces a druhu cerevisiae. Je to z důvodu, že tyto kvasinky zaručují při optimálním vedení kvasných procesů maximální výtěžnost a dávají produkty prosté vedlejších produktů (Pelikán, 1996). Tyto kvasinky vždy zkvašují glukózu, sacharózu, maltózu, galaktózu a rafinózu. Jak uvádí Šilhánková můžeme kvasinky rozdělit následovně: zkvašuje li kvasinka glukózu, zkvašuje i fruktózu a manózu zkvašuje li kvasinka manózu nezkvašuje laktózu nezkvašuje li kvasinka glukózu, tak nezkvašuje žádný cukr zkvašuje li kvasinka nějaký disacharid, zkvašuje i glukózu 2.5.2.1 Morfologie a cytologie kvasinek Jedná se o jednobuněčné eukaryotní mikroorganismy (Obr.6), náležící mezi houby. Český název kvasinky dostaly pro schopnost zkvašovat monosacharidy, některé disacharidy a trisacharidy. Rozmnožují se převážně vegetativně pučením nebo pohlavně pomocí pohlavních spór. 29
Tvar buňky může být vejčitý, elipsoidní nebo kulovitý. Buňka je tvořena buněčnou stěnou, která je tvořena hemicelulózami, proteiny a tuky. Pod vlastní buněčnou stěnou je cytoplazmatická membrána, která je polopropustná a tvoří membránu pro vstup a výstup látek do buňky. Obsah buňky je tvořen cytoplazmou, ve které se nachází vakuoly, jádro, rezervní látky, mitochondrie, endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát. Jádro je kulovitá organela, ohraničená membránou, obsahující DNA. Rezervní látky mají funkci zásobárny látek pro buňku, jedná se o zrníčka glykogenu a kapiček tuku. Mitochondie představují dýchací centrum buňky, jejich tvar je kulovitý až vláknitý. Endoplazmatické retikulum je místo, ve kterém dochází k syntéze a metabolizmu bílkovin. Golgiho aparát má tvar měchýřku a má vztah k syntéze buněčných stěn (Šilhánková, 2002). Obr. 6 Buňka kvasinek ( Šilhánková, 2002) 2.5.2.2 Chemické složení kvasinek Kvasinky obsahují 65 85 % vody a 15 35 % sušiny. Sušina je tvořena přibližně z 50 % bílkovinami, 2 3 % tuku, 8 9 % minerálními látkami, z nichž téměř polovinu tvoří fosfor, dále to jsou draslík, hořčík, vápník, křemík, síra a železo. Významnou složkou sušiny jsou vitaminy, zejména vitaminy skupiny B, provitamin D (ergosterol), kyselina listová a biotin (Hamrová, 1988). 30
2.5.2.3 Výživa kvasinek Jak poukazuje Pelikán (1996) je velmi důležité, aby v zápaře byl dostatek živin, protože při jejich nedostatku nedojde k pomnožení kvasinek a substrát zůstane neúplně prokvašen. Základem výživy kvasinek pro optimální průběh kvasných procesů jsou dusíkaté látky. V úvahu přicházejí peptidy, polypeptidy, amidy a aminokyseliny. Z těchto sloučenin získává buňka látky pro výstavbu svých enzymů a peptidů. Tyto dusíkaté látky představují pro buňku i zdroj uhlíku. Další důležitou složkou jsou minerální látky draslík, fosfor, hořčík, vápník, které se podílejí na látkové výměně a mangan, měď a železo, které jsou důležité pro funkci enzymů (Pelikán, 1996). 2.5.2.4 Činitelé ovlivňující činnost kvasinek Jedná se o teplotu, koncentraci substrátu a ph prostředí. Teplota Optimální teplota pro kvasnou činnost kvasinek se pohybuje mezi 27 30 C. Při vyšší teplotě se snižuje produkce etanolu kvasinkami, přičemž při teplotě 55 C dochází k usmrcení kvasinek. Koncentrace substrátu Při tvorbě zápary je potřeba připravit správnou koncentraci cukru v roztoku, a to 16 18 %, protože při vyšší koncentraci se prodlužuje doba kvašení a zvyšuje se množství neprokvašeného substrátu. ph prostředí ph zápary se má pohybovat mezi 4,6 5,6. Pokud působí vyšší ph, rozkládají se vlastní bílkoviny tzv. samotrávení a kvasinky odumírají. Navíc v alkalickém prostředí se začíná tvořit glycerol a kyselina octová na úkor etanolu (Pelikán, 2001). 31
2.6 Průmyslová výroba lihu z obilovin Dříve se využívala pro výrobu zápary metoda pařáková, kterou dnes nahradila metoda infúzní. Vzniklá zápara se zakváší vhodnými mikroorganismy a vzniklý etanol činností těchto mikroorganismů se oddestiluje. 2.6.1 Příprava sladké zápary Tato infúzní metoda se skládá ze čtyř fází: mechanické rozmělnění suroviny, smísení s vodou, přidání enzymů (zcukření) a následné zchlazení zápary. Obilné zrno se rozemele na velikost 0,02 0,2 cm a smísí se s studenou vodou nejlépe v poměru 1:3 a vyšším (Wolf, 1994). Poté se směs zahřeje a při dané teplotě se přidají vhodné komerční enzymové preparáty, upraví se ph a směs ze zahřívá na určitou teplotu po určitou dobu než dojde ke zcukření. Konkrétní teploty a doby potřebné ke zcukření jsou popsány u jednotlivých preparátů. 2.6.2 Zakvašování a kvašení sladké zápary Po zcukření následuje zchlazení na zákvasnou teplotu 30 C a následné zakvašení zápary vhodnými mikroorganismy ( Augustín, 1991). Při kvašení rozdělujeme tyto tři operace: rozkvašování, hlavní kvašení a dokvašování (Obr.7). Celý tento proces trvá 72 h při teplotě 30 C (Dyr, 1955). Rozkvašování nastává ihned, aniž to zjevně pozorujeme, protože vznikající CO 2 se pohlcuje záparou. Na počátku pozorujeme zpravidla osychání povrchu, způsobené vystupujícím šrotem, teprve po nasycení zápary se objevuje silnější vývoj plynů. Hlavní kvašení nastupuje podle výše násadní teploty a to přibližně při prokvašení 35 45 % cukru. V tomto období již má zápara 4 5 % alkoholu, tedy rozmnožování kvasinek ustává. Dokvašování je posledním stádiem, kdy dochází ke konečnému prokvašení zápary. 32
Obr. 7 Kvasné křivky kvašení zápar (Pelikán, 2001) 2.6.3 Destilace zralé zápary Po prokvašení se získává ethanol ze zralé zápary destilací, která je založena na různé těkavosti a tenzi par destilujících složek roztoku. U nás se provádí destilace pomocí kontinuálních destilačních přístrojů. Podle Pelikána (2001) lze pokládat prokvašenou záparu za směs vody a etanolu. Voda vře při 100 C a etanol při 78,3 C, to ovšem neznamená, že se nejprve odpaří etanol a poté voda, je to z důvodu, že směs vody a lihu vře mezi těmito dvěma hodnotami a tvoří tzv. azeotrop. Z tohoto důvodu nelze nikdy získat absolutní alkohol, a proto je nutná jeho rektifikace a deflegmace. Rektifikace je pochod, při němž se opakovanou destilací získává silnější destilát, který se zároveň čistí. U nás se provádí kontinuální destilací (Pelikán, 2001). Deflegmací rozumíme frakční kondenzaci parní směsi. Při ochlazení lihových par zkondenzuje nejdříve složka méně těkavá (voda) a tím se zvýší podíl etanolu v parách a následně i v kondenzátu (Hamrová,1988). Místo destilace lze uplatnit membránovou filtraci, extrakce různými rozpouštědly, extrakce pomocí CO 2 nebo adsorpce na molekulových sítech. Ovšem tyto systémy nemohou zatím konkurovat používaným destilačním metodám (Rychtera, 1991). 33
2.7 Produkty lihovarského průmyslu Mezi produkty lihovaru patří zejména etanol. Vedlejším produktem jsou výpalky, které obsahují všechny nezkvašené látky (Tab.10). Jejich jakost závisí na složení suroviny a zejména na procesu výroby. Např. u obilovin činí asi 350 400 l na 100 kg obilovin a u brambor 110 120 l na 100 kg brambor (Pelikán, 2001). Nejdůležitější látkou jsou bílkoviny, dále vitaminy, minerální látky a tuk. Jejich využití je zejména na krmné účely, popř. se dají využít i jako hnojivo (Hamrová, 1988). Tab. 10 Složení výpalků (www.bioetanol.cz ) název obsah v sušině (%) bílkoviny (F = 6,25) 27,80 škrob 3,20 lipidy 4,80 vláknina 41,20 popel 4,30 2.8 Laboratorní kvasná zkouška Laboratorní kvasná zkouška, je založena na zcukření, prokvašení zápary a následné destilaci. Dříve se provádělo zcukřování kyselou hydrolýzou, dnes se provádí výhradně enzymovými preparáty. Poté se provádí zakvašení vhodnými kvasinkami a po prokvašení se zápara destiluje pomocí jednoduché aparatury v laboratoři. Kvasné zkoušky jsou různě modifikovány, podle použité suroviny, vhodného dávkování enzymů a reakčních podmínek v pracích různých autorů (Pieper a Thomas, 1989). 34
3.0 CÍL PRÁCE 1. Vypracovat literární rešerši k problematice využití surovin pro výrobu bioetanolu se zaměřením na přípravu sladké zápary. 2. Na vybraném vzorku pšenice posoudit průběh ztekucování a zcukřování škrobu pomocí použití specifických enzymů. 3. Stanovit výtěžnost bioetanolu připravené zápary. 35
4.0 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál 4.1.1 Charakteristika použité odrůdy pšenice Pro pokus byla vybrána odrůda pšenice Eurofit. Jedná se o středně ranou pekařskou odrůdu A, která je vhodná do všech oblastí pěstování. Doporučovaný výsevek je cca 4,0 miliony semen na hektar dle aktuálních půdních a klimatických podmínek. Je středně odolná proti poléhání, proto se doporučuje aplikovat růstové regulátory. Je vysoce odolná proti vyzimování a také má dobrou odolnost vůči chorobám. Poskytuje vysoké stabilní výnosy zrna ve všech oblastech pěstování. Odrůda Eurofit má velkou výhodu, že snížení počtu odnoží vlivem sucha je schopna kompenzovat vysokou produktivitou z jednoho klasu. (Registrace odrůdy v ČR 2006 a jejím udržovatelem je BOR s.r.o. Plzeň). 4.1.2 Charakteristika použitých enzymů Spezyme ethyl Jedná se o ztekucující termostabilní α-amylázu, která je funkční i při nízkém ph. Tato α-amyláza je produkována geneticky modifikovaným kmenem Geobacillus stearothermofilus. Velkou výhodou tohoto enzymu je, že je vysoce termostabilní i bez přidání vápenatých iontů a vysokou rychlostí ztekucování škrobu. Fermenzyme L 400 Jedná se o kombinaci zcukřujícího enzymu 1,4-α-D-glukan hydrolázu a proteázu, kdy oba tyto enzymy jsou produkovány specifickými kmeny Aspergillus niger. Hydroláza štěpí jak vazby 1,4-α-D tak vazby 1,6-α-D čímž zvyšuje následně alkoholovou výtěžnost. Proteáza má za úkol štěpit bílkoviny na aminokyseliny a následně při kvašení pohotově dodávat dusík kvasinkám. 36
Optimash XL Jedná se o celulázu a xylanázu, které štěpí celulózu, arabinoxylany a β glukany. Tyto enzymy mají za úkol rychle snížit viskozitu roztoku a usnadnit tak ztekucování a zcukřování škrobu. Všechny tyto enzymy jsou produkty firmy Genencor International. Bližší údaje o dávkování těchto enzymů a podmínkách působení jsou uvedeny v Tab.11. Tab. 11 Dávkování enzymů a optimální podmínky ztekucování a zcukřování škrobu Enzym dávka na 100 g šrotu [μl] ph teplota [ C] Optimash XL 25 4,5 5,0 65 70 Spezyme ethyl 80 5,4 5,8 83 95 Fermenzyme L 400 50 3,8 4,5 60 65 4.1.3 Kvasinky V laboratorních kvasných zkouškách byly použity sušené kvasinky kmene Saccharomyces cerevisiae uvarum s obchodním názvem SIHA Amyloferm. 4.2 Metodika 4.2.1 Rozbor zrna V rámci prováděných analýz byla u zrna odrůdy pšenice Eurofit stanovena: Vlhkost stanovuje se vážkově Objemová hmotnost pomocí obilného měřiče Podíl plných zrn pomocí Steineckerova prosévadla N látky pomocí přístroje Inframatic Obsah škrobu polarimetricky dle Ewerse 37
4.2.2 Příprava zápary Vzorek byl pomlet na mlýnku OZAP, který umožňuje hrubší granulaci mletí. Následně byl ztekucen a zcukřen pomocí výše uvedených enzymů. V rámci ztekucování a zcukřování byly odebírány vzorky zápary (25 ml) po 30 minutách, 60 minutách, 90 minutách, 100 minutách, 125 minutách a 150 minutách rmutování. Vzorky byly následně zfiltrovány a analyzovány na HPLC. postup přípravy zápary Do rmutovací kádinky bylo naváženo 100g šrotu, přidáno 350 ml vody a míchadlem promícháno. ph suspenze bylo upraveno na 5,5 pomocí 0,5M H 2 SO 4 Do rmutovací kádinky vložené do rmutovací lázně vytemperované na 65 C bylo přidáno 25 µl enzymu Optimash XL. Při této teplotě za stálého míchání enzym působil 30 minut. Poté byl přidán enzyme Spezyme ethyl (80 µl) a teplota rmutu se zvyšovala na 85 C. Dle potřeby bylo ph rmutu upravováno na 5,5 pomocí 0,5 M H 2 SO 4. Při této teplotě byl rmut udržován po dobu 90 minut. Po této době byl rmut postupně ochlazen na 60 C, ph upraveno na 4 pomocí 0,5M H 2 SO 4 a následně přidáno 70 µl enzymu Fermenzyme L 400 a docukřeno 30 minut. 38
4.2.3 Kvasná zkouška Vzniklá zápara byla zchlazena na 25-30 C a převedena do zvážené Erlenmayerovy baňky, a dovážena vodou na 500 g. Byl přidán odvážený 1 g kvasinek S. cerevisiae a kvašení proběhlo 96 h při 30 C. Baňka s prokvašenou záparou byla zvážena a zfiltrována přes plátno. 250 g filtrátu bylo převedeno do destilační baňky, upraveno ph na 7 pomocí 0,5M NaOH, přidán odpěňovací roztok a destilováno do předlohy s 25 ml destilované vody. Z předlohy byl roztok převeden kvantitativně do 200 ml odměrné baňky a doplněn destilovanou vodou po značku. Po vytemperování roztoku na 20 C byla změřena hustotu roztoku pyknometricky a pomocí tabulek dohledán obsah etanolu v obj. %, který byl použit pro výpočet výtěžnosti. Následně byl proveden výpočet výtěžnosti etanolu v la na 100 kg sušiny: la bioetanol/100 kg sušina = hmotnost zápary[g] koncentrace bioetanolu [%] 100 navážka šrotu [g] sušina vzorku (%) 4.3 Vyhodnocení výsledků Výsledky byly zpracovány do tabulek a grafů. 39
5.0 VÝSLEDKY A DISKUSE Výtěžnost bioetanolu je ovlivněna chemickým složením obilného zrna. Svou roli zde sehrává také příprava rmutu, tj. granulace a použití specifických enzymů. Tato práce se zaměřila především na hodnocení průběhu zcukřování zápary při využití enzymatických preparátů firmy Genencor International. Hodnocena byla rychlost jejich účinku, efektivnost zcukřování a výtěžnost bioetanolu. 5.1 Vyhodnocení kvality použité suroviny Podle Zimolky (2005), koreluje objemová hmotnost a podíl plných zrn s obsahem škrobu. Při vyšší objemové hmotnosti mají zrna nižší podíl obalových vrstev, což je výhodné pro zcukřování škrobu. U odrůdy Eurofit byla zjištěna hodnota 846,5 g/l, což je hodnota v porovnání s normou velmi vysoká, ale pokud to máme srovnat s obsahem škrobu, musíme konstatovat, že se nám nepotvrdila korelace s objemovou hmotností, protože obsah škrobu byl pouze 65,29 %, přičemž zrno pšenice může obsahovat i více jak 70 % škrobu. Stanovenou vysokou hodnotu objemové hmotnosti podporuje i vysoký podíl plných zrn, stanovených jako podíl nad sítem 2,5 a 2,8 mm. Z Tab. 12 vyplývá, že celkový podíl plných zrn u stanovovaného vzorku činil téměř 95 %, což můžeme považovat za velmi příznivou hodnotu. Bohužel se nepotvrdilo, že příznivé mechanické vlastnosti se pozitivně podílejí na vysokém podílu škrobu. Obsah dusíku podle Šimůnka (1996) se pohybuje u pšenice mezi 9,25 % 12,83 %. Pro výrobu bioetanolu je vhodnější nižší obsah N látek, protože s jejich vyšší koncentrací klesá obsah škrobu. U našeho vzorku byla stanovena hodnota 12,3 %, což je možno považovat za méně příznivé a koresponduje to i s nižším obsahem škrobu. Přesto ale můžeme námi použitý vzorek považovat za vhodný pro výrobu bioetanolu, protože jak uvádí Zimolka (2005), pro výrobu bioetanolu je vhodná pšenice s minimálním obsahem škrobu 60%. 40
Tab. 12 Mechanické vlastnosti a chemické složení zrna pšenice Eurofit obj.hmotnost [g/l] 846,5 škrob 65,29 N látky 12,3 podíl plných zrn nad sítem 2,8 mm [%] 71,72 podíl plných zrn nad sítem 2,5 mm [%] 23,27 propad [%] 5,01 5.2 Vyhodnocení průběhu zcukřování zápar V rámci ztekucování a zcukřování byla prováděna analýza zápary. Po 30 minutách, 60 minutách, 90 minutách, 100 minutách, 125 minutách a 150 minutách byly odebrány vzorky zápary (25ml) a stanoven u nich obsah jednotlivých sacharidů na HPLC. Výsledky v absolutních hodnotách jsou uvedeny v Tab. 13, ze které je možné vyčíst dynamiku změn jednotlivých sacharidů. Pro vyjádření dynamiky změn v obsahu jednotlivých sacharidů bylo použito grafické vyjádření. Tab. 13 Absolutní hodnoty obsahu sacharidů v průběhu přípravy zápary průběh ztekucování / mg/100g zcukření / mg/100g cukr \ fáze (min) 0 30 60 90 100 125 150 oligosacharidy 6794 4829 2284 1812 626 281 187 maltotrióza 2607 2128 2984 843 415 379 288 maltóza 728 1628 2933 3976 4211 3621 2660 glukóza 62 1443 1568 3281 4682 5849 6507 suma 10191 10058 9829 10002 10034 10255 9792 41
Graf č. 1 Odbourávání oligosacharidů odbourávání oligosacharidů 80 70 oligosacharidy [relativní %] 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 čas [min] Jak je vidět z grafu č.1, oligosacharidy jsou v průběhu přípravy zápary postupně odbourávány, což koresponduje s průběhem ztekucování a zcukřování škrobu. Za pozitivní můžeme považovat, že obsah oligosacharidů, které jsou nezkvasitelné, v průběhu rmutování klesl z 66,67 % na 1,91 %. 42
Graf č.2 Odbourávání maltotriózy odbourávání maltotriózy 35 maltotrióza [relativní %] 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 čas [min] U maltotriózy docházelo v prvních 60 minutách ke střídání nárůstu a poklesu štěpení maltotriózy, což bylo způsobeno nárůstem maltózy a glukózy. V dalších fázích procesu již obsah maltotriózy pouze klesal, což bylo způsobeno zpočátku přírůstkem maltózy a následně štěpnými procesy spojenými s tvorbou glukózy. Celkový pokles maltotriózy byl z 25,28 % na 2,94 %. 43
Graf č.3 Odbourávání maltózy odbourávání maltózy 45 40 maltóza [ relativní %] 35 30 25 20 15 10 5 0 0 30 60 90 120 150 180 čas [ min] Jak je vidět z grafu č.3 maltózy, v prvních 100 minutách vzrůstal její obsah, což bylo způsobeno štěpením oligosacharidů a maltotriózy. Po této době byl přidán zcukřující enzym, který štěpil maltózu na glukózu, a proto již docházelo ve zbývajícím čase pouze k poklesu obsahu maltózy. Obsah maltózy se zvýšil z 7,14 % na 27,17 %. 44
Graf č.4 Odbourávání glukózy přírustek glukózy glukóza [relativní %] 70 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 čas [min] Obsah glukózy v počátku rmutování byl nízký a odpovídal standartu chemického složení zrna. V průběhu 30 minut od počátku obsah glukózy mírně rostl. Největší nárust tvorby glukózy byl po přidání zcukřujícího enzymu, což koresponduje s průběhem zcukřování. Celkový obsah glukózy vzrostl z 6,08 % na 66,45 %. Tedy můžeme konstatovat, že obsah glukózy vzrostl více jak desetkrát oproti původní hodnotě. Podíl bez problému zkvasitelných sacharidů (maltóza a glukóza) na konci rmutování tvořil 93,62 % zápary. 45
5.3. Vyhodnocení výtěžnosti Teoretická výtěžnost bioetanolu představuje při škrobnatosti 65,29 % v sušině maximální výtěžnost 43,5la/100 kg sušiny. Skutečný výtěžek bioetanolu byl pouze 32,9 la/100 kg sušiny, což lze považovat za průměrnou hodnotu. Příčiny nižšího výtěžku můžeme vidět v nedostatečném prokvašení zápary, ale zejména nedokonalým oddestilováním etanolu z prokvašené zápary, o čemž vypovídá i výtěžnost stanovená z prokvasu, která představuje 38 la/100 kg sušiny. 46
6.0 ZÁVĚR V rámci bakalářské práce byla studována problematika výroby bioetanolu z různých surovin v závislosti na různé přípravě rmutů. Hlavní pozornost pak byla věnována produkci bioetanolu z obilovin, kde jsme se zaměřili zejména na způsoby přípravy obilných rmutů. V rámci těchto aktivit byl hodnocen průběh ztekucování a zcukřování zrna pšenice odrůdy Eurofit pomocí enzymatických přípravků firmy Genencor International. Na základě dosažených výsledků lze formulovat tyto závěry: U pšenice odrůdy Eurofit byly stanoveny tyto ukazatele lihovarnické kvality: Objemová hmotnost 846,5 g/l; podíl plných zrna jako podíl nad sítem 2,8 mm 71,72 % a podíl nad sítem 2,5 mm 23,27 % a propad 5,01 %; obsah dusíku 12,3 % a obsah škrobu 66,43 %. Podle zjištěných charakteristik byla surovina použitelná pro výrobu bioetanolu. V průběhu ztekucování a zcukřování zápary byly hodnoceny změny v chemickém složení rmutu. Při použití enzymů pro ztekucování a zcukřování byly stanoveny následující změny v obsahu sacharidů: Nárůst glukózy z 6,08 % na 66,45 % a nárůst maltózy z 7,14 % na 27,17 %. Naopak pokles oligosacharidů byl z 66,67 % na 1,29 % a pokles maltotriózy byl z 25,58 % na 2,94 %. Z těchto hodnot lze vyvodit, že dané enzymy jsou vhodné pro přípravu zápar. Výtěžnost bioetanolu byla 32,9 la/ 100 kg sušiny, kde teoretická výtěžnost byla maximálně 38 la/ 100kg sušiny, což značí průměrnou výtěžnost. Ztráty byly dány zejména neúplným oddestilováním prokvašené zápary. 47
LITERATURA AUFHAMER, W. PIEPER, H.J. STÜTZEL, SCHÄFER, V. eignung von Korngut verschiedener Getreidearten zur Bioethanolproduction in Abhängigkeit von der Sorte und den Autwuchsbedingungen. Die Bodenkultur. Die Bodenkultur, 1994, 45, 2. s. 177-187 BASAŘOVÁ G. pivovarsko sladařská analytika 1. díl, Merkanta Praha, 1992, s. 385 DIVIŠ, J. Český lihovarský průmysl a bioetanol. Kvasný průmysl, 2004, (9)., s. 268-270 DYR, J. a kol. Lihovarství 1.díl. SNTL Praha, 1956, 320 s. DYR J. a kol. Lihovarství 2.díl. SNTL Praha, 1963, 402 s. EXNAR, P. GARAI, J. MELZOCH, K. ET AL. Lihovarská příručka. Agrospoj Praha, 1998, s. 215 HAMROVÁ, L. Technologie zemědělského lihovarství. Alfa Bratislava, 1988, 185 s. HAMPL, J. Cereální chemie a technologie. Nakladatelství technické literatury Praha, 1970 s. 51-142 JEŠETA, M. Úskalí biopaliv. Úroda, 2007, (6)., s. 41 43 JEVIČ, P. Výroba a tržní uplatnění motorových biopaliv. Agromagazín, 2006, (2)., s. 22-28 KÁRA J. Motorová paliva z biomasy v ČR, ÚZPI, 2001 KENT, L.N. EVERS, D. A. Technology of cereals. 4 th edition, Elsevier Science Ltd, Oxford, 1994, s.334 48