UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd Porovnání a optimalizace metod na stanovení aktivit aminotransferas v biologickém materiálu. Bakalářská práce Školitel specialista: Mgr. Ješinová Lenka Vedoucí bakalářské práce: Ing. Szotáková Barbora Hradec Králové 2007 Jakub Kučírek

Na tomto místě bych rád poděkoval všem, kteří mi pomohli s touto bakalářskou prací. Mé poděkování patří především Mgr. Lence Ješinové za věcné připomínky a odborné vedení celé práce, RNDr.Karlu Kohoutkovi za umoţnění zpracování experimentální části. Dále chci poděkovat Ing. Barboře Szotákové za trpělivost a pomoc při závěrečném zpracování a poděkování patří také mé rodině za trpělivost a podporu. 2

Obsah : 1. Úvod................... 4 2. Část teoretická............. 5 2.1. Obecná charakteristika enzymů... 5 2.2. Klasifikace a názvosloví enzymů.. 6 2.3. Katalytická aktivita enzymů.... 7 2.3.1. Vyjadřování katalytické aktivity........... 7 2.3.2. Faktory ovlivňující katalytickou aktivitu..... 8 2.4. Lokalizace a formy jejich výskytu. 9 2.5. Aminotransferázy.......... 11 2.5.1. Aspartátaminotransferáza... 12 2.5.2. Alaninaminotransferáza.... 16 3. Cíl práce................ 19 4. Část experimentální........... 19 4.1. Pouţité pomůcky.......... 20 4.2. Princip metody AST-IFCC...... 20 4.3. Princip metody AST Color...... 24 4.4. Princip metody ALT-IFCC...... 26 4.5. Princip metody ALT-Color...... 30 3

5. Výsledky................. 32 5.1. Porovnání naměřených hodnot Alt.. 32 5.2. Porovnání naměřených hodnot Ast.. 32 5.3. Měření správnosti a přesnosti metod pro stanovení Alt......... 35 5.4. Měření správnosti a přesnosti metod pro stanovení Ast...... 37 5.5. Porovnání testovaných metod metodou lineární regrese.......... 39 5.6. Vliv hemolýzy na stanovení transaminas............ 43 5.7. Vliv aldehydů na stanovení transaminas............ 44 6. Část závěrečná.............. 46 6.1. Závěr a zhodnocení........ 46 4

1. Úvod Vstupem výpočetní techniky, zvyšováním citlivosti analytických postupů, zaváděním nových analytických postupů, detekcí látek na molekulární úrovni, se stává laboratorní medicína dynamicky rozvíjejícím se oborem. Tento dynamický rozvoj je na druhé straně vykoupen finanční náročností analytických postupů, přístrojové techniky a důslednou přípravou biologického materiálu pro stanovení analytu. Vedle takto náročných analytických postupů, existují stále ještě postupy dostatečně spolehlivé a finančně nenáročné. Do této skupiny lze zařadit i postupy pro stanovení aktivity aminotransferas. I v tomto případě došlo ke zlepšení testu pro stanovení aktivity těchto enzymů. Od metody enzymatické s chemickou detekcí k metodě více krokové, plně enzymatické, která splňuje analytické poţadavky na přesnost a správnost. Aspartátaminotransferasa a alaninaminotransferasa jsou enzymy katalyzující transaminační reakce v organismu. Jejich zvýšená aktivita odráţí patofyziologické děje v organismu. I v dnešní době, kdy se velmi rychle rozvíjí laboratorní medicína, se s úspěchem pouţívají k posouzení poškození jaterní tkáně. Zhodnocením dynamiky vývoje aktivity těchto enzymů můţeme posuzovat úspěšnost, či neúspěšnost léčby. 5

2. Část teoretická 2.1 Obecná charakteristika enzymů Enzymy jsou bílkovinné makromolekuly s katalytickou funkcí. Nacházíme je ve všech ţivých systémech a předpokládá se, ţe i nejjednodušší buňky obsahují více neţ 3000 enzymů.mnohé enzymy obsahují vedle bílkovinné sloţky také nízkomolekulární termostabilní organickou sloučeninu obvykle zvanou kofaktor, která je pro jejich funkci nezbytná. Tato sloţka můţe být na bílkovinu navázána buď pevně, pak se povaţuje za stabilní součást molekuly a jmenuje se prosthetická skupina (např. pyridoxalfosfát u aminotransferas), nebo je od bílkovinné molekuly snadno odštěpitelná a můţe existovat v organizmu i samostatně bez ohledu na bílkovinnou část enzymu (ATP, NAD + ), v tomto případě ji označujeme jako koenzym.specifita enzymu je zajištěna výhradně bílkovinnou sloţkou tzv.apoenzymem),komplex apoenzymu s koenzymem pak nazýváme holoenzymem. Enzymy v mnoha směrech předčí i umělé katalyzátory v těchto směrech: účinnost - jediná molekula enzymu je schopna za 1 s přeměnit aţ 5 x 10 4 molekul substrátu (reakční rychlost tak můţe aţ o několik řádů převyšovat rychlost reakcí katalyzovaných umělými katalyzátory) specifita - enzymy vykazují značnou specifitu nejen v závislosti na typu katalyzované reakce (reakční nebo účinková specifita), ale i v závislosti na struktuře přeměňovaných substrátů (substrátová specifita) reakční podmínky - enzymy pracují většinou za mírných podmínek (teplota do 40 o C,tlak 0,1 MPa a ph většinou kolem 7) regulace - reakce katalyzované enzymy jsou snadno regulovatelné, a to dokonce na několika úrovních 6

netoxičnost - tato vlastnost enzymů je ceněna hlavně v průmyslových aplikacích 2.2 Klasifikace a názvosloví V počátcích studia enzymů byly jednotlivým enzymům dávány celkem náhodné názvy, většinou s koncovkou - in, z nichţ některé se pouţívají dodnes (ptyalin, pepsin, trypsin).později byla pro enzymy zavedena koncovka -asa a název byl tvořen podle substrátu, jehoţ přeměna byla enzymem katalyzována (amylasa, lipasa, fumarasa), nebo podle charakteru katalyzované reakce (hydrolasa, transaminasa, dehydrogenasa) S přibývajícím počtem objevených enzymů se v názvosloví nevyhnutelně objevovaly dvojznačnosti a často nebylo jasné, o který enzym vlastně jde. Z tohoto důvodu přijala Mezinárodní biochemická unie (International Union of Biochemistry, IUB) komplexní systém nomenklatury enzymů, zaloţený na reakčním mechanizmu (V.W.Rodwell). Tato nomenklatura byla navrţena v roce 1961, revidována a doplněna byla v letech 1964, 1972, 1978 a 1984. Základem klasifikace je rozdělení enzymů do 6 hlavních tříd které se dále dělí na pod-kategorie. Často se tak můţeme vedle jména enzymu setkat ještě s jeho číselným označením ve stylu EC 3.4.11.4 Dnes je všeobecně přijata, pouţívána a na jejím základě bylo vytvořeno i české názvosloví enzymů, které se snaţí o co největší podobnost s názvoslovím mezinárodním. Je zachována koncovka -asa a názvy se píší (aţ na výjimky) jako jedno slovo. 7

Dělení podle katalyzované reakce: EC 1 oxidoreduktasy - katalyzují intermolekulové oxidačně redukční přeměny, které realizují buď přenosem atomů vodíku (dehydrogenasy), nebo elektronů (transelektronasy),případně vestavěním atomu kyslíku do substrátu oxygenasy) EC 2 transferasy - realizují přenos skupin (-CH 3, - NH 2, zbytek glukosy apod.) v aktivované formě z jejich donoru na akceptor (např. aminotransferasy) přenášejí aminoskupinu z aminokyseliny na oxokyselinu) EC 3 hydrolasy - štěpí hydrolyticky vazby, které vznikly kondenzací (např. amidové, glykosidové, esterové) EC 4 lyasy - katalyzují nehydrolytické štěpení a vznik (pokud není energeticky náročný) vazeb C-C, C- O, C-N... Reakce většinou probíhá tak, ţe odštěpují ze substrátu nebo do něj vnášejí malé molekuly (H 2 O, CO 2, NH 3 ) bez pomoci dalšího reaktantu EC 5 isomerasy - realizují vnitromolekulové přesuny atomů a jejich skupin (tedy vzájemné přeměny isomerů) EC 6 ligasy - katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu látky uvolňující energii, např. ATP 2.3 Katalytická aktivita 2.3.1 Vyjadřování katalytické aktivity Mnoţství enzymu v ţivých objektech se nedá určit snadno, proto se dřívější pojem,,katalytická účinnost" nahrazuje pojmem aktivita enzymu. Způsoby vyjadřování aktivity (katalytické účinnosti) enzymů se postupně měnily. Ve snaze po unifikaci, a tím i moţnosti srovnávání údajů, navrhla enzymová komise IUB v roce 1961 mezinárodní jednotku aktivity 1 U 8

(představuje takové mnoţství enzymu katalyzujícího za standardních podmínek (30 C a optimálním ph) přeměnu 1 mikromol substrátu za 1 minutu. Po zavedení jednotek SI v roce 1972 byla definována nová jednotka pro katalytickou aktivitu - katal. Hodnota 1 kat odpovídá takovému mnoţství enzymu, které je nutné k přeměně 1 mol substrátu za 1 sekundu (při dodrţení standardních podmínek). Vzhledem k tomu, ţe jde o velkou jednotku, pouţívají se v praxi častěji mikrokataly (10-6 kat) a nanokataly (10-9 kat). Vztah staré (U) a nové jednotky je 1 U = 16,67 nkat 2.3.2 Faktory ovlivňující katalytickou aktivitu Katalytická účinnost enzymů je výrazně ovlivněna celou řadou různých nízkomolekulárních látek (hlavně iontů) označovaných jako efektory nebo modifikátory. Pokud efektor působí na enzym tak, ţe se váţe na aktivní místo enzymu, lze hovořit o isosterickém nebo autosterickém vlivu, v případě, ţe se efektor váţe na jinou část povrchu molekuly enzymu, neţ je aktivní místo, pak jde o tzv. allosterický vliv, látka se označuje jako allosterický efektor.zvyšuje-li daný efektor aktivitu enzymu, hovoříme o pozitivním efektoru, v případě, ţe účinnost enzymu sniţuje, označujeme jej jako negativní efektor neboli inhibitor Inhibitory lze většinou dělit podle mnoha různých hledisek, např. podle původu (přirozené a umělé), specifity (specifické a nespecifické) nebo podle mechanizmu účinku: Kompetitivní inhibitory - tvarem a strukturou se podobají přirozenému substrátu, se kterým soutěţí o aktivní místo enzymu. Rychlost reakce závisí na poměru inhibitor/substrát a vliv inhibitoru je moţné 9

potlačit nadbytkem přirozeného substrátu. Inhibice je reverzibilní. Nekompetitivní inhibitory - neváţí se v aktivním místě enzymu, nejsou chemicky podobné substrátu. Rychlost reakce závisí na mnoţství inhibitoru, ale inhibici nelze ovlivnit nadbytkem substrátu. Vratnost inhibice závisí na pevnosti vazby mezi inhibitorem a bílkovinnou částí enzymu, můţe být tedy vratná, ale i (prakticky) nevratná. Akompetitivní inhibitory - látky, které se váţí na enzym, aţ kdyţ vazba substrátu vhodně pozmění jeho konformaci. Nereagují tedy s volným enzymem, ale aţ s komplexem enzym-substrát. Vazbou na tento komplex zabraňují přeměně komplexu enzym-substrát na produkt. S tímto typem inhibice se setkáváme hlavně u dvousubstrátových reakcí, kdy se inhibitor můţe vázat na vazebné místo pro druhý substrát, vůči kterému pak vystupuje jako kompetitivní inhibitor. U některých enzymů dochází k inhibici substrátem v důsledku jeho vysoké koncentrace.důvodem můţe být, ţe se více molekul substrátu nespecificky naváţe v okolí aktivního místa enzymu. Zde tyto molekuly nemohou reagovat s katalytickými skupinami enzymu a nedochází tak k jejich přeměně.některým z výše uvedených mechanizmů můţe inhibovat účinek enzymu i produkt reakce, hovoříme pak o inhibici produktem, která představuje důleţitý nástroj v regulaci metabolických pochodů. 2.4 Lokalizace enzymů a formy jejich výskytu Podle místa působení dělíme enzymy na intracelulární a extracelulární. Intracelulární enzymy představují většinu enzymů, zůstávají uvnitř buňky, ve které vznikly, a tam také vykonávají specifické funkce. Zde 10

mohou být buď v rozpuštěné formě, nebo vázané v různých biologických strukturách - pak většinou tvoří organizované funkční komplexy multienzymové jednotky nebo multifunkční enzymy. Mnohé z intracelulárních enzymů se vyskytují jen v některých orgánech, některé enzymy se však vyskytují ve většině buněk celého organizmu. Extracelulární enzymy jsou vylučovány buňkami, které je vyrobily. Nacházíme je v četných tkáňových kapalinách - trávicí šťávy, krev, mozkomíšní mok. Některé z nich jsou vyráběny příslušnými buňkami v inaktivních formách označovaných jako proenzymy nebo zymogeny.jako izo(en)zymy nazýváme různé formy daného enzymu, které se postupně nahrazují během vývoje organizmu, nebo formy, které zastávají podobné úlohy v různých částech organizmu. U bílkovin sloţených z neidentických podjednotek představují isoenzymy různé hybridní formy. Typickým příkladem je savčí laktátdehydrogenáza, která existuje v pěti mnohočetných formách s různým procentním zastoupením v různých tkáních daného organizmu.mnohočetné formy enzymu katalyzující stejnou reakci nazýváme pseudoizoenzymy. Rozdíly v jejich vlastnostech nejsou způsobeny geneticky podmíněnými odlišnostmi v primární struktuře, ale důsledkem enzymových nebo neenzymových modifikací s jednou primární strukturou in vivo. Rozdíly jsou důsledkem dodatečných modifikacích nebo vazby různých látek na molekuly enzymů. (Biochemie Zdeněk Vodrážka, ACADEMIA Praha 1996,str.120-156.) 11

2.5. Aminotransferázy Souhrnně se takto označují enzymy, které katalyzují přenos amino-skupiny ze substrátu na vznikající produkt. V této práci se uţ dále budeme věnovat jen skupině transamináz označované ALT a AST. 12

2.5.1.Aspartátaminotransferáza EC 2.6.1.1. systematický název: L-aspartát: 2-oxoglutarát aminotransferasa Enzym, vyskytuje se jako homodimer. Jeho koenzymem je pyridoxalfosfát - derivát vitaminu B 6 (pyridoxin). Katalyzuje přenos aminoskupiny z L-aspartátu na 2- oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. Jde o tzv. transaminační reakci mezi aminokyselinou a oxokyselinou, současně dochází k oxidoredukci. Obecně tak vzniká z aminokyseliny oxokyselina a z oxokyseliny aminokyselina. Rovnováţná konstanta transaminačních reakcí se blíţí jedné, takţe reakce je volně reverzibilní Proto má tato reakce význam jak při syntéze (tvorbě aminokyselin z jejich ketoanalog), tak při odbourávání aminokyselin. Před odbouráním uhlíkaté kostry aminokyseliny v citrátovém cyklu je potřeba zbavit se aminodusíku. Přenosem aminoskupiny na 2-oxoglutarát vzniká glutamová kyselina, která je jako jediná schopná oxidační deaminace. Aminodusík se tak uvolní z organické molekuly aminokyseliny ve formě amoniaku. Glutamát kromě deaminace můţe přijmout ještě další aminoskupinu do své molekuly. Vzniká tak glutamin, který se významně podílí na odstranění toxického amoniaku z organizmu. Se svým koenzymem pyridoxalfosfátem se tak AST podílí na metabolizmu dusíku v organizmu, význam má i při transportu redukčních ekvivalentů přes vnitřní mitochondriální membránu. V největší míře je obsaţen v myokardu, kosterním svalu a v hepatocytech. Při poškození buňky se ve zvýšené míře do krve vyplavuje nejprve cytoplazmatický izoenzym, při těţkém 13

poškození se v krvi zvyšuje i aktivita AST z mitochondrií.. Stanovení katalytické aktivity AST v séru se vyuţívá hlavně k posouzení onemocnění jater, enzym nemá ţádný význam pro diagnostiku poruch myokardu. Kromě L-aspartátu a L-glutamátu přeměňuje také L-tyrozin, L-fenylalanin a L-tryptofan. Katalýza je kovalentní. Pyridoxalfosfát vytváří s apoenzymem Schiffovu bázi (vazba mezi oxoskupinou koenzymu a α-aminoskupinou lyzinu proteinové části enzymu), která je během katalýzy vystřídána stejným typem vazby k přeměňované aminokyselině. Během přeměny aminokyseliny na oxokyselinu je tak pyridoxalfosfát poután k aktivnímu centru enzymu jen pomocí iontových a hydrofóbních interakcí. Jsou známé dvě formy AST, lišící se svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi: cytoplazmatická a mitochondriální frakce. Tyto proteiny jsou kódovány rozdílnými geny, jde tedy o cytoplazmatický a mitochondriální izoenzym. Aspartátaminotransferázová reakce se podílí také na tzv. člunkovém mechanizmu (substrate shuttle), který se uplatňuje při transportu redukčních ekvivalentů přes vnitřní mitochondriální membránu. Vnitřní mitochondriální membrána je nepropustná pro molekulu koenzymu NAD +. Redukovaná forma tohoto koenzymu vzniká při oxidačních reakcích v cytoplazmě, např. v glykolýze nebo při oxidaci ethanolu na acetaldehyd. Za aerobních podmínek se NADH reoxiduje v dýchacím řetězci, lokalizovaném na vnitřní mitochondriální membráně. Ve skutečnosti však nejde o tutéţ molekulu NADH, vzniklou v cytoplazmě. Pomocí člunkového mechanizmu, zvaného malátaspartátový člunek, je pomocí cytoplazmatického NADH zredukován oxalacetát 14

na malát. Ten je pomocí přenašeče dikarboxylových kyselin ve vnitřní mitochondriální membráně přenesen do matrix mitochondrie, kde je opět oxidován na oxalacetát za současné redukce mitochondriálního NAD + na NADH. Pro uzavření cyklu je třeba, aby se oxalacetát vrátil zpět do cytoplazmy. Za katalýzy AST dochází k jeho přeměně na aspartát, který se pomocí přenašeče v mitochondriální membráně vrací zpět do cytoplazmy. 2.5.1.1 Zdroj (syntéza) Syntéza proteinové molekuly cytoplazmatického izoenzymu (412 aminokyselin, M r = 46 116) probíhá na ribozómech. Gen GOT1 je na 10. chromosomu. Syntéza mitochondriálního izoenzymu (430 aminokyselin, M r = 47 475) probíhá také na ribosomech v cytoplazmě, odkud je pak po posttranslační modifikaci transportován do mitochondrie (dimer má M r asi 90 000). Gen GOT2 se nachází na 16. chromosomu. 2.5.1.2. Distribuce v organismu, obsah ve tkáních AST je buněčný enzym, tj. svou katalytickou úlohu plní v buňce. Jeho aktivitu nalézáme však i v séru. Do krve se dostává z běţného obratu buněk, které tento enzym obsahují. Přibliţně stejná aktivita AST je v myokardu a v kosterním svalu. Dále se ve větším mnoţství nachází v játrech, kosterním svalu, ledvinách, pankreatu, slezině, plicích a erytrocytech. V hepatocytu je 35 % z celkové aktivity AST lokalizováno v cytoplazmě, 65% tvoří mitochondriální izoenzym. Ke zvýšení aktivity AST v séru dochází jiţ při zvýšení permeability buněčné membrány, jedná se o vyplavení cytoplazmatického izoenzymu. Při těţším poškození buněk se do krve 15

vyplavuje i mitochondriální izoenzym. Za fyziologických podmítek tvoří mitochondriální AST asi 12 % z celkové aktivity AST v séru. Poměr aktivity AST ve tkáni k aktivitě v séru je pro uvedené tkáně následující: 8 000 (myokard), 7 000 (játra), 500 (plíce), 50 (erytrocyty). 1.5.1.3. Biologický poločas 17 hodin. Mitochondriální izoenzym se odbourává rychleji neţ cytoplazmatický. 2.5.1.4. Kontrolní (řídící) mechanismy Aktivitu aminotransferáz zvyšují glukokortikoidy (indukují syntézu enzymu). 16

2.5.2. Alaninaminotransferáza EC 2.6.1.2. systematický název: L-alanin: 2-oxoglutarát aminotransferáza Enzym, vyskytuje se jako homodimer. Jeho koenzymem je pyridoxalfosfát - derivát vitaminu B 6 (pyridoxin). ALT (alaninaminotransferáza) je cytoplazmatický enzym, katalyzující přenos aminoskupiny z L-alaninu na 2-oxoglutarát za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. Se svým koenzymem pyridoxalfosfátem se tak ALT podílí na metabolismu dusíku v organismu. Kromě L-alaninu a L-glutamátu (přirozené substráty), přeměňuje také 2-aminobutanoát. Katalýza je kovalentní, probíhá tzv. ping-pong mechanismem. Pyridoxalfosfát vytváří s apoenzymem Schiffovu bázi (vazba mezi oxoskupinou koenzymu a α-aminoskupinou lyzinu proteinové části enzymu), která je během katalýzy vystřídána stejným typem vazby k přeměňované aminokyselině. Během přeměny aminokyseliny na oxokyselinu je tak pyridoxalfosfát poután k aktivnímu centru enzymu jen pomocí iontových a hydrofóbních interakcí. Reakce je volně reverzibilní, uplatňuje se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin. Se svým koenzymem pyridoxalfosfátem se tak ALT podílí na metabolismu dusíku v organismu. Nejvíce je obsaţen v hepatocytech, při poškození buňky se vyplavuje ve zvýšené míře do krve. Stanovení aktivity ALT v séru se vyuţívá převáţně k posouzení poškození jater. Další význam alaninaminotransferázové reakce je poskytnutí substrátu pro glukoneogenezi v játrech. Alanin, pocházející převáţně ze svalů, tak můţe být přeměněn na pyruvát, který je dále reakcemi glukoneogeneze přeměněn na glukózu. Ta můţe být játry 17

opět uvolněna do krve a stát se zdrojem energie např. pro svalovou buňku. Přenos alaninu ze svalu do jater a jeho přeměna přes pyruvát na glukózu, která se opět navrací do svalu, se nazývá alaninový cyklus. I při této dráze dochází k transportu aminodusíku na místo, kde můţe být detoxikován a připraven pro vyloučení z organismu ( syntéza močoviny) 2.5.2.1. Distribuce v organismu, obsah ve tkáních ALT je převáţně cytoplazmatický enzym, ve velmi malém mnoţství se vyskytuje i v mitochondriích. Ačkoli jde o buněčný enzym, tj. svou katalytickou úlohu plní v buňce, nalézáme aktivitu i v séru. Do krve se dostává z běţného obratu buněk (jde o cytoplazmatickou frakci, mitochondriální je málo stabilní a do krve se prakticky nedostává). Ke zvýšení aktivity ALT v séru dochází jiţ při zvýšení permeability membrány, zvláště pak při těţším poškození buněk, které enzym ve své cytoplazmě obsahují. Vyskytuje se v játrech, ledvinách, srdci, kosterním svalu a erytrocytech. Největší aktivitu mají hepatocyty. Aktivita v erytrocytech je 6krát vyšší neţ aktivita v séru. 2.5.2.2. Zdroj (syntéza) Syntéza polypeptidového řetězce (495 aminokyselin, M r = 54 439) probíhá na ribosomech. Gen GPT1 (AAT1) je na 8. chromosomu.alt je převáţně cytoplazmatický enzym, ve velmi malém mnoţství se vyskytuje i v mitochondriích. 2.5.2.3. Biologický poločas 2 dny 2.5.2.4. Kontrolní (řídící) mechanismy 18

Aktivitu aminotransferáz zvyšují glukokortikoidy (indukují syntézu enzymu). Internetové odkazy : http://kr.expasy.org./sprot/ http://brenda.bc.uni-koeln.de/ Použitá Literatura : Zdeněk Vodráţka Biochemie ACADEMIA Praha 1996 Masopust J. Klinická biochemie, poţadování a hodnocení biochemických vyšetřeni Karolinum Praha 1998 Voet D., Voet J.D. Biochemie Victoria Publishing Praha 19

3. Cíl práce Cílem této práce je: zhodnotit dostupné reagenční sety pro vyšetřování transamináz zhodnotit jejich klady a zápory pokusit se statisticky vyjádřit moţné nedostatky těchto testů prakticky ověřit moţné interference 4. Experimentální část Pro experimentální část byly pouţity komerčně připravované reagenční sety od firmy Biovendor (ALT- IFCC, AST-IFCC) a firmy Randox (ALT-Color, AST-Color ).Aminotransferázy (ALT, AST) lze stanovovat dvojím odlišným způsobem. V jednom případě se hodnotí kineticky, tedy změna absorbance v čase, příklad metody firmy Biovendor, a v druhém případě end-point, kdy je změřena absorbance po předešlém ukončení reakce, příklad metody firmy Randox. První případ, kdy stanovujeme katalytickou koncentraci kinetickým měřením, se jedná o metodu, která je uznána IFCC. Rozdíl těchto metod lze pozorovat jiţ v počátku. Metoda firmy Randox prezentuje měření aktivity enzymu v jednotkách U/l (je potřeba k výpočtům pouţít přepočítávací koeficient) a její pracovní rozmezí (mez detekce, linearita) je téţ odlišné. Nelze tedy srovnávat numerické vyjádření naměřených hodnot,(tab. 7,8).Povaţuji za nutné toto uvést hned na začátku. 20

4.1. Použité pomůcky: Poloautomatické pipety s fixním objemem o objemech 20µl, 100µl. Způsobilost pipet: 20µl CV=1,95%, BIAS=1.608% 100µl CV=0,83%, BIAS=0,947% Poloautomatické pipety s variabilním objemem 5-50µl a 100-1000µl. Způsobilost pipet: 5-50µl(test.objem 10µl) CV=2,27%,BIAS=0,74% 100-1000µl(test.objem450µl) CV=0,24%,BIAS=1,27% Při měření byl vyuţit optický systém automatického analyzátoru s moţností kinetického měření a měření end point. Plastové zkumavky k jednorázovému pouţití. 4.2. Princip metody (AST-IFCC) Aspartátaminotransferáza katalyzuje přenos amino skupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. Malátdehydrogenasa katalyzuje redukci oxalacetátu na L-malát za současné oxidace NADH na NAD +.Rychlost poklesu absorbance při 340 nm (úbytkem NADH) je úměrná katalytické koncentraci AST.Laktátdehydrogenáza je přidávána k zabránění interference přírodního pyruvátu v séru. Přídavek pyridoxal-5-fosfátu stabilizuje transaminázy a zabraňuje falešně nízkým hodnotám u vzorku obsahující nedostatek endogenního pyridoxal-5- fosfátu, např. pacienti s infarktem myokardu,onemocněním jater a pacienti podstupující intenzivní terapii. 21

Složení soupravy: Reagencie 1 ( R1 ) Enzymové činidlo Tris pufr ph 7,65 80 mmol/l L-aspartát 240 mmol/l Malát-dehydrogenáza > 10 µkat/l Laktát-dehydrogenáza > 15 µkat/l Reagencie 2 ( R 2 ) Substrát 2-oxoglutarát 12 mmol/l NADH 0,18 mmol/l Postup: Stanovení aktivity AST můţe probíhat dvojím způsobem. 1. Start substrátem: Reagencie R 1 a R 2 jsou připraveny k okamţitému pouţití 2. Start sérem: Reagencie je nutné smíchat v poměru 4 + 1 (4R 1 + 1R 2 ). Nepřidává se pyridoxal-5-fosfát 1. 2. Vzorek (ml) Standard (ml) Blank (ml) Vzorek (ml) Standard (ml) Blank (ml) Vzorek 0,10 0,00 0,00 Vzorek 0,10 0,00 0,00 Dest. voda 0,00 0,00 0,10 Dest. voda 0,00 0,00 0,10 Standard 0,00 0,10 0,00 Standard 0,00 0,10 0,00 R 1 1,00 1,00 1,00 R 1 +R 2 1,00 1,00 1,00 Promíchat a 5 min. inkubovat, přidat: R 2 0,25 0,25 0,25 Promíchat a po 1 min měřit absorbanci. Začít měřit čas přesně po 1, 2 a 3 minutách měřit absorbanci (A 1,A 2,A 3 ) Výpočet: C AST =( d A S /min d A bl /min) / ( d A ST /min d A bl /min) [µkat/l] Kalibrace byla provedena se standardním biologickým materiálem firmy ROCHE. Ředěním byla sestrojena kalibrační řada se vzrůstající koncentrací (tab.1,2) 22

Abs. Z naměřených hodnot sestrojena kalibrační křivka závislosti na aktivitě enzymu a stanovené průměrné absorbanci (obr.1,2) 4.2.1. Start substrátem: Tab.1 Stanovení kalib. faktoru metody AST-IFCC s P5P conc. Ast s P5P kal. ředění 5,45nkat/l A 1 - A 2 A 2 -A 3 ΔA faktor 1. 0,09 0,50 0,008 0,008 0,008 61,932 2. 0,25 1,36 0,022 0,024 0,023 59,239 3. 0,50 2,73 0,045 0,045 0,045 60,556 4. 0,67 3,63 0,057 0,063 0,060 60,556 5. 1,00 5,45 0,093 0,091 0,092 59,239 Kalibrační faktor AST s P5P ( výpočtem ) 60,30 Kalibrační faktor AST s P5P ( lin. regresí ) 59,88 A 1,A 2,A 3..........absorbance ΔA............ změna absorbance Ast s P5P 0,100 0,090 0,080 0,070 0,060 0,050 0,040 0,030 y = 0,0167x R 2 = 0,9996 0,020 0,010 0,000 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 Aktivita Ast (ukat/l) Obr.1 Kalibrační křivka metody AST-IFCC s přídavkem P5P. Vyhodnocení lin regresí 23

Abs. 4.2.2. Start sérem: Tab.2 Stanovení kalibračního faktoru metody AST-IFCC bez P5P conc. 5,45nkat/l Ast bez P5P A 1 - A 2 A 2 - A 3 ΔA kal. faktor 0,50 0,009 0,009 0,009 55,05 1,36 0,022 0,022 0,022 61,93 2,73 0,043 0,043 0,043 63,37 3,63 0,057 0,057 0,057 63,74 5,45 0,085 0,085 0,085 64,12 Kalibrační faktor AST bez P5P (výpočtem ) 61,64 Kalibrační faktor AST bez P5P (lin.regresí ) 63,69 A 1,A 2,A 3..........absorbance ΔA............ změna absorbance 0,090 Ast bez P5P 0,080 0,070 0,060 0,050 0,040 y = 0,0157x R 2 = 0,9994 0,030 0,020 0,010 0,000 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 Aktivta ast ( ukat/l ) Obr. 2 Kalibrační křivka metody AST-IFCC bez přídavku P5P.Vyhodnocena lineární regresí. 24

4.3. Princip metody (AST-Color) Aspartátaminotransferáza katalyzuje přenos amino skupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. Oxalacetát se stanoví reakcí s 2,4-dinitrofenylhydrazinem za vzniku barevného hydrazonu vhodného k fotometrickému stanovení při vln.délce 546 nm. Složení soupravy: Reagencie 1 ( R 1 ) Fosfátový pufr ph 7,4 100 mmol/l L-aspartát 100 mmol/l 2-oxoglutarát 2 mmol/l Reagencie 2 ( R 2 ) 2,4-dinitrofenylhydrazin 2 mmol/l Postup: Aktivita transaminázy v některých sérech je ovlivněna vysokou koncentrací aldehydů, ketonů nebo oxo-kyselin, provádí se měření proti reagenčnímu (1) namísto sérovému blanku (2) 1. 2. Reag. Blank (ml) vzorek (ml) Vz. Blank (ml) Vzorek (ml) Vzorek 0,00 0,10 Vzorek 0,00 0,10 R 1 0,50 0,50 R 1 0,50 0,50 Dest.voda 0,10 0,00 Promíchat a inkubovat 30 min při 37 o C Promíchat a inkubovat 30 min. při 37 o C R 2 0,50 0,50 R 2 0,50 0,50 Vzorek 0,10 0,00 Promíchat a nechat stát 20 min při 20-25 o C Promíchat a nechat stát 20min při 20-25 o C NaOH 5,00 5,00 NaOH 5,00 5,00 Promíchat a po 5 min odečíst absorbanci Promíchat a po 5 min odečíst absorbanci Kalibrace byla provedena s pyruátem, který je součástí dodávaného reagenčního setu a podle 25

Abs. aplikačního listu byly připraveny kalibrační vzorky se vzrůstající koncentrací, které odpovídají aktivitě enzymu (tab.3). Z naměřených hodnot sestrojena kalibrační křivka závislosti na koncentraci pyruvátu a stanovené absorbanci (obr.3). Tab.3 Výpočet kalibračního faktoru metody AST-color. Hodnota Hodnota kalibr. kalibr. pyruvát dest.voda R 1 Absorbance (U/l) (µkat/l) Kal.faktor 1. 0,05 0,2 0,95 0,033 11 0,18 5,56 2. 0,15 0,2 0,85 0,045 16 0,27 5,93 3. 0,25 0,2 0,75 0,075 25 0,42 5,56 4. 0,35 0,2 0,65 0,102 37 0,62 6,05 5. 0,45 0,2 0,55 0,140 52 0,87 6,19 Kalibrační faktor AST-color ( Výpočtem ) 5,86 Kalibrační faktor AST-color ( Lin.regresí ) 6,06 0,160 Ast color 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 y = 0,1649x R 2 = 0,9925 0,040 0,020 0,000 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 Aktivita Ast ukat/l Obr. 3 Kalibrační křivka metody AST-color.Vyhodnocena lineární regresí 26

4.4. Princip metody (ALT-IFCC) Alaninaminotransferáza katalyzuje přenos amino skupiny z L-alaninu na 2-oxoglutarát za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. Laktátdehydrogenáza katalyzuje redukci pyruvátu na L-laktát za současné oxidace NADH na NAD +.Rychlost poklesu absorbance při 340 nm (úbytkem NADH)je úměrná katalytické koncentraci ALT.Přídavek pyridoxal-5-fosfátu stabilizuje transaminázy a zabraňuje falešně nízkým hodnotám u vzorku obsahující nedostatek endogenního pyridoxal-5-fosfátu, např. pacienti s infarktem myokardu,onemocněním jater a pacienti podstupující intenzivní terapii. Složení soupravy: Reagencie 1 ( R 1 ) Enzymové činidlo Tris pufr ph 7,15 100 mmol/l L-alanin 500 mmol/l Laktát-dehydrogenáza > 28,3 µkat/l Reagencie 2 ( R 2 ) Substrát 2-oxoglutarát 15 mmol/l NADH 0,18 mmol/l Postup: Stanovení aktivity ALT můţe probíhat dvojím způsobem. 1. Start substrátem: Reagencie R1 a R2 jsou připravena k okamţitému pouţití 2. Start sérem: Reagencie je nutné smíchat v poměru 4 + 1 (4R 1 + 1R 2 ). 27

1. 2. Vzorek Standard Blank Vzorek Standard Blank (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) Vzorek 0,10 0,00 0,00 Vzorek 0,10 0,00 0,00 Dest. voda 0,00 0,00 0,10 Dest. voda 0,00 0,00 0,10 Standard 0,00 0,10 0,00 Standard 0,00 0,10 0,00 R 1 1,00 1,00 1,00 R 1 +R 2 1,00 1,00 1,00 Promíchat a 5 min. inkubovat, přidat: R 2 0,25 0,25 0,25 Promíchat a po 1 min měřit absorbanci. Začít měřit čas přesně po 1, 2 a 3 minutách měřit absorbanci (A 1,A 2,A 3 ) Výpočet: C ALT =( d A S /min d A bl /min) / ( d A ST /min d A bl /min) [µkat/l] Kalibrace byla provedena se standardním biologickým materiálem firmy ROCHE a z naměřených hodnot sestrojena kalibrační křivka závislosti na aktivitě enzymu a stanovené průměrné absorbanci. 28

Abs. 4.4.1 Start substrátem: Tab. 4 Stanovení kalib. faktoru metody ALT-IFCC s přídavkem P5P conc. Alt s P5P kal. ředění 6.48nkat/l A 1 -A 2 A 2 -A 3 Δ A faktor 1. 0,05 0,31 0,005 0,006 0,006 56,10 2. 0,09 0,59 0,009 0,009 0,009 65,45 3. 0,25 1,62 0,026 0,026 0,026 62,31 4. 0,50 3,24 0,050 0,048 0,049 66,12 5. 0,67 4,32 0,065 0,063 0,064 67,50 Kalibrační faktor ALT s P5P ( výpočtem ) 63,50 Kalibrační faktor ALT s P5P ( lin.regresí ) 66,66 A 1,A 2,A 3..........absorbance ΔA............ změna absorbance 0,070 Alt s P5P 0,060 0,050 0,040 0,030 y = 0,015x R 2 = 0,9983 0,020 0,010 0,000 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 Aktivita Alt ukat/l Obr.4 Kalibrační křivka metody ALT-IFCC s přídavkem P5P. Vyhodnocení lineární regresí. 29

Abs. 4.4.2. Start sérem: Tab.5 Stanovení kalibračního faktoru metody ALT-IFCC bez P5P conc. 6.48nkat/l Alt bez P5P A 1 -A 2 A 2 -A 3 Δ A kal. faktor 0,31 0,004 0,004 0,004 77,14 0,59 0,008 0,008 0,008 73,64 1,62 0,027 0,023 0,025 64,80 3,24 0,044 0,045 0,045 72,81 4,32 0,059 0,059 0,059 73,22 Kalibrační faktor ALT bez P5P ( výpočtem ) 72,32 Kalibrační faktor ALT bez P5P ( lin.regresí ) 72,46 A 1,A 2,A 3..........absorbance ΔA............ změna absorbance 0,070 Alt bez P5P 0,060 0,050 0,040 0,030 y = 0,0138x R 2 = 0,9966 0,020 0,010 0,000 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 Aktivita Alt ukat/l Obr. 5 Kalibrační křivka metody ALT-IFCC bez přídavkem P5P. Vyhodnocení lineární regresí. 30

4.5. Princip metody (ALT-Color) Alaninaminotransferáza katalyzuje přenos amino skupiny z L-alaninu na 2-oxoglutarát za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. Pyruvát se stanový reakcí s 2,4-dinitrofenylhydrazinem za vzniku barevného hydrazonu vhodného k fotometrickému stanovení při vln.délce 546 nm. Složení soupravy: Reagencie 1 ( R 1 ) Fosfátový pufr ph 7,4 100 mmol/l L-alanin 200 mmol/l 2-oxoglutarát 2 mmol/l Reagencie 2 ( R 2 ) 2,4-dinitrofenylhydrazin 2 mmol/l Postup: Aktivita transaminázy v některých sérech je ovlivněna vysokou koncentrací aldehydů, ketonů nebo oxokyselin, provádí se měření proti reagenčnímu (1) namísto sérovému blanku (2) 1. 2. Reag. Blank (ml) vzorek (ml) Vz. Blank (ml) Vzorek (ml) Vzorek 0,00 0,10 Vzorek 0,00 0,10 R 1 0,50 0,50 R 1 0,50 0,50 Dest.voda 0,10 0,00 Promíchat a inkubovat 30 min při 37 o C Promíchat a inkubovat 30 min. při 37 o C R 2 0,50 0,50 R 2 0,50 0,50 Vzorek 0,10 0,00 Promíchat a nechat stát 20 min při 20-25 o C Promíchat a nechat stát 20min při 20-25 o C NaOH 5,00 5,00 NaOH 5,00 5,00 Promíchat a po 5 min odečíst absorbanci Promíchat a po 5 min odečíst absorbanci 31

Abs. Kalibrace byla provedena s pyruátem, který je součástí dodávaného reagenčního setu a podle aplikačního listu byly připraveny kalibrační vzorky se vzrůstající koncentrací, které odpovídají aktivitě enzymu (tab.6 ).Z naměřených hodnot byla sestrojena kalibrační křivka závislosti na koncentraci pyruvátu a stanovené absorbanci (obr.6 ). Tab.6 Výpočet kalibračního faktoru metody AST-color Hodnota pyruvát dest.voda R 1 Absorbance kalibr. (U/l) Hodnota kalibr.(ukat/l Kalibr.faktor 1. 0,05 0,2 0,95 0,055 9 0,15 2,73 2. 0,15 0,2 0,85 0,158 27 0,45 2,85 3. 0,25 0,2 0,75 0,268 46 0,77 2,86 4. 0,35 0,2 0,65 0,375 67 1,12 2,98 5. 0,45 0,2 0,55 0,480 87 1,45 3,02 Kalibrační faktor ALT - color ( výpočtem ) 2,89 Kalibrační faktor ALT - color ( Lin regresí ) 2,98 Alt color. 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 y = 0,3358x R 2 = 0,9982 0,100 0,000 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 Aktivita Alt (ukat/l) Obr.6 Kalibrační křivka metody AST-color.Vyhodnocena lineární regresí 32

5. Výsledky 5.1. Porovnání naměřených hodnot Alt K porovnání bylo vybráno 20 biologických vzorků, jejichţ hodnoty pokrývají fyziologické i patologické rozmezí. Tab.7 Porovnání hodnot biologických vzorků testovanými metodami pro stanovení Alt. ALT s P5P ALT bez P5P ALT - Randox ALT ALT ALT A1 A2 A3 A1-A2 A2-A3 ΔA µkat/l A1 A2 A3 A1-A2 A2-A3 ΔA µkat/l A1 µkat/l 1 0,375 0,365 0,356 0,010 0,009 0,010 0,60 1,401 1,394 1,386 0,007 0,008 0,008 0,54 0,058 0,17 2 0,364 0,353 0,345 0,011 0,008 0,010 0,60 1,398 1,382 1,376 0,016 0,006 0,011 0,80 0,060 0,17 3 0,308 0,293 0,279 0,015 0,014 0,015 0,92 1,286 1,273 1,260 0,013 0,013 0,013 0,94 0,095 0,27 4 0,401 0,395 0,389 0,006 0,006 0,006 0,38 1,406 1,401 1,396 0,005 0,005 0,005 0,36 0,056 0,16 5 0,392 0,387 0,382 0,005 0,005 0,005 0,32 1,398 1,394 1,390 0,004 0,004 0,004 0,29 0,049 0,14 6 0,418 0,400 0,383 0,018 0,017 0,018 1,11 1,399 1,385 1,371 0,014 0,014 0,014 1,01 0,039 0,11 7 0,345 0,337 0,329 0,008 0,008 0,008 0,51 1,395 1,388 1,383 0,007 0,005 0,006 0,43 0,047 0,14 8 0,356 0,352 0,349 0,004 0,003 0,004 0,22 1,407 1,404 1,401 0,003 0,003 0,003 0,22 0,048 0,14 9 0,128 0,100 0,072 0,028 0,028 0,028 1,78 0,904 0,879 0,852 0,025 0,027 0,026 1,88 0,170 0,49 10 0,386 0,376 0,368 0,010 0,008 0,009 0,57 1,396 1,389 1,381 0,007 0,008 0,007 0,54 0,078 0,23 11 0,295 0,156 0,006 0,139 0,150 0,145 9,18 0,575 0,470 0,370 0,105 0,100 0,103 7,41 0,443 1,28 12 0,232 0,136 0,051 0,096 0,085 0,091 5,75 0,775 0,685 0,597 0,090 0,088 0,089 6,43 0,417 1,21 13 0,254 0,186 0,120 0,068 0,066 0,067 4,25 0,959 0,897 0,835 0,062 0,062 0,062 4,48 0,323 0,93 14 0,268 0,173 0,088 0,095 0,085 0,090 5,72 0,838 0,751 0,666 0,087 0,085 0,086 6,22 0,407 1,18 15 0,277 0,204 0,134 0,073 0,070 0,072 4,54 0,953 0,887 0,820 0,066 0,067 0,067 4,81 0,128 0,37 16 0,265 0,201 0,139 0,064 0,062 0,063 4,00 0,988 0,930 0,872 0,058 0,058 0,058 4,19 0,294 0,85 17 0,317 0,236 0,160 0,081 0,076 0,079 4,98 1,002 0,936 0,870 0,066 0,066 0,066 4,77 0,319 0,92 18 0,463 0,444 0,425 0,019 0,019 0,019 1,21 1,384 1,369 1,352 0,015 0,017 0,016 1,16 0,108 0,31 19 0,385 0,347 0,310 0,038 0,037 0,038 2,38 1,253 1,223 1,192 0,030 0,031 0,031 2,21 0,173 0,50 20. 0,191 0,094 0,004 0,097 0,090 0,094 5,94 0,738 0,652 0,567 0,086 0,085 0,086 6,18 0,400 1,16 Všechny tři testované metody jsou schopny rozlišit vzorek s patologickými a fyziologickými hodnotami. 33

Nelze však numericky srovnávat hodnoty získané stanovením metodou ALT-color a ALT-IFCC. Pro srovnání můţeme hodnotit pouze tendenci zvyšování, či sniţování měřených hodnot. 5.2. Porovnání naměřených hodnot Ast K porovnání bylo vybráno 20 biologických vzorků, jejichţ hodnoty pokrývají fyziologické i patologické rozmezí. Tab.8 Porovnání hodnot biologických vzorků testovanými metodami pro stanovení Ast AST s P5P AST bez P5P AST - Randox AST AST AST A1 A2 A3 A1-A2 A2-A3 ΔA (ukat/l) A1 A2 A3 A1-A2 A2-A3 ΔA (µkat/l) A1 (µkat/l) 1 0,415 0,407 0,400 0,008 0,007 0,007 0,45 1,381 1,376 1,370 0,005 0,006 0,005 0,34 0,018 0,11 2 0,399 0,380 0,362 0,019 0,018 0,019 1,12 1,319 1,305 1,291 0,014 0,014 0,014 0,86 0,038 0,22 3 0,237 0,205 0,173 0,032 0,032 0,032 1,93 1,146 1,119 1,092 0,027 0,027 0,027 1,66 0,078 0,46 4 0,393 0,379 0,366 0,014 0,013 0,014 0,81 1,330 1,321 1,311 0,009 0,010 0,010 0,59 0,035 0,21 5 0,384 0,375 0,367 0,009 0,008 0,009 0,51 1,341 1,335 1,333 0,006 0,002 0,004 0,25 0,020 0,12 6 0,424 0,401 0,379 0,023 0,022 0,023 1,36 1,319 1,302 1,286 0,017 0,016 0,017 1,02 0,052 0,30 7 0,387 0,376 0,366 0,011 0,010 0,011 0,63 1,345 1,338 1,331 0,007 0,007 0,007 0,43 0,022 0,13 8 0,356 0,347 0,337 0,009 0,010 0,009 0,57 1,353 1,347 1,342 0,006 0,005 0,005 0,34 0,021 0,12 9 0,151 0,115 0,077 0,036 0,038 0,037 2,23 0,830 0,798 0,766 0,032 0,032 0,032 1,97 0,081 0,47 10 0,389 0,383 0,377 0,006 0,006 0,006 0,36 1,378 1,375 1,370 0,003 0,005 0,004 0,25 0,017 0,10 11 0,178 0,089 0,001 0,089 0,088 0,089 5,34 0,721 0,642 0,563 0,079 0,079 0,079 4,87 0,139 0,81 12 0,240 0,159 0,078 0,081 0,081 0,081 4,88 0,854 0,782 0,711 0,072 0,071 0,072 4,41 0,134 0,79 13 0,273 0,231 0,191 0,042 0,040 0,041 2,47 1,075 1,038 1,001 0,037 0,037 0,037 2,28 0,047 0,28 14 0,311 0,258 0,206 0,053 0,052 0,053 3,17 1,055 1,006 0,958 0,049 0,048 0,049 2,99 0,105 0,62 15 0,283 0,235 0,189 0,048 0,046 0,047 2,83 1,069 1,027 0,984 0,042 0,043 0,043 2,62 0,100 0,59 16 0,283 0,247 0,211 0,036 0,036 0,036 2,17 1,120 1,087 1,055 0,033 0,032 0,033 2,00 0,082 0,48 17 0,310 0,228 0,147 0,082 0,081 0,082 4,91 0,921 0,852 0,783 0,069 0,069 0,069 4,25 0,135 0,79 18 0,422 0,357 0,293 0,065 0,064 0,065 3,89 1,108 1,059 1,010 0,049 0,049 0,049 3,02 0,105 0,62 19 0,383 0,343 0,305 0,040 0,038 0,039 2,35 1,198 1,168 1,138 0,030 0,030 0,030 1,85 0,079 0,46 20 0,217 0,114 0,019 0,103 0,095 0,099 5,97 0,685 0,599 0,514 0,086 0,085 0,086 5,27 0,142 0,83 34

Všechny tři testované metody jsou schopny rozlišit vzorek s patologickými a fyziologickými hodnotami. Nelze však numericky srovnávat hodnoty získané stanovením metodou AST-color a AST-IFCC. Pro srovnání můţeme hodnotit pouze tendenci zvyšování, či sniţování měřených hodnot. 35

5.3. Měření správnosti a přesnosti metod pro stanovení Alt Tab.9 Stanovení základních statistických údajů metody ALT-IFCC Alt s P5P Alt bez P5P Precinorm U (0,71µkat/l) Precipath U (2,27 µkat/l) Precinorm U (0,68 µkat/l) Precipath U (2,17 ukat/l) X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 1 0,74 0,000009 2,43 0,000132 0,67 0,000025 2,29 0,000056 2 0,74 0,000009 2,44 0,000002 0,66 0,000025 2,30 0,000006 3 0,74 0,000009 2,43 0,000132 0,66 0,000025 2,31 0,000156 4 0,74 0,000009 2,44 0,000002 0,66 0,000025 2,29 0,000056 5 0,74 0,000009 2,45 0,000072 0,67 0,000025 2,30 0,000006 6 0,75 0,000049 2,45 0,000072 0,66 0,000025 2,29 0,000056 7 0,73 0,000169 2,45 0,000072 0,67 0,000025 2,29 0,000056 8 0,75 0,000049 2,43 0,000132 0,65 0,000225 2,31 0,000156 9 0,73 0,000169 2,45 0,000072 0,66 0,000025 2,31 0,000156 10 0,74 0,000009 2,44 0,000002 0,67 0,000025 2,30 0,000006 11 0,75 0,000049 2,45 0,000072 0,67 0,000025 2,29 0,000056 12 0,74 0,000009 2,44 0,000002 0,67 0,000025 2,31 0,000156 13 0,75 0,000049 2,44 0,000002 0,67 0,000025 2,31 0,000156 14 0,75 0,000049 2,43 0,000132 0,66 0,000025 2,28 0,000306 15 0,76 0,000289 2,45 0,000072 0,66 0,000025 2,29 0,000056 16 0,74 0,000009 2,45 0,000072 0,66 0,000025 2,30 0,000006 17 0,74 0,000009 2,44 0,000002 0,67 0,000025 2,29 0,000056 18 0,75 0,000049 2,45 0,000072 0,67 0,000025 2,30 0,000006 19 0,74 0,000009 2,43 0,000132 0,68 0,000225 2,30 0,000006 20 0,74 0,000009 2,44 0,000002 0,66 0,000025 2,29 0,000056 Prům. 0,74 0,001020 2,44 0,001255 0,67 0,000900 2,30 0,001575 SD 0,007327 0,008127 0,006882 0,009105 VK 0,009861 0,003329 0,010350 0,003963 VK(%) 0,986131 0,332880 1,034958 0,396285 BIAS (%) 1,031965 0,358030 1,012128 0,419569 Základní statistické údaje (SD, VK, BIAS) vycházejí s velmi dobrými výsledky a lze prohlásit, ţe obě tyto metody jsou dostatečně přesné a správné. 36

Tab.10 Stanovení základních statistických údajů metody ALT-color. Alt color Precinorm U Precipath U X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 1. 0,17 0,000347 0,58 0,000184 2. 0,18 0,000094 0,60 0,000019 3. 0,17 0,000467 0,60 0,000019 4. 0,21 0,000200 0,58 0,000112 5. 0,20 0,000027 0,60 0,000053 6. 0,19 0,000001 0,59 0,000058 7. 0,17 0,000347 0,62 0,000493 8. 0,20 0,000125 0,56 0,001399 9. 0,20 0,000027 0,60 0,000106 10. 0,17 0,000467 0,58 0,000184 11. 0,21 0,000294 0,64 0,001854 12. 0,21 0,000533 0,64 0,001854 13. 0,22 0,000680 0,54 0,003394 14. 0,18 0,000045 0,57 0,000810 15. 0,20 0,000027 0,59 0,000021 16. 0,18 0,000160 0,60 0,000053 17. 0,20 0,000027 0,55 0,002432 18. 0,20 0,000067 0,60 0,000106 19. 0,20 0,000125 0,61 0,000264 20. 0,17 0,000467 0,65 0,003023 Prům.(X 2 ) 0,19 0,004527 0,59 0,016437 SD 0,015435 0,029413 VK 0,080617 0,049462 VK(%) 8,061738 4,946167 BIAS (%) V tomto případě (SD, VK) vychází v nepřijatelných tolerancích a tato metoda je zatíţena poměrně velkým rozptylem. Hodnota BIAS nemohla být stanovena, pro nedostupnost definovaných hodnot v standardním materiálu. 37

5.4. Měření správnosti a přesnosti metod pro stanovení Ast Tab.11 Stanovení základních statistických údajů metody ALT-IFCC Ast s P5P Ast bez P5P Precinorm U ( 0,89 µkat/l ) Precipath U ( 2,62 µkat/l ) Precinorm U ( 0,71 µkat/l ) Precipath U ( 2,25 µkat/l ) X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 1. 0,91 0,0000122 2,32 0,0000123 0,70 0,0000640 1,88 0,0000022 2. 0,90 0,0000423 2,31 0,0001823 0,70 0,0000640 1,88 0,0000022 3. 0,91 0,0000122 2,32 0,0000123 0,69 0,0000040 1,88 0,0000022 4. 0,92 0,0001822 2,31 0,0001823 0,70 0,0000640 1,89 0,0000723 5. 0,91 0,0000122 2,33 0,0000422 0,70 0,0000640 1,88 0,0000022 6. 0,90 0,0000423 2,33 0,0000422 0,65 0,0017640 1,89 0,0000723 7. 0,90 0,0000423 2,32 0,0000123 0,70 0,0000640 1,89 0,0000723 8. 0,91 0,0000122 2,32 0,0000123 0,69 0,0000040 1,87 0,0001322 9. 0,90 0,0000423 2,32 0,0000123 0,69 0,0000040 1,87 0,0001322 10. 0,91 0,0000122 2,32 0,0000123 0,69 0,0000040 1,89 0,0000723 11. 0,90 0,0000423 2,32 0,0000123 0,69 0,0000040 1,89 0,0000723 12. 0,91 0,0000122 2,33 0,0000422 0,69 0,0000040 1,88 0,0000022 13. 0,90 0,0000423 2,32 0,0000123 0,70 0,0000640 1,88 0,0000022 14. 0,91 0,0000122 2,32 0,0000123 0,70 0,0000640 1,89 0,0000723 15. 0,90 0,0000423 2,34 0,0002722 0,68 0,0001440 1,88 0,0000022 16. 0,91 0,0000122 2,33 0,0000422 0,69 0,0000040 1,88 0,0000022 17. 0,90 0,0000423 2,32 0,0000123 0,69 0,0000040 1,89 0,0000723 18. 0,91 0,0000122 2,32 0,0000123 0,70 0,0000640 1,87 0,0001322 19. 0,91 0,0000122 2,34 0,0002722 0,70 0,0000640 1,87 0,0001322 20. 0,91 0,0000122 2,33 0,0000422 0,69 0,0000040 1,88 0,0000022 Prům. 0,91 0,0006550 2,32 0,0012550 0,69 0,0025200 1,88 0,0010550 SD 0,0058714 0,0081273 0,0115166 0,0074516 VK 0,0064770 0,0034979 0,0166425 0,0039605 VK(%) 0,6477032 0,3497860 1,6642454 0,3960456 BIAS (%) 0,6597112 0,3102014 1,6220533 0,3311821 Základní statistické údaje (SD, VK, BIAS) vycházejí s velmi dobrými výsledky a lze prohlásit, ţe obě tyto metody jsou dostatečně přesné a správné. 38

Tab.12 Stanovení základních statistických údajů metody AST-color. Precinorm U Precipath U X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 X 1 ( X 1 - X 2 ) 2 1. 0,26 0,000309 0,77 0,009578 2. 0,25 0,000309 0,82 0,001877 3. 0,27 0,000309 0,78 0,007353 4. 0,28 0,000309 0,76 0,012098 5. 0,30 0,000309 0,79 0,006350 6. 0,24 0,000309 0,71 0,025112 7. 0,27 0,000309 0,72 0,023229 8. 0,36 0,000309 0,79 0,006350 9. 0,27 0,000309 0,76 0,012098 10. 0,28 0,000309 0,74 0,016427 11. 0,27 0,000309 0,99 0,014470 12. 0,25 0,000309 0,91 0,001723 13. 0,32 0,000309 1,06 0,037253 14. 0,30 0,000309 0,96 0,009226 15. 0,28 0,000309 0,95 0,006064 16. 0,25 0,000309 0,95 0,007044 17. 0,30 0,000309 0,98 0,013049 18. 0,27 0,000309 1,03 0,026475 19. 0,23 0,000309 0,95 0,006064 20. 0,29 0,000309 0,95 0,006064 Prům.(X 2 ) 0,28 0,006177 0,87 0,247904 SD 0,018031 0,114226 VK 0,064822 0,131674 VK(%) 6,482216 13,167442 BIAS (%) V tomto případě (SD, VK) vychází v nepřijatelných tolerancích a tato metoda je zatíţena poměrně velkým rozptylem. Hodnota BIAS nemohla být stanovena, pro nedostupnost definovaných hodnot v standardním materiálu. 39

Alt bez P5P 5.5. Porovnání testovaných metod metodou lineární regrese. Tab.13 Naměřené hodnoty biologických vzorků metodou ALT-IFCC s P5P a bez P5P. ALT s P5P / ALT bez P5P 0,60 0,54 0,60 0,80 0,92 0,94 0,38 0,36 0,32 0,29 1,11 1,01 0,51 0,43 0,22 0,22 1,78 1,88 0,57 0,54 9,18 7,41 5,75 6,43 4,25 4,48 5,72 6,22 4,54 4,81 4,00 4,19 4,98 4,77 1,21 1,16 2,38 2,21 5,94 6,18 Lin.regrese ALT-IFCC 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 y = 0,977x R 2 = 0,966 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Alt s P5P 40

ASt bez P5P P5P Obr.7 Srovnání metody ALT-IFCC bez P5P a s P5P metodou lineární regrese. Tab.14 Naměřené hodnoty biologických vzorků metodou AST-IFCC s P5P a bez P5P AST / AST s P5P 0,45 0,34 1,12 0,86 1,93 1,66 0,81 0,59 0,51 0,25 1,36 1,02 0,63 0,43 0,57 0,34 2,23 1,97 0,36 0,25 5,34 4,87 4,88 4,41 2,47 2,28 3,17 2,99 2,83 2,62 2,17 2,00 4,91 4,25 3,89 3,02 2,35 1,85 5,97 5,27 6,00 Lin.regrese AST-IFCC 5,00 4,00 3,00 y = 0,8785x R 2 = 0,9903 2,00 1,00 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Ast s P5P Obr.8 Srovnání metody AST-IFCC bez P5P a s P5P metodou lineární regrese. 41

ALT color color Tab.15 Naměřené hodnoty biologických vzorků metodou ALT-IFCC s P5P a metodou ALT-color ALT/ALT color 0,60 0,17 0,60 0,17 0,92 0,27 0,38 0,16 0,32 0,14 1,11 0,11 0,51 0,14 0,22 0,14 1,78 0,49 0,57 0,23 9,18 1,28 5,75 1,21 4,25 0,93 5,72 1,18 4,54 0,37 4,00 0,85 4,98 0,92 1,21 0,31 2,38 0,50 5,94 1,16 1,80 Lin regrese Alt/Alt color 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 y = 0,1769x R 2 = 0,8424 0,60 0,40 0,20 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Alt s P5P Obr.9 Srovnání metody ALT-IFCC s P5P a ALT-color metodou lineární regrese 42

Ast color color Tab.16 Naměřené hodnoty biologických vzorků metodou AST-IFCC s P5P a metodou AST-color AST/ASTcolor 0,45 0,11 1,12 0,22 1,93 0,46 0,81 0,21 0,51 0,12 1,36 0,3 0,63 0,13 0,57 0,12 2,33 0,47 0,36 0,1 5,34 0,81 4,88 0,79 2,47 0,28 3,17 0,62 2,83 0,59 2,17 0,48 4,91 0,79 3,99 0,62 2,35 0,46 5,97 0,83 1,2 Lin regrese Ast/Ast color 1 0,8 0,6 y = 0,1644x R 2 = 0,8934 0,4 0,2 0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Ast s P5P Obr.10 Srovnání metody AST-IFCC s P5P a AST-color metodou lineární regrese 43

5.6. Vliv hemolýzy na stanovení transamináz. Jak jiţ bylo v teoretické části uvedeno Alt je především cytosolickým enzymem, proto se zvýšená aktivita projevuje jiţ při malém poškození buňky a Ast je enzymem cytosolickým, ale i mitochondriálním. Aktivita enzymu pak narůstá především při větším poškození buňky. Hemolýza je jev, kdy jsou porušeny nevratným způsobem krevní buňky (erytrocyty) a obsah buněk je uvolněn do extracelulární tekutiny. Narůstají hodnoty některých minerálů, hemoglobinu i enzymů. Vliv hemolýzy by proto měl být patrnější u stanovení aktivity Ast. V praxi je potom velmi dobré vědět míru vlivu interference hemolytických vzorků na stanovení aktivity tohoto enzymu. Vzorky byly připraveny laboratorně. Nejprve byla připravena suspenze erytrocytů ve fyziologickém roztoku, vymyta veškera rezidua způsobená přítomností séra a dále po proběhlé centrifugaci a odsátí fyziologického roztoku byla přidána destilovaná voda a vzorek hluboce zamraţen na -50 o C. Destilovaná voda způsobila změnu izotonického prostředí na hypotonické. V hypotonickém prostředí dochází ke vnikáni vody do buňky a nízkými teplotami došlo k rozrušení buněčných elementů. Po opětovném rozpuštění došlo opět k centrifugaci a odstranění buněčných zbytků. Takto připravený hemolyzát byl rozpipetován do shodného vzorku a změřena hodnota hemoglobinu. Následně provedeno stanovení na aktivitu transamináz. 44

Tab.17 Vliv hemolýzy na stanovení aktivity Alt a Ast Hb ( g/l ) Alt s P5P Alt bez P5P Alt color Ast s P5P Ast bez P5P Ast color 0,00 0,42 0,36 0,12 0,47 0,35 0,24 1,01 0,42 0,36 0,13 0,57 0,43 0,26 1,91 0,41 0,37 0,12 0,68 0,51 0,27 2,75 0,44 0,37 0,12 0,79 0,59 0,35 3,53 0,41 0,37 0,13 0,88 0,66 0,36 4,46 0,43 0,39 0,13 1,00 0,74 0,42 5,13 0,43 0,40 0,13 1,09 0,81 0,45 6,07 0,46 0,40 0,13 1,20 0,90 0,48 6,94 0,46 0,40 0,15 1,32 0,98 0,52 7,91 0,46 0,42 0,15 1,42 1,04 0,56 8,60 0,50 0,41 0,14 1,50 1,12 0,62 Jak je patrno z tabulky 17. u stanovení Ast se signifikantně projevuje vliv hemolýzy uţ při nízkých hodnotách Hb v séru. Při masivní hemolýze nabývá hodnot jiţ trojnásobných vzhledem k hodnotě základní. Tato interference byla potvrzena všemi testovanými metodami. 5.7. Vliv aldehydů na stanovení transamináz. Metoda od firmy Randox na stanovení transamináz je zakončena reakcí 2,4,-difenylhydrazinu s příslušnou oxokyselinou (oxalacetátem nebo privátem) za vzniku barevného hydrazonu. Stejnou reakci mohou poskytovat aldehydy. Můţe tedy docházet k falešné pozitivitě. V následujícím testu jsem se zaměřil na vliv glukózy jakoţto interferující látky, při stanovení Alt a Ast. Tato moţná interference můţe být eliminována odečítáním absorbance vzorku proti vzorkovému blanku. 45

Tab.18 Interference glukosy při stanovení aktivity Alt a Ast metodikou firmy Randox Interf.gluk (mmol/l ) Alt Ast Sampl blank Sampl Reag.blank blank Reag.blank Abs Abs Abs Abs 5,8 0,036 0,081 0,045 0,087 11,8 0,034 0,077 0,044 0,091 18,7 0,034 0,078 0,042 0,090 23,6 0,035 0,075 0,043 0,092 29,2 0,033 0,076 0,045 0,085 33,0 0,032 0,080 0,040 0,087 36,6 0,034 0,077 0,043 0,085 39,5 0,032 0,076 0,042 0,087 43,2 0,035 0,074 0,044 0,088 45,2 0,030 0,073 0,041 0,089 Testem nebyla prokázána interference glukózy při stanovení Ast a Alt v uvedeném rozmezí koncentrace glukózy. 46