Pohledy do Mikrosvěta doc. RNDr. František Lednický, CSc. Ústav makromolekulární chemie Akademie věd ČR ledn@imc.cas.cz Abstrakt Na příkladech převážně z oblasti polymerních materiálů je v presentované práci stručně uveden přehled možností mikroskopických technik, mikroskopických preparací, metod zobrazení a výsledků. 1. Úvod Svět kolem nás, předměty a okolí se kterými se pravidelně setkáváme, vnímáme obvykle jako samozřejmost, aniž bychom o nich podrobněji uvažovali. Dům, ve kterém bydlíme, nám slouží, krajina, kde žijeme, se mění rychleji podle ročních období či pomaleji podle zásahů, které do ní udělá člověk. Nářadí a nástroje, které potřebujeme k práci nebo využíváme ve svém volném čase, považujeme za dobré nebo méně dobré podle toho, do jaké míry jsou nám užitečné. S okolním světem komunikujeme tak, že se jej dotýkáme nebo pozorujeme. Můžeme říci, že pokud k této komunikaci nepotřebujeme speciální prostředky, pak to, co vnímáme je makrosvět. Každá jeho součást, ať jde o část živou nebo neživou, má svoje vlastní složení, strukturu, která odpovídá její funkci. Sledujeme-li strukturní elementy světa o tak malých rozměrech, že je už nejsme schopni sledovat neozbrojeným okem, mluvíme o mikrosvětě. Hledáme-li společné rysy makro- a mikrosvěta, nenajdeme jich mnoho. Důležitým společným rysem však je vnitřní struktura, tedy uspořádání na různých úrovních jak v makrosvětě, tak i ve světě mikroskopických rozměrů. Například zdi domů jsou sestaveny z cihel (či jiných konstrukčních prvků), živá hmota z buněk, neživé hmoty mohou mít
krystalickou skladbu či mohou být tvořeny směsí adherujících drobných částic různého původu a různých vlastností. Můžeme nalézt překvapivou analogii ve vnitřní stavbě složitých konstrukcí a běžných přírodních útvarů. (Příkladem může být dokonalá příhradová konstrukce obilného stébla, tvořená mikrotrubicemi různých průměrů uspořádaných ve svazcích a vyztuženými příčným dělením, zvyšujícím jejich tuhost. Porovnáme-li pak obyčejné pšeničné stéblo s dosud nejvyšší volně stojící strukturou vytvořenou člověkem, 553 m vysokou komunikační věží společnosti CN v Torontu, dojdeme k překvapivému zjištění, že stéblo o stejné výšce jako zmíněná věž by měla u země průměr pouhých 6 metrů.) Zjednodušíme-li vztah člověka k poznání a využití okolního světa a omezíme-li se nadále na oblast materiálů a materiálového výzkumu, můžeme říci, že člověk si klade dvě základní otázky: JAK a PROČ. Jak vyrobit materiál, díl či výrobek, jak snížit náklady, jak zvýšit rychlost produkce, jak nahradit drahý materiál, jak zvýšit kvalitu, jak odstranit vady. Odpověď na tyto otázky je většinou úkolem výrobní sféry. Odpovědi na otázku Proč většinou hledáme v akademické sféře. Jde o pochopení stavby hmoty, struktury materiálu a ovlivnění jeho vlastností. Zde je pak přímá souvislost s pohledy do mikrosvěta, tam hledáme odpovědi. Jaké máme možnosti do mikrosvěta nahlížet? Je celá řada technik, které se vztahují k vlastnostem a chování materiálů na úrovních atomární, molekulární a nadmolekulární. Zde si pouze velmi stručně všimneme technik mikroskopických. Tyto techniky poskytují přímý pohled (zprostředkovaný mikroskopickým zařízením) na rozložení strukturních útvarů ve sledovaném objektu. Výsledkem je obraz. Je zřejmé, že k dosažení tohoto pohledu je nutno také vhodným způsobem připravit preparát, který pak zobrazovací zařízení (mikroskop) je schopno zpracovat, aby struktura byla zřejmá. (Například tlustý preparát není možno zobrazit prozařovací technikou, průhledný preparát se obtížně zobrazuje technikami využívajícími odraz záření, vnitřek nepřístupného vzorku je třeba odkrýt vhodnou preparační technikou.) 2. Mikroskopické techniky Mikroskopické zobrazovací techniky můžeme podle způsobu vytváření obrazu rozdělit do dvou základních skupin. Všeobecně známé jsou mikroskopické techniky, u nichž se obraz vytváří pomocí čoček. Typickými příklady jsou světelná a transmisní (prozařovací) elektronová mikroskopie. Druhý typ zobrazovacích zařízení jsou rastrovací či skanovací mikroskopy, u nichž se preparát prohlíží bod po bodu a celkový obraz vzniká složením jednotlivých bodů, tedy složením signálů, které získáme odezvou na interakci buzení.
Typickými příklady jsou rastrovací (skanovací) elektronová mikroskopie a mikroskopické techniky známé pod názvem mikroskopie rastrovací sondou, z nichž snad nejznámější jsou mikroskopie atomárních sil a tunelovaní rastrovací mikroskopie. Rozvoj mikroskopických technik v posledních desetiletích pokročil velmi rychle a v současné době existuje řada takových, které oba tyto způsoby kombinují, tedy kdy zařízení obsahuje zobrazovací čočky a obraz vzniká čtením preparátu bod po bodu. Jako příklady můžeme uvést světelnou konfokální mikroskopii, mikroskopii blízkého pole, či rastrovací transmisní elektronovou mikroskopii. Každá z mikroskopických technik má své přednosti i nedostatky. To platí pro techniky jak zobrazovací, tak i preparační. Je proto na jejich uživatelích, aby zvolili takovou (takové), která poskytne ty informace, které o vzorku získat potřebujeme. U mikroskopů, kde se obraz vytváří pomocí čoček, je celý pozorovaný preparát použitým zářením osvětlován současně. Záření difraktované preparátem se zpracovává zobrazovací soustavou a výsledkem je skutečný obraz na záznamovém médiu (matnici, filmu, fluorescenčním stínítku, fotografické desce nebo v současné době nejčastěji digitální pomocí kamery). U skanovacích mikroskopů se pro čtení preparátu využívá různých typů sond. U rastrovacího elektronového mikroskopu je to elektronový svazek, generovaný elektronovým dělem podobně jako u transmisního elektronového mikroskopu, avšak soustředěný do co nejmenší plochy, je možno říci do bodu. Nejlepší možné rozlišení pak závisí na rozměru tohoto bodu. Interakcí elektronového svazku s preparátem vzniká celá řada signálů, za všechny uveďme jen zpětně odražené elektrony, sekundární elektrony a záření X. Každý ze signálů je možno využít k získání obrazu a každý takový obraz pak vypovídá o vzorku poněkud jiným způsobem. Zobrazení s použitím sekundárních elektronů má nejlepší rozlišení a používá se hlavně k získání informace o povrchové topografii (povrchovém reliéfu) zobrazovaného vzorku. Zobrazení získané detekcí zpětně odražených elektronů nesou rovněž informace o materiálovém složení vzorku v daném místě, má však nižší rozlišení, neboť detekovaný signál vzniká ve větším objemu kolem dopadajícího svazku. Ze záření X vzniklého dopadem elektronového svazku na preparát se využívá jeho charakteristická složka, tj. charakteristické záření X. Takto je možno ve zvoleném místě preparátu stanovit jeho chemické složení, nebo se dá vytvořit obraz rozložení zvoleného prvku na preparátu. Tento způsob prvkové mikroanalýzy je velmi důležitým a velmi využívaným nástrojem v materiálovém výzkumu.
Zvolený signál (sekundární elektrony, zpětně odražené elektrony a další) se detekuje vhodným detektorem a po elektronickém zpracování se zobrazí na televizní obrazovce jako světlý bod, jehož intenzita je úměrná intenzitě detektovaného signálu. Synchronizací pohybu elektronového svazku po preparátu a odpovídajícího bodu na monitoru vznikne obraz, jehož zvětšení se dá měnit změnou velikosti ozářené oblasti. Jako sondy pro čtení obrazu lze použít velmi tenkého hrotu. To je způsob využívaný u mikroskopie rastrovací sondou (SPM scanning probe microscopy). Velmi tenký hrot, jehož pohyb ve všech směrech je ovládán piezoelektrickými krystaly, interaguje s povrchem vzorku tak, že je možno zvolit způsob této interakce, totiž přímý dotyk, pohyb v určité (malé) vzdálenosti od povrchu či tlak hrotu na povrch vzorku podle atomárních sil mezi krystalovým hrotem a povrchem vzorku. Toto je podstata metody mikroskopie atomárních sil (AFM atomic force microscopy), používané pro nevodivé vzorky. Souřadnice poloh hrotu jsou zaznamenány počítačem a z těchto souřadnic se pak rekonstruuje obraz vzorku. Pro vodivý vzorek je navíc možná volba pohybu hrotu ve vzdálenosti od povrchu, která je určována zvoleným proudem procházejícím mezi hrotem a vzorkem (tunelovacím proudem, odtud tunelovací mikroskopie, STM scanning tunneling microscopy). Jako u každé mikroskopické metody, i zde je možnost její aplikace omezena na relativně hladké a rovné povrchy, avšak její předností je extrémní rozlišovací schopnost, která může dosahovat až rozlišitelnosti jednotlivých atomů. Jiný způsob zobrazení rastrovací technikou, řazený také mezi techniky SPM, je mikroskopie blízkého pole (near-field scanning optical microscopy NSOM). Využívá jako čtecí sondy velmi tenký světelný paprsek, který je do velmi těsné blízkosti povrchu vzorku přiveden tenkým světlovodivým vláknem. Pohyb vlákna je opět řízen piezoelektrickými krystaly a obraz se opět skládá ze signálů získaných ozářením jednotlivých bodů preparátu. Předností této složité techniky je lepší rozlišení, než dovoluje klasická zobrazovací světelná mikroskopie. Mikroskopické techniky musíme rozlišovat podle možností zobrazování jednotlivých typů preparátů tedy vlastně podle typu informace, které o studovaném objektu potřebujeme získat. Buďto potřebujeme získat informace o povrchu preparátu, nebo o jeho vnit ku. ř Zdálo by se, že shora uvedené dělení mikroskopických technik už toto rozlišení poskytuje, ale není tomu tak zcela úplně. Existují zde překryvy: světelná mikroskopie dovoluje pozorování světla odraženého od povrchu preparátu, rastrovací elektronová mikroskopie umožňuje (s příslušnou instrumentací) analyzovat prvkové složení preparátu v poměrně velkém objemu.
3. Zvětšení a rozlišení možnosti mikroskopických technik Rozhodujícím parametrem každého mikroskopu není maximální dosažitelné zvětšení, ale rozlišovací schopnost. Ta vyjadřuje nejmenší rozlišitelnou vzdálenost detailů objektu. Zvětšení mikroskopického zařízení je většinou přizpůsobeno tomu, abychom požadovaného rozlišení mohli dosáhnout. Často se ale setkáváme s případem, kdy je použité zvětšení větší, než zvětšení užitečné. Pak ovšem nedokážeme rozlišit jemnější detaily, než odpovídá možnému rozlišení. (Příkladem může být promítání snímku na projekční plátno, kdy zvětšený obraz převyšuje originální fotografii třeba dvacetkrát, přesto jemnějšího rozlišení nelze dosáhnout.) Proto také uvádění zvětšení u snímků obvykle nemá smyslu, jediným možným údajem je připojené měřítko. Možnosti rozlišení jednotlivých mikroskopických technik jsou uvedeny v Tab. I. Tab. I. Rozlišovací schopnosti mikroskopických technik Mikroskopická technika Dosažitelné rozlišení (Neozbrojené oko) 0,1 mm Světelná mikroskopie 0,2 µm Mikroskopie blízkého pole 50 nm Transmisní elektronová mikroskopie nad 0,1 nm Rastrovací elektronová mikroskopie nad cca 2 až 3 nm Mikroskopie rastrovací sondou atomární, kolem 0,1 nm Hodnoty uvedené v Tab. I udávají meze, které jsou dosažitelné s použitím dané mikroskopické techniky. V aktuální situaci musíme však brát ohled na dva faktory: na modifikaci použité techniky (nap ř. na použitý objektiv při světelné mikroskopii: mezního rozlišení dosáhneme pouze s nejlepším objektivem při maximálním zvětšení a obvykle jen při použití imersní techniky) a zejména na možnosti, které poskytuje použitá preparační technika a vlastnosti preparátu. (U prozařovacích technik by pozorované strukturní jednotky měly být souměřitelné s tloušťkou preparátu. Prozáření tlustšího preparátu obsahujícího strukturní jednotky mnohem tenčí, než je preparát, způsobuje překrývání strukturních jednotek a tak zamlží získávanou informaci.) Při rozhodování o použití typu mikroskopu k zviditelnění sledovaného objektu přihlížíme kromě rozlišovací schopnosti obvykle také k dalším parametrům jako jsou hloubka
ostrosti zobrazení, způsob pozorování, typ a příprava vzorků, možnosti zpracování obrazu atd. Odlišnosti a technické parametry jednotlivých mikroskopických metod ukazují na to, že jejich možnosti jsou spíše komplementární než konkurenční. 4. Příprava preparátu možnosti preparačních technik Pohled do mikrosvěta musí v prvé řadě respektovat základní cíl: získat informace o objektu, které potřebujeme, tedy ty, které pomáhají vysvětlit jeho charakter, funkci, strukturu, korelaci s jinými naměřenými či pozorovanými vlastnostmi. Příprava preparátu pak musí v první řadě k tomuto cíli napomáhat. Studované objekty mají nejrůznější charakter. Mohou to být tlusté objekty (bloky), tenké filmy, vlákna, malé samostatné částice (prášky), či disperze. Neexistuje obecné pravidlo, které jednoznačně předpisuje, jak se mají jednotlivé preparáty pro mikroskopické studium připravit. Pro jednotlivé zobrazovací techniky však z charakteru zobrazení vyplývají možné způsoby téměř jednoznačně. U prozařovacích technik musíme respektovat tloušťku preparátu. U prozařovací světelné mikroskopie je to uložení na podložním sklíčku a obvykle pod krycím sklem, tloušťka preparátu podle propustnosti, obvykle v jednotkách až maximálně několika málo desítkách mikrometrů. U prozařovací elektronové mikroskopie je celková tloušťka preparátu omezena na tloušťku do asi jednoho sta nanometrů (0,1 µm), nejlépe ještě menší. Namísto podložního skla můžeme použít tenký napařený uhlíkový film, který i s preparátem nepřesahuje tuto tloušťku. Uložení preparátu na nosné síťce s mikroskopickými otvory je tak nutností (celkový průměr síťky 3 mm, typický počet otvorů v síťce může být kolem tisíce), pozorovat objekt je možné jen v oblastech otvorů v síťce. U technik zobrazujících povrch musíme respektovat skutečnost, že pozorujeme převážně jen tento povrch. U takového preparátu většinou nezáleží na velikosti objektu, omezením je jen velikost pracovního prostoru mikroskopického zařízení; velikost preparátu se pak dá snadno upravit seříznutím či odříznutím nedůležitých částí objektu. Někdy je třeba pamatovat na zajištění dostatečné rovinnosti objektu (např. u mikroskopie atomárních sil, nebo vzhledem k malé hloubce ostrosti u světelné odrazové mikroskopie). Preparace práškových materiálů, disperzí, nebo dostatečně tenkých filmů je nejjednodušší ze všech preparačních technik. Stačí je nanést na patřičnou podložku. Avšak pro prozařovací elektronovou mikroskopii může i toto být dosti obtížný problém.
U objemnějších objektů (bloků) je často třeba odkrýt strukturu vnitřku. Zde pak máme v zásadě tři možnosti preparace: řez, lom, nebo lept. Příprava tenkých řezů pro světelnou mikroskopii nebo ultratenkých řezů pro prozařovací elektronovou mikroskopii je samostatnou a poměrně obtížnou problematikou. Menší objekty, zvláště nepravidelné, je často třeba uzpůsobit pro řezání tím, že se zalijí do pryskyřice o vhodných vlastnostech. Ultratenké řezy 2 (tlusté kolem 50 nm) zahrnují plochu kolem 0,01 mmp P až 2 0,02 mmp P (přibližně obdélníkový řez o stranách kolem 0,1 mm a 0,1 až 0,2 mm). Uvědomíme-li si, že tloušťka běžného kancelářského papíru je 0,1 mm a že toto je zároveň mez rozlišení neozbrojeného oka, je ihned zřejmé, že manipulace s preparátem není jednoduchá a je k ní třeba dobrého mikroskopu. Druhou možností odkrytí vnitřku vzorku pro pozorování jeho struktury je příprava lomových ploch. Není to metoda obecná a kdykoliv použitelná, ale často jediná možná. Zde je třeba zaručit, abychom dokázali eliminovat vliv deformačních procesů, které lomu vždy předcházejí: buď je omezit na minimum (lom při velmi nízkých teplotách, např. v kapalném dusíku), nebo při pozorování lomové plochy umět rozeznat struktury vzniklé deformací od původní struktury objektu. Třetí možností odkrytí vnitřku vzorku je lept. Odstranění povrchové vrstvy nebo selektivní odstranění snadněji odstranitelných částí objektu se může provádět fyzikálními nebo chemickými technikami. Z fyzikálních technik se nejčastěji používá procesů vznikajících při výboji ve vakuu (vysokonapěťovém nebo vysokofrekvenčním). Mechanismy leptu jsou komplikované, mnohdy nedokonale popsané. Výsledek nebývá spolehlivý a téměř vždy vyžaduje odzkoušení leptacích podmínek. Použití chemických činidel pro selektivní odleptání požadované složky objektu bývá lépe definované, i když odzkoušení podmínek je rovněž nutné. Často se používá činidel způsobujících oxidativní degradaci méně odolné složky objektu. Na tomto místě je užitečné zmínit i fyzikálně chemické techniky, spočívající v selektivním rozpuštění některé z minoritních složek systému. Preparační postupy je možno kombinovat. Můžeme např. leptat povrch vzorku, lomovou plochu nebo řeznou plochu, vzniklou po zhotovení tenkého či ultratenkého řezu. Při interpretaci výsledného obrazu je však třeba znát detailně celý preparační postup, aby bylo zřejmé, jak lze pozorovaný obraz interpretovat, ale také vysvětlit možné preparační artefakty.
5. Příklady výsledků různých zobrazovacích technik V tomto souhrnu není prostor pro dostatečné ozřejmění rozdílů a možností mikroskopických technik. Základní typy zobrazení jsou na obr. 1 3. Dostatečný počet příkladů je uveden v přednášce. 6. Literatura L.C. Sawyer, D.T. Grubb, Polymer Microscopy, Chapmann & Hall, London 1996. 7. Obrazová část 1 Světelná mikroskopie polymerních sférolitů: A polyoxymethylen (POM); B polyvinylidenfluorid (PVF2). A. Polyoxymethylen B. Polyvinylidenfluorid 2 SEM rastrovací elektronová mikroskopie. Lomová plocha polymerního recyklátu směs polyolefinů (polyethylen PE, polypropylen PP) a polyethylentereftalátu (PET): A. Nekompatibilizovaná směs B. Kompatibilizovaná směs
3 Mikrostruktura kopolymeru ABS: A transmisní elektronová mi kroskopie (TEM), ultratenký řez kontrastovaný OsOB4B; B mikroskopie atomárních sil (AFM), řezná plocha. A. TEM transmisní elektronová mikroskopie, ultratenký řez kontrastovaný OsOB4B B. AFM mikroskopie atomárních sil řezná plocha