MIKROEXTRAKCE TUHOU FÁZÍ (Solid Phase MicroExtraction, SPME) Představení SPME techniky co je a jak pracuje SPME výhody a omezení SPME aplikace SPME Nové trendy v SPME SPME membrána SBSE
co je SPME? Extrakce pevnou fází o malém objemu: VLÁKNO KAPILÁRA MÍCHADLO SUSPENDOVANÉ ČÁSTICE STĚNA NÁDOBY MEMBRÁNA. J. Pawliszyn, SPME, Theory and Applications, Course notes, 2003
Používané zařízení Křemenné vlákno s chemicky modifikovaným povrchem (stacionární fáze) Délka vlákna: cca 1 cm Vnitřní průměr: 0,05 1 mm
jak SPME pracuje? SORPCE Přímá (DI) SPME Head-space (HS) SPME
jak SPME pracuje? DESORPCE Tepelná Rozpouštědlem
Představení SPME techniky jak se pracuje se SPME SORPCE
jak se pracuje se SPME DESORPCE
jak se pracuje se SPME AUTOMATICKY
historie a vývoj SPME konec 80. let 20. století: Prof. Janusz Pawliszyn a kol. Univerzita ve Waterloo, Kanada optická vlákna, desorpce laser, GC separace - zdlouhavé křemenná vlákna s vrstvou polymerní fáze, sorpce v roztoku, desorpce GC injektor ruční otvírání GC injektoru vlákna v mikrostříkačce s ochrannou jehlou, spojení s pístem, desorpce GC injektor v této podobě dodnes LITERATURA: Pawliszyn J., Liu S. : Anal. Chem. 59, 1475 (1987) Arthur C.L., Pawliszyn J.: Anal. Chem. 62, 2145 (1990) Zhang Z., Yang M. J., Pawliszyn J.: Anal Chem. 66, 844 A (1994) Pawliszyn J.: Solid phase microextraxtion: theory and practice. Wiley VCH, Inc. New York 1997, ISBN 0-471-19034-9
teorie SPME ROVNOVÁHA Přímá SPME c o.v s = c fv f + c s.v s f..stac.fáze, s..matrice n K fs = c f / c s K K fs fs.v f.c0.v.v V f s s Head-Space SPME c o.v s = c fv f + c s.v s + c h.v h h..head-space K fh = c f / c h, K hs = c h / c s n K fs K.V f fs.v f.c0.vs K.V hs h V s Je-li K fs malé nebo V s velké: tzn. K fs.v f << V s, pak: Je-li K fs velké: K fs.v f >> V s, n = V s.c o (kvant. extrakce) n = K fs.v f.c o
1. VOLBA VLÁKNA (polarita, tloušťka stacionární fáze) 2. PODMÍNKY SORPCE (extrakční mód, úprava vzorku, poloha vlákna, teplota, doba, míchání) 3. PODMÍNKY DESORPCE (umístění vlákna, typ lineru, teplota, délka; typ a objem rozpouštědla, statická x dynamická)
1. VLÁKNO DRUH FÁZE (zkratka) Polydimethylsiloxan (PDMS) Polyakrylát (PA) Carbowax/divinylbenzen (CW/DVB) Polydimethylsiloxan/ Carboxen (PDMS/CX) Carbowax/Templated Resin (CW/TPR) Polydimethylsiloxan/ divinylbenzen (PDMS/DVB) Polydimethylsiloxan/ Carboxen/divinylbenzen (PDMS/CX/DVB) TLOUŠŤKA FÁZE ( m) ANALYTY POPIS URČENA PRO 100 těkavé nevázaná GC/HPLC 30 středně těkav. nevázaná GC/HPLC 7 středně těkav. ch. vázaná GC/HPLC 85 středně těkav. část. GC/HPLC polární prokřížená 65 polární část. GC prokřížená 75 těkavé část. GC stopová mn. prokřížená 50 PAL část. HPLC prokřížená 65 těkavé polární část. GC obecné použ. prokřížená 60 30/50 obecné použ. část. prokřížená HPLC GC
1. VLÁKNO Polydimethylsiloxan (PDMS) Polyakrylát (PA) CH3 H H Si O C C CH3 n H C O n O CH3 Carbowax (CW) Divinylbenzen (DVB) H H H H H H C C O C C C C H H n H H H H n
1. VLÁKNO POLARITA polarita analytu
1. VLÁKNO MECHANISMUS SORPCE CHARAKTERISTIKA FÁZE MECHANISMUS SORPCE KAPACITA SOUTĚŽ ANALYTŮ o vazebná místa LINEÁRNÍ ROZSAH MEZE STANOVITELNOSTI ADSORBENTY (obsahují DVB či CX) pevný porézní materiál velký povrch fyzikální interakce, zachycení v pórech, chemická vazba omezená (zahlcení) ANO (hl. DVB jednotné póry) menší (zlepšení: extrakční doby mez stanovitelnosti) nízké ABSORBENTY (PDMS, PA) kapalná polymerní fáze analyty migrují do a z fáze zádrž dána tloušťkou fáze velká (silný film fáze) NE široký vyšší
1. VLÁKNO MECHANISMUS SORPCE ABSORBENTY PDMS: polymerní kapalina snadnější difůze analytů nepolární fáze nepolární analyty PA: pevný polymer pomalejší difůze nepolární C-páteř, polární esterové řetězce širší spektrum ADSORBENTY DVB: hlavně makro- a mezo- póry CX: rovnoměrná distribuce, více mikro- než DVB (0,29 mikro, 0,23 mezo, 0,26 makropórů v ml/g) Macropore Carboxen Part Mesopore Micropore
1.VLÁKNO MECHANISMUS SORPCE ABSORBENTY (PDMS, PA) x ADSORBENTY (DVB, CX) PDMS fáze částice Carboxenu (2-10µm) vlákno Carboxen Particle Analyty migrují mezi vrstvami vyšší kapacita SUPELCO, Sigma-Aldrich.com Macropore Mesopore Micropore ml per gram 0.44 micropores 0.16 mesopores 0.25 macropores
Představení SPME techniky Tloušťka sorbované množství pomalejší ustavení rovnováhy (difůze) MALÉ MOLEKULY (M R = 60 90) - sorpci ovlivňuje spíše typ sorpce (AD x AB) a velikost pórů - nejlepší CX, DVB/CX, PDMS/DVB 1. VLÁKNO - VOLBA TLOUŠŤKA STACIONÁRNÍ FÁZE STŘEDNĚ VELKÉ MOLEKULY (M R = 90 500) - důležitý tvar (substituenty) a velikost molekuly Výhoda použití polárního vlákna - polární analyty s M R > 90
1. VLÁKNO - VOLBA CITLIVOST - univerzálnost x selektivita PA SROVNÁNÍ VLÁKEN KÁVA, T 30 o C, S 60 min PDMS/CX CWX/DVB PDMS 100 PDMS/DVB PDMS/CX/ DVB
1. VLÁKNO - VOLBA CITLIVOST - univerzálnost x selektivita
2. SORPCE ÚPRAVA VZORKU (objem, navážka, mechanická úprava - mletí, modifikace matrice ph, vysolení, naředění, rozetření se sorbentem, přídavek rozpouštědla) MÍCHÁNÍ TEPLOTA SORPCE DOBA SORPCE POLOHA VLÁKNA PŘI VZORKOVÁNÍ TYP NÁDOBKY A UZÁVĚRU (tvar septa)
ÚPRAVA VZORKU SKOŘICE VLIV MLETÍ na obsah kumarinu 2. SORPCE odezva 10x 6 8 7 6 5 4 3 2 1 0 2 000 mg/kg 400 mg/kg 1800 mg/kg mletá skořice celá skořice celá skořice "jemně" mletá
2. SORPCE ÚPRAVA VZORKU PŘÍDAVEK ROZPOUŠTĚDEL (-) PŘÍDAVEK STANDARDU: CS 2 v butanolu, 5 ml vody ODEZVA 1 l n-butanolu 10 l n-butanolu sirouhlík 100 % 53 % n-butanol 100 % 445 %
Odezva (%) Představení SPME techniky 2. SORPCE VLIV MATRICE ALKOHOLICKÉ NÁPOJE (-) přídavek furanu 0,24 µg Odezvy furanu ve vodě a v roztocích ethanolu 120 100 100 80 60 40 20 17 11 7 7 0 VODA Ethanol 1% Ethanol 2% Ethanol 4% Ethanol 5%
ECD response Představení SPME techniky 2. SORPCE ÚPRAVA VZORKU PŘÍDAVEK ROZPOUŠTĚDEL (+) MODIFIKACE MATRICE: PAEs v oleji (1 g) + methanol 250000 200000 150000 100000 50000 DMP DEP DnBP BBP DEHP DnOP 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 volume of methanol (ul)
2. SORPCE ÚPRAVA VZORKU VYSOLENÍ (a úprava ph) Pozitivní vliv: neutrální molekuly snížení rozpustnosti Negativní vliv: ionizované analyty zvýšení iontové síly, preferují roztok vnesení nečistot (sekundární kontaminace) poškození vlákna
plocha píku plocha píku Představení SPME techniky 2. SORPCE ÚPRAVA VZORKU VYSOLENÍ (+) Pozitivní vliv: FURAN voda x káva Modelový systém voda Vzorek mleté kávy zalitý vodou 30000 25000 20000 15000 85 % 100 % voda voda se solí 2 000 000 1 800 000 1 600 000 1 400 000 1 200 000 1 000 000 59 % 100 % káva káva se solí 10000 82 % 100 % 800 000 600 000 5000 400 000 200 000 0 furan D4-furan furan
2. SORPCE ÚPRAVA VZORKU VYSOLENÍ (-) Poškození vlákna 65 µm CWX/DVB - 30 % NaCl ve vodě A nové B 6 extrakcí C 15 extrakcí limit 10 % NaCl (100 extrakcí) (F.Hernandez a kol.: Use of SPME for the Quantitatve Determination of Herbicides in Soil and Water Samples, Anal.Chem 2000, Vol.72, No.10, 2313-2322)
2. SORPCE MÍCHÁNÍ magnetické, sonikace, vibrace jehly (vialky) HS-SPME - těkavé analyty nemá výrazný vliv - méně těkavé analyty rychlejší transport DI-SPME rychlejší transport a) dokonale b) dobře c) špatně míchaný roztok (J.Pawliszyn: SPME: Theory and practice, Wiley-VCH,Inc., NY 1997, ISBN 0-471-19034-9)
% odezvy % odezvy Představení SPME techniky 2. SORPCE TEPLOTA SORPCE T difůze k vláknu, zádrž analytu s. f. x POVAHA ANALYTU H-S stanovení terpenů v kůře jehličnanů 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 20 30 40 50 60 70 80 Teplota ( C) a-pinen kamfen b-myrcen b-pinen 3-karen limonen 600 500 400 300 200 100 0 bornyl acetat 20 30 40 50 60 70 80b-karyofyllen Teplota ( C) a-humulen
Množství analytu MSD response Představení SPME techniky 2. SORPCE DÉLKA SORPCE ROVNOVÁHA max. citlivost, dobrá opakovatelnost X - často z praktického hlediska nepoužitelné 600000 500000 400000 300000 200000 DMP DEP DnBP BBP DEHP DnOP 100000 čas 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Extraction time (min)
3. DESORPCE POLOHA VLÁKNA V NÁSTŘIKOVÉM PROSTORU RYCHLOST VYSUNUTÍ VLÁKNA OBJEM GC LINERU DESORPČNÍ TEPLOTA DÉLKA DESORPCE
3. DESORPCE DESORPČNÍ TEPLOTA kvantitativně a rychle
3. DESORPCE TEPLOTA KOLONY zaostření DÉLKA A TEPLOTA DESORPCE carry-over efekt, snížení zahlcení kolony OBJEM GC LINERU ovlivnění chromatografie BENZEN PDMS 100 T des 300 o C
DÉLKA DESORPCE snížení zahlcení kolony, ovlivnění chromatografie Terpenické látky v jehličí Smrku ztepilého Vzorek: 3,5 g větviček Extrakce: 25 o C, 20 min PDMS 100 µm GC/FID, DB-5MS 990 µl liner 3. DESORPCE 1 minuta
Možnosti SPME výhody a omezení SPME VÝHODY: + snadné provedení + ekonomicky nenáročné + bez použití rozpouštědel (ekonomika, zdravotní aspekt) + citlivost + automatizovatelnost + vzorkování in situ + opakované použití vlákna NEVÝHODY: - (někdy) náročná optimalizace - ne-reprezentativnost - nemožnost použití nepolárních rozpouštědel - (horší opakovatelnost) - možná saturace detektoru - ne-robustnost
Možnosti SPME výhody a omezení Typ vzorků - co lze analyzovat?
Možnosti SPME výhody a omezení Typ vzorků - co lze analyzovat? TÉMĚŘ VŠECHNO!!!
Možnosti SPME výhody a omezení Typ vzorků - co lze analyzovat? EXTRAKČNÍ MÓD H-S x DI: povaha matrice a analytu CITLIVOST, INFORMACE O SLOŽENÍ VZORKU limonada_ln2365_di_pa_co2 08.10.2003 17:28:24 RT: 0,00-49,01 100 90 80 Re70 lati ve 60 Ab 50 un da 40 nc e 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,72 1,65 LIMONÁDA - CITRUS HS SPME, PA, 40 C, 5 ml 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time (min) 25,34 33,63 33,38 43,56 43,29 22,82 45,38 47,52 28,15 40,88 4,07 32,47 7,38 10,01 11,63 14,97 18,67 19,87 22,50 DI SPME, PA, 40 C, 7,5 ml 23,69 31,27 40,77 36,56 38,11 26,59 28,76 25,34 D-limonen Cyklodekanol 33,38 p-menth-1-en-8-ol ISOPROPYLPALMITAT Ethylcitrat 43,57 p-mentha-1,4(8) dien 41,64 45,38 CO2 22,80 Oktanal Pentadekanal 46,26 4,07 28,15 40,88 23,70 31,27 32,45 26,60 36,55 38,10 0,37 1,87 6,09 7,39 10,25 12,38 15,08 18,50 22,42 30,77 33,64 NL: 1,00E7 TIC MS limonada_l N2365_PA NL: 1,00E7 TIC MS limonada_l N2365_DI_ PA_CO2
Možnosti SPME APLIKACE SPME I. Analýzy cílené na kvantifikaci známého analytu II. Srovnávací analýzy profiling a) identifikace původce off-flavour b) diferenciace mezi vzorky s různou historií
Počet publikací Možnosti SPME APLIKACE SPME Databáze Chemical Abstracts (SciFinder Scholar) Publikace do července 2008 800 700 600 500 483 522 607 571 672 709 400 342 369 368 368 300 200 100 0 1 1 8 12 19 1990 1991 66 1992 1993 1994 1995 1996 116 175 212 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 (*)
NOVÉ TRENDY V SPME SPME MEMBRÁNA prokřížený PDMS počáteční rychlost SPME přímo úměrná povrchové ploše sorbentu VLÁKNO (100 µm PDMS) MEMBRÁNA (1 cm x 1 cm PDMS) PLOCHA POVRCHU A f = 10 mm 2 A m = 200 mm 2 OBJEM FÁZE V f = 0,61 mm 3 V m = 2,55 mm 3 POMĚR OBJEMŮ V m / V f = 4,5 POMĚR PLOCH A m / A f = 20 RYCHLOST CITLIVOST X DESORPCE???
NOVÉ TRENDY V SPME STIR BAR SORPTIVE EXTRACTION (SBSE) TWISTER (Gerstel GmbH, Německo) PDMS ROZMĚRY: MAGNET Délka = 10; 20; 40 mm Vnější průměr = 3,2 mm objem s.f. cca 20-350 µl Tloušťka flmu = 0,5; 1 mm (vlákno cca 0,6 µl) kvantitativní výtěžnost sloučenin s K ow 500 stanovit lze i sloučeniny s K ow 10 500 SKLO
NOVÉ TRENDY V SPME STIR BAR SORPTIVE EXTRACTION (SBSE) Výtěžnost HS-SPME a SBSE v závislosti na log K OW analytů
NOVÉ TRENDY V SPME STIR BAR SORPTIVE EXTRACTION (SBSE) Provedení SBSE: - přímá extrakce v kapalném vzorku - osušení - umístění ve skleněné desorpční trubici (187 x 4 mm) - tepelná desorpce (Thermo Desorption Systém TDS-2, Gerstel) - GC analýza
NOVÉ TRENDY V SPME STIR BAR SORPTIVE EXTRACTION (SBSE) POZITIVA: 100 1000 x nižší detekční limity (µg ng/l) než SPME kvantitativní extrakce s velkým lineárním rozpětím snadné a rychlé provedení automatiz. desorpce teplem simultánní analýza více vzorků PROBLÉMY: zatím neprozkoumaná možnost opakovaného použití - carry-over efekt nízká citlivost pro polárnější analyty vysoké pozadí z komplexních matric (zpětná extrakce rozpouštědlem)