HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 Ref. 3000 Ref. 3200* 2015/06
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 kit je určen k elektroforetickému rozdělení bílkovin lidského séra do šesti hlavních frakcí na agarózových gelech o ph 8.6. Separované bílkoviny jsou fixovány horkým vzduchem nebo ve směsi kyseliny a alkoholu a obarveny roztokem amidočerni. Přebytek barvičky je odstraněn kyselým roztokem. Vyhodnocení je buď vizuální nebo denzitometrické (relativní kvantifikace jednotlivých zón). Každý agarózový gel HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 je určen k analýze 7mi vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Elektroforéza bílkovin je běžnou technikou rutinně používanou klinickými laboratořemi ke skríningu abnormalit bílkovin séra a některých dalších biologických tekutin. Uygun bir destek üzerinde (agaroz jel) çalışılan bölge elektroforezi üzerine kuruludur. Agaróza slouží jako univerzální a efektivní podpůrné medium. V diagnostických aplika-cích se v ní sérum dělí na šest hlavních frakcí dle jejich náboje při daném ph : albumin, alfa-1 a alfa-2 globuliny, beta-1 a beta-2 globuliny a gama globuliny. Každá zóna obsahuje jeden a více sérových proteinů. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 3000 KAT. Č. 3200* Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 100 gelů Pufr Tris-barbital (zásobní roztok) 3 lahv. po 100 ml 15 lahv. po 100 ml Ředící roztok pro amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv. 60 ml 4 lahv. po 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv. 20 ml 4 lahv. po 20 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml 1 lahv. 100 ml Aplikátory (7 zubů) (připraveno k použití) 1 bal., 10 ks 10 bal. po 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal., 10 ks 10 bal. po 10 ks * Maxi-Kit Hydragel Protein(e) K20 objem pufru v soupravě Maxi-Kit odpovídá migracím dvou gelů. Uskladněte pufr pro zpracování dvou gelů! Pro optimální VÝSledKy : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. ProSÍMe, ČtĚte PeČliVĚ PŘÍBaloVÝ leták. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 8.6 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu bílkovin. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech - šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty - neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. TRIS-BARBITAL PUFR Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok s ph 8.7 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Elektroforetický pufr. Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní několik let, nejméně do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. - 106 - SEBIA NÁVOD - Czech
3. ŘEDÍCÍ ROZTOK PRO AMIDOČERŇ Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok ph 2. barvícího roztoku s amidočerní. Zásobní roztok ředícího roztoku pro amidočerň se skladuje při pokojové teplotě nebo při teplotě 2-8 C. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 4. AMIDOČERŇ Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. V případě potřeby opakujte tento krok dvakrát až třikrát. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. PoZnÁMKa : nesprávná příprava barvícího roztoku povede k nedostatečnému barvení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce). Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. 5. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku Clean ProteCt. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 6. APLIKÁTORY Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 7. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. - 107 -
POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahv. 5 ml) připraveno k použití. Ředění vzorků s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku (například viskózní nebo zakalené vzorky, jako jsou séra s obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu, vzorky s polymerizovaným Ig M, ) nebo s nízkou intenzitou elektroforetického záznamu. Při teplotě místnosti. Stabilní do doby expirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny. 2. FIXAČNÍ ROZTOK Nejméně 15 minut před použitím, připrav roztok obsahující (obj. / obj.) : 60 % etanolu ; 10 % kys. octová a 30 % destilované vody. Dobře promíchejte. Použítí K fixaci separovaných bílkovin v agarózových gelech. Vydrží asi 3 měsíce v těsně uzavřených láhvích při pokojové teplotě. Používej každých 150 ml maximálně na 4 gely. PoZnÁMKy : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20. 3. Vlhká komůrka kat. č. 1270. 4. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 5. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi - HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 6. Pipety 10 µl a 200 µl. 7. Sušička - inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 8. Denzitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : software pro plochý skener HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Nejlepších výsledků se dosahuje analýzou čerstvých sér - v případě nutnosti lze po dobu jednoho týdne skladovat v chladničce. V případě potřeby lze séra skladovat při teplotě 2 až 8 C až po dobu jednoho týdne. PoZnÁMKa : Beta-2 frakce (C3 složka komplemenu) zmizí po 3 dnech. Mražené vzorky séra jsou stabilní nejméně 1 měsíc. Mražení sér s azidem sodným, 0.02 g/dl zvyšuje stabilitu. DŮLEŽITÉ : Kyselinu boritou jako konzervační činidlo nepoužívejte. Zmražená séra po rozpuštění zanechávají na startu rovněž stopu z denaturovaných proteinů a lipoproteinů. Skladování při 2-8 C i mražení způsobuje anodický posun beta-lipoproteinů z beta-zóny do zóny alfa-2 nebo alfa-1. Čím je použito starší sérum, tím je výraznější posun. vzorků Používejte neředěné vzorky séra. Úprava sérových vzorků pomocí Fluidil: Úprava sérových vzorků přípravkem Fluidil se musí provést v následujících případech: - Sérové vzorky s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku, například viskózní nebo zakalené vzorky po skladování při teplotě 2 až 8 C nebo po zmrazení (zejména vzorky obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu). - Sérové vzorky s polymerizovaným Ig M. - Sérové vzorky s elektroforetickým záznamem s nízkou intenzitou. V takových případech přidejte 25 μl přípravku Fluidil na 75 μl séra a odstřeďujte na vortextu po dobu 15 sekund. Dále pokračujte podle standardního postupu. Nepoužívat Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra - hemolýza zvyšuje alfa-2 a beta-frakce. Vzorky plasmy - proužek fibrinogenu v blízkosti místa aplikace by mohl být zaměněn za monoklonální imunoglobulin a mohl by měnit procentuální složení odpovídajících zón. PoZnÁMKa : odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SeBia "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 108 -
PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby. 2. Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujete, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. UPOZORNĚNÍ : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu - hrozí dehydratace gelu! 5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku - gelem k sobě (obr. 2). 6. Nyní gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (viz obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. 3). 9. Do jamek aplikátoru pipetujte 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat do aplikátoru v průběhu 2 minut. - Aplikátor použijte okamžitě. - Pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopte za plastikovou část chránící zoubky a celou komoru umístěte do chladničky. Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru. 10. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. 11. Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz obr. 4). 12. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESNIŽOVAT PRUDCE. 13. Po 40 sekundách aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte. 14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGEL ovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 15. Připojte dělící komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 22 minut 90 V 12 ± 3 ma 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. II. FIXACE Zpracujte gel jedním z následujících postupů. Horkovzdušná fixace (doporučuje se pouze s inkubátorem-sušičkou SeBia is 80) : Gel zcela osušte v inkubátoru-sušičce při 80 C (asi 10 min). Fixace pomocí fixačního roztoku : 1. Vložte gel do držáku. 2. 150 ml fixačního roztoku nalejte do jedné z nádobek HYDRAGEL K20 Accessory Kitu. 3. Gel ponořte na 15 minut do fixačního roztoku. 4. Gel vyjměte a osušte při 80 C. DŮLEŽITÉ : Gel musí být perfektně suchý. III. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Po usušení a ochlazení ponořte usušený gel do barvícího roztoku na 4 minuty. 2. Odbarvěte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné. 3. Odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu tenkým papírem a osušte gel při 80 C teplého vzduchu. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. IV. SKENOVÁNÍ Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum (Control Serum SEBIA, kat. č. 4785). - 109 -
VÝSLEDKY Hodnoty Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) jednotlivých proteinových zón. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) hlavních elektroforetických zón proteinů 91 sér zdravých mužů a žen na gelech HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. Kvantifikace bílkovin v UV na CAPILLARYSu dává podobné hodnoty jako nephelometrie (speciálně pro albumin). SEBIA nabízí HYDRAGEL - CAPILLARYS / NEPHELOMETRIE ekvivalentní jednotky na HYDRAGELu, po kalibraci skenovacího systému. FRAKCE Bez HYDRAGEL CAPILLARYS / NEPHELOMETRIE Ekvivalentních Hodnot HYRYS - DVSE - PHORESIS Je doporučeno, aby si každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. S HYDRAGEL CAPILLARYS / NEPHELOMETRIE Ekvivalentními Hodnotami HYRYS - DVSE - PHORESIS Albumin 59.4-73.9 % 53.5-66.5 % Alfa-1 globuliny 1.2-3.1 % 1.4-4.0 % Alfa-2 globuliny 7.0-12.2 % 8.0-15.7 % Beta-1 globuliny 4.9-9.4 % 5.6-12.1 % Beta-2 globuliny 1.6-5.6 % 1.8-7.2 % Gama globuliny 6.9-14.7 % 7.9-18.9 % Interpretace 1-14 SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Některé vzorky séra mohou vykazovat lehké štěpení, jež závisí na koncentraci a pohyblivosti proteinů zóny alfa-2 viz ELEKTROFOREOGRAM. Některá séra mají rozdílný fenotyp - (haptoglobin, GC globulin). Alfa-1 lipoprotein závisí na koncentraci a skladování vzorku. U některých vzorků séra může být patrný malý, poměrně ostrý proužek odpovídající komplementu C3, který migruje do katodické zóny β-2. Viz MIGRAČNÍ TYPY. Pro pomoc při interpretaci výsledků elektroforézy sérových a močových bílkovin, použijte dostupnou LITERATURU. Interference a omezení Lipoproteiny LDL a HDL jsou komplexní složky s velmi proměnlivou přirozenou elektroforetickou mobilitou mezi beta a alfa-2 pásmem. S cílem zabránit komplikacím při integraci a interpretaci, jsou gely HYDRAGEL vyráběny s konkrétním chemickým složením, které obecně zajišťují umístění HDL v pásmu alfa-2 a LDL v pásmu beta. Migrace je velmi citlivá na následující parametry : - skladování vzorku, - koncentrace lipoproteinů, - ošetření léky (například heparinem), - míru dehydratace gelu (skladování gelu), - odchylky v kvalitě surovin, i malé. Z těchto důvodů je možné pozorovat slabý anodický posun těchto lipoproteinů, které jsou více patrné při rozšíření nebo mírnému rozdělení oblastí alfa-2 a / nebo beta. 1) Procentuální obsah frakcí alfa-2 a beta zůstává zcela nezměněn přes mírné rozdělení v důsledku odchylek elektroforetické mobility. 2) Charakteristický tvar frakce beta-lipoproteinů (s významně zaostřeným a nepravidelným tvarem) by neměl vést k chybné interpretaci, protože se změnil pouze tento aspekt. Viz kapitola ANALYZOVANÉ VZORKY. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". - 110 -
HODNOTY Reprodukovatelnost mezi vzorky (na gelu) Každý ze tří sérových vzorků byl podroben analýze na 7-mi drahách gelu se soupravou HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 dvou šarží. Průměr, SD a CV (n = 7) byly vypočteny pro každý vzorek, každou frakci a každý gel / šarži. Tabulka ukazuje hodnoty pro vzorek A ze dvou testovaných gelů / šarží. Obdobné výsledky byly stanoveny i pro vzorky B a C. FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) Albumin 69.7-70.4 0.3-0.3 0.4-0.4 Alfa-1 globuliny 1.8-1.7 0.1-0.1 4.5-4.1 Alfa-2 globuliny 10.0-9.8 0.1-0.1 1.4-1.3 Beta-1 globuliny 8.2-8.0 0.2-0.1 2.2-1.9 Beta-2 globuliny 3.5-3.7 0.3-0.3 7.4-7.2 Gama globuliny 6.8-6.5 0.3-0.2 3.9-2.8 Reprodukovatelnost mezi gely Sedm (7) různých sérových vzorků bylo podrobeno testům na 5-ti gelech soupravy HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 dvou šarží. Celkový průměr, SD a CV byly vypočteny pro každý vzorek a frakci. Výsledky byly obecně stejné pro všechny vzorky a obě šarže. Následující tabulka ukazuje rozsahy SD a CV vypočítané pro jednotlivé vzorky a průměr CV vypočítaný ze směsného CV pro všechny vzorky a jednu šarži (n = 5). FRAKCE SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) Albumin 0.2-1.0 0.3-1.5 0.8 Alfa-1 globuliny 0.1-0.2 4.3-8.4 5.9 Alfa-2 globuliny 0.1-0.3 1.3-2.8 1.9 Beta-1 globuliny 0.1-0.3 1.0-3.5 2.1 Beta-2 globuliny 0.1-0.3 2.7-10.1 5.4 Gama globuliny 0.1-0.5 1.8-3.7 2.8 Přesnost Devadesát (90) různých sérových vzorků (patologických a normálních sér) bylo podrobeno analýze na HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 gelech a jiných, komerčně dostupných agarózových gelových systémech. Korelační parametery kalkulované pro jednotlivé zóny na HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 gelech vs. porovnávací gelový systém (y-hydragel PROTEIN(E) K20) byly následující : Frakce Korelační koef. y - úsek Sklon Rozsah % hodnot HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 Albumin 0.978 3.355 0.947 52.8-72.5 Alfa-1 globuliny 0.977 0.216 1.033 1.3-6.5 Alfa-2 globuliny 0.973 0.514 0.982 7.2-17.2 Beta-1 0.976-0.136 1.028 5.3-12.0 Beta-2 0.926 0.468 0.812 2.4-8.3 Gama globuliny 0.982 0.242 0.982 5.6-17.0 Citlivost Vzorek patologického séra s monoklonální bílkovinou o koncentraci 2.12 g/dl byl následně ředěn a takto ředěný vzorek byl elektroforeticky analyzován na HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 gelu. Po vizuální kontrole gelu, nejvyšší ředění s viditelným monoklonálním proužkem bylo 1/128. Přepočítaná nejnižší koncentrace monoklonální bílkoviny byla 0.017 g/dl. PoZnÁMKa : V závislosti na umístění monoklonální komponenty a polyklonálního pozadí v gama zóně, se může detekční limit lišit. Linearita Roztoky albuminu o koncentraci 6,0 g/dl a gamaglobulinu o koncentraci 4,0 g/dl (koncentrace bílkovin stanovená spektrofometricky při 280 nm) byly smíchány v různých koncentracích od 10 ku 10 (100 % roztoku albuminu + 0 % roztoku gamaglobulinu, 90 % + 10 % atd..., až po 0 % roztoku albuminu + 100 % roztoku gamaglobulinu) a směs byla analyzována na elektroforéze metodou HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. Výsledky prokázaly, že získané procento každé frakce perfektně koreluje s teoretickým procentem každé frakce ve směsi, a že mohou být metodou HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 lineárně detekovány jakékoli varianty. Bylo určeno, že test HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 je lineární pro frakce albuminu a gamaglobulinu v celém studovaném rozsahu koncentrací (mezi 0,0 a 6,0 g/dl albuminu a 4,0 g/dl gamaglobulinu). - 111 -
ELEKTROFOREOGRAM + Albumin Orosomucoid 1 Antitrypsin G - A - M - D - E - Alfa-2 zóna : 2 (± 5) 2 (± 5) 1 + 2 + 3 + 4 + 5 1 + 2 + 3 + 4 (± 5) 1 + 3 + 4 (± 5) A B C 1 = α2 Macroglobulin 2 = Haptoglobin 3 = Ceruloplasmin 4 = GC Globulin 5 = α1 Lipoprotein - 112 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. la Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996. 2. Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). la revue du Praticien, n 9, 21/03/91, p. 782 à 785. 3. Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d erreur en cas d immunoglobuline monoclonale. act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278. 4. Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatengy P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory. Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41. 5. Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de diagnostic protéinologique, principes et limites. l eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n 194, p. 203 à 212. 6. Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. l eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n 195, p. 283 à 285. 7. Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. revue Française des laboratoires, 1993. 8. Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp. 9. Le Carrer D. L interprétation de l électrophorèse des protéines. l eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n 182, p. 27 à 33. 10. North M.L. Détection et caractérisation d une immunoglobuline monoclonale. revue Française des laboratoires, Mars 1990, n 203, p. 54 à 58. 11. Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23. 12. Sicard D. Du bon usage de l électrophorèse des protéines. le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515. 13. Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. larc Medical, 1987, n 7, Vol VI, p. 348 à 351. 14. Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139. 15. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. impact-internat, 1986 ; Sept : 93-97. - 142 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7-143 -