Úloha č. 15 Stanovení antiradikálové aktivity metodou DPPH Úvod Mezi inhibitory oxidace patří sloučeniny s rozličnou chemickou strukturou a různými mechanismy účinku. Principem účinku primárních antioxidantů je přerušení řetězové radikálové reakce. Míru účinnosti primárního antioxidantu lze pak snadno určit např. při reakci s radikálem, jehož úbytek je možné snadno změřit. Test s využitím stabilního 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylového radikálu (DPPH ) je běžně využívanou metodou pro určení antiradikálové aktivity čistých syntetických antioxidantů, isolovaných přírodních látek, rostlinných extraktů a potravin. Cíle Naučit se experimentálně sledovat průběh reakce antioxidantů se stabilním radikálem DPPH. Stanovit antiradikálovou aktivitu čistých antioxidantů i vzorků potravin a z průběhu reakce s radikálem DPPH popsat mechanismus reakce antioxidantu. Umět zpracovat, vyhodnotit a diskutovat získané výsledky. Předpokládané znalosti Inhibice oxidačních reakcí v potravinách Mechanismus autooxidace. Princip účinku primárních antioxidantů. Chemie flavonoidních látek a dalších antioxidantů. Princip Přítomnost antioxidantů s antiradikálovou aktivitou způsobí redukci barevného (λ max = 517 nm) stabilního radikálu DPPH na bezbarvou neutrální molekulu. Rychlost a rozsah odbarvení (pokles absorbance) jsou úměrné antioxidační (antiradikálové) účinnosti analyzované látky (extraktu). Antioxidační aktivita se vyjádří jako účinná koncentrace antioxidantu, která je potřebná k redukci 50 % radikálu DPPH (hodnota EC 50 ). O 2 N. N N antioxidant O 2 N H N N Pracovní postup Do 100 ml odměrné baňky se připraví roztok DPPH o koncentraci 6.10-5 mol.l -1 v methanolu ředěním 10x koncentrovanějšího zásobního roztoku.
Do 10 ml nebo 25 ml odměrných baněk se podle pokynů vyučujícího připraví roztoky čistých antioxidantů o koncentracích 0,5 až 5.10-5 mol.l -1 ve vodě nebo MeOH. Vzorky potravin se připraví následujícím způsobem. Asi 50 ml vzorku piva ve 100 ml kádince se odplyní na ultrazvukové lázni (20 min). Vzorek ovocné šťávy se přefiltruje přes nástavec s filtrem (0,45 µm) do stříkačky. Nálev z černého čaje se připraví přelitím čajových lístků vařící destilovanou vodou v poměru 1:100 (m/m). Po 5 min extrakci se nápoj rychle přefiltruje přes řídký filtrační papír (min. 90 % objemu) a filtrát se ochladí pod tekoucí vodou. Pro přípravu nálevu ze zeleného čaje se použije destilovaná voda 80 C teplá a lístky se louhují 3 min. Pro případné určení podílu nízkomolekulárních látek na celkové antiradikálové aktivitě vzorku se asi 30 ml vzorku (extraktu) ultrafiltruje přes 1 kda membránu. Vzorky (nálevy) se podle potřeby ředí před smícháním s roztokem DPPH vodou. Podle pokynů vyučujícího se do kyvet obsahujících 20-200 µl vzorku (roztoku čistého antioxidantu) o příslušné koncentraci přidá 20-200 µl methanolu (v případě BHA, BHT aj. ve vodě hůře rozpustných látek 20-200 µl methanolového roztoku látky a 20-200 µl vody) a 3 ml methanolového roztoku DPPH (0,06 mmol.l -1 ). Obsah kyvety se mírně protřepe (10 s) a co nejrychleji analyzuje. Pokles absorbance vzorků se sleduje při 517 nm proti MeOH. Současně se měří pokles absorbance v kyvetě s DPPH, kde je místo vzorku s antioxidanty 20-200 µl vody. U barevných vzorků (pivo, čaj) se provede korekce proměřením absorbance vzorků v methanolu bez DPPH. Pokles absorbance při měření aktivity čistých antioxidantů se měří po 1 min, pak každých 15 min první 3 hod a každých 30 min další 3 hod měření nebo do dosažení ustáleného stavu (stav, kdy rozdíl tří po sobě jdoucích měřených hodnot < 1 % zbylého DPPH ). Při měření aktivity vzorků potravin se sleduje absorbance po 5 min, pak každých 30 min první 3 hod a každých 60 min další 3 hod měření. Pokud není po 6 hod reakce dosaženo ustáleného stavu, pokračuje se dalšími dvěma měřeními (min. 6 hod interval) v každém z následujících 2 dnů. Výpočty Výsledky měření se uvedou do tabulky a do grafu se vynesou závislosti % zbývajícího DPPH na čase pro různé koncentrace testované látky (vzorku) viz vzorový graf. ubytek DPPH-% 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 4,5-dimethylkatechol 0.001M 0.002M 0.003M 0.004M 0.005M 0.008M 0,00 0 50 100 150 200 250 čas(min) Odečtou se hodnoty zbývajícího DPPH v ustáleném stavu a vynesou do grafu oproti relativní koncentraci látky (mol čisté látky/mol DPPH ) nebo vzorku (mg nebo ml vzorku /ekvivalent DPPH ) viz vzorový graf.
100 80 %DPPH 60 40 20 0 0 EC(50) 0,2 0,4 0,6 c(mol 4,5-DMK/mol DPPH) Antioxidační aktivita se pak vyjádří jako množství antioxidantu (resp. jeho molární nebo hmotnostní poměr k DPPH ) potřebné k poklesu počáteční koncentrace DPPH na 50 % (EC 50 ). Kromě EC 50 použijte pro charakterizaci antioxidační účinnosti také hodnotu antiradikálové síly ARP = 1/EC 50. Pokud byl ustálený stav u vzorků nejednoznačný nebo nebyl dosažen, pokuste se po nalezení vhodného kinetického popisu vyjádřit u křivek odbarvování DPPH hodnotu rychlostní konstanty poklesu absorbance, vztažené na jednotku vzorku (mg nebo ml). Pro lineárni regresi použijte integrované formy rychlostních rovnic pro celistvé řády reakce, např. pro kinetiku 4. řádu použijte rovnici: 1 1 = 3kt, 3 3 A A0 kde A 0 je počáteční absorbance a A absorbance v čase t. Určete korelační (regresní) koeficienty a porovnejte je s kritickými hodnotami. Zařaďte testované individuální antioxidanty do skupiny podle rychlosti dosažení rovnovážného stavu (rychlá, < 5 min; střední, 5 až 30 min; pomalá, > 30 min). Určete stechiometrii (SR) analyzovaného oxidantu vůči DPPH a jeho inverzní hodnotu n DPPH, tj. počet redukovaných molů DPPH jedním molem antioxidantu. SR = EC 50 2. Diskutujte mechanismus účinku antioxidantů s ohledem na strukturu antioxidantů (počet hydroxylových skupin aj.), rychlost dosažení rovnovážného stavu a zjištěnou stechiometrii. Autotest 1. Jakým způsobem ovlivňují antioxidanty proces oxidace lipidů a jiných oxylabilních sloučenin? 2. Jaký je princip účinku primárních antioxidantů? 3. V čem se zásadně liší přímé a nepřímé metody stanovení antioxidační aktivity? 4. Které nepřímé metody stanovení antioxidační aktivity znáte? 5. Jaké jsou výhody a nevýhody zrychlených testů antioxidační aktivity? 6. Na čem jsou založeny přímé metody stanovení antioxidační aktivity? 7. Jak reaguje stabilní radikál DPPH s molekulou antioxidantu?
8. Jaké je zbarvení stabilního radikálu DPPH? 9. Jaké je zbarvení 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazinu? 10. Jak se liší vlastnostmi radikál DPPH od jiných volných radikálů? 11. Jak mohou reagovat monofenolové antioxidanty s radikálem DPPH? 12. Jaký význam má poloha druhé hydroxylové skupiny na reaktivitu fenolového antioxidantu? Výsledky autotestu 1. Chemické inhibitory oxidace a) reagují s volnými radikály (primární antioxidanty), b) redukují vzniklé hydroperoxidy, c) váží do komplexů katalyticky působící kovy, d) eliminují přítomný kyslík, deaktivují singletový kyslík, absorbují záření aj.. 2. Primární antioxidanty stabilizují volné radikály tak, že jim poskytnou radikál vodíku (nebo elektron). Současně vzniklé radikály antioxidantů jsou pak vzhledem ke své struktuře natolik stabilní, že se neúčastní propagační fáze autooxidační reakce. 3. Při použití nepřímých metod se získají kvalitativní data o vztahu testované sloučeniny k procesu oxidační degradace. Oproti tomu přímé metody poskytují informace o mechanismu účinku antioxidantu. 4. Nepřímé metody jsou založeny na měření rychlosti oxidace lipidů aj. složek potravin, ke kterým byl přidán antioxidant. Zahrnují řadu metod včetně stanovení peroxidového čísla, konjugovaných dienů, polymerů, thiobarbiturového čísla, sekundárních těkavých produktů, chemiluminiscenční a fluorescenční metody aj. 5. Výhodou je zkrácení indukční periody řetězové radikálové reakce. Nevýhodou jsou v některých případech méně spolehlivé výsledky, protože vyšší teplota nebo vyšší koncentrace kyslíku oproti běžným podmínkám v praxi mohou způsobit degradaci antioxidantů. 6. Například na měření redoxního potenciálu nebo schopnosti zhášet radikály (syntetické i přirozeně se vyskytující) metodami spektrofotometrickými, chemiluminiscenčními, EPR spektroskopií aj. 7. DPPH + AH DPPH H + A 8. Tmavě červené, nachové. 9. Bezbarvé až slabě nažloutlé. 10. Na rozdíl od např. hydroxylového a anionu superoxidového radikálu nebývá ovlivňován vedlejšími reakcemi jako je chelatace nebo enzymová inhibice. 11. Buďto reagují s jednou (stechiometrie odpovídá počtu vodíků na aktivních hydroxylových skupinách) nebo se dvěma molekulami DPPH. Potom musí mít antioxidant takovou strukturu, která umožňuje a) přenos druhého vodíku po delokalizaci elektronu na substituent v para poloze nebo b) dimerizaci dvou fenoxylových radikálů nebo
c) reakci arylového radikálu s další molekulou DPPH. 12. Značný. Fenolové sloučeniny s druhou hydroxylovou skupinou v poloze ortho nebo para mají podstatně vyšší aktivitu než ty s OH skupinou v poloze meta. Odkazy Animace oxidace lipidů: http://mms01.vscht.cz/vyuka/files/kc323405_4o.ppt Animace mechanismus účinku fenolových antioxidantů: http://mms01.vscht.cz/vyuka/files/kc323405_4a.ppt Teorie oxidace a inhibice oxidace: http://mms01.vscht.cz/vyuka/files/kc323405_4.pdf Teorie kinetické vztahy: http://mms01.vscht.cz/vyuka/files/kc323405_1.pdf http://www.sci.wsu.edu/idea/chemkinetics/ Doporučená literatura: http://mms01.vscht.cz/vyuka/doplit.aspx?id=kc323410