UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 42

UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 42 Detekce a kvantifikace Brucella spp. pomocí metody qpcr Autoři Mgr. Iva Kubíková, Ph.D., Mgr. Petr Králík, Ph.D. Výzkumný ústav veterinárního lékařství Oponenti mjr. MVDr. René Gilar Odbor akreditované laboratoře Vojenský veterinární ústav Hlučín Prof. MVDr. Alois Čížek, CSc. Ústav infekčních chorob a mikrobiologie Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Uvedená certifikovaná metodika je výstupem projektu Bezpečnostního výzkumu MV ČR VG20102015011. Zveřejňování této metodiky či jejích částí podléhá omezením vyplývajících z požadavků MV a MO ČR. ISBN 978-80-86895-40-6 2014

PŘEDMLUVA Brucelóza je endemické infekční onemocnění způsobené baktérií rodu Brucella. Nejčastěji se infekce vyskytuje u ovcí, skotu, koz, prasat a psů, ale postihuje také např. ploutvonožce nebo kytovce. Brucella je druhově specifická, nicméně jsou popsány i případy nakažení jiného druhu hostitele. Brucelóza u zvířat způsobuje aborty a genitální infekce (William, et al., 2004). Pro člověka jsou patogenní druhy B. abortus, B. melitensis, B. suis a B. canis. K přenosu na člověka dochází při manipulaci s infikovaným masem, krví či placentou, z potravin je riziková konzumace nepasterovaného mléka a sýrů. Vzácně dochází k přenosu z člověka na člověka, nejčastěji mateřským mlékem či sexuálním kontaktem. U domácích psů je možný přenos kousnutím. Incidence brucelózy v populaci je v západních zemích vzácná, nicméně farmáři, pracovníci jatek, ZOO a veterináři se mohou s infikovanými zvířaty dostat do kontaktu častěji. Brucelóza je chronické onemocnění s relapsy, které mohou přetrvávat mnoho let, a může docházet k závažným komplikacím. Významná je proto prevence a včasná detekce infikovaných zvířat (Franco et la., 2007; Young et al., 2009). I) CÍL METODIKY Cílem metodiky je rychlá detekce a kvantifikace Brucella spp. Systém byl navržen tak, aby detekoval všechny druhy rodu Brucella a byl použitelný pro diagnostiku u všech druhů vnímavých zvířat. II) VLASTNÍ POPIS METODIKY 1 Popis qpcr systému Průkaz přítomnosti Brucella spp. je založen na detekci dvou sekvencí vyskytujících se nezávisle na sobě v genomu všech druhů. Kombinace dvou cílů zvyšuje specifitu testu a snižuje riziko falešně pozitivního výsledku. Do každé reakce je přidána interní amplifikační kontrola, která upozorní na falešně negativní výsledek v důsledku přítomnosti inhibitorů ovlivňujících průběh reakce. Jedná se tedy o triplexní real-time PCR. Kvantifikace probíhá podle kalibrační křivky desetinásobných ředění gradientu plazmidového konstruktu, do kterého byl naklonován amplifikovaný fragment.

Sekvence primerů a sond a detaily o cílových genech a interní amplifikační kontrole jsou na požádání k dispozici u Mgr. Petra Králíka, Ph.D. z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, v.v.i., Hudcova 70, Brno, 62100, email: kralik@vri.cz, tel +420 777 473 009 2 Předmět a působnost Tato metodika slouží k identifikaci a kvantifikaci Brucella spp. na základě detekce vybraných genů. 2.1 Podstata zkoušky Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qpcr). 2.2 Přístroje a pomůcky LightCycler 480 II (Roche) Centrifuga Sigma1-15 Sada pipet: s rozsahem nastavitelným od 1000 5000 µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od 200 1000 µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od 20 200 µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od 5 50 µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od 0,5 10 µl (s chybou do 5%) Špičky s filtrem k pipetám s příslušným rozsahem Lednička Mraznička (-20 C) Centrifuga MiniSpin Vortex V-1 Plus 2.3 Chemikálie a roztoky 2.3.1 Master Mix LightCycler 480 Probes Master (Roche), katalogové číslo 04 887 301 001. Master Mix je nutné skladovat při teplotě od -25 C do -15 C, neměl by se opakovaně rozmrazovat a zamrazovat. Po prvním rozmražení je možné Master Mix skladovat do 4 týdnů při teplotě od 2 C do 8 C.

2.3.2 Voda pro PCR Pro ředění všech komponent qpcr reakce se používá voda LightCycler 480 Probes Master H 2 O, PCR-grade (Roche). PCR voda je součástí balení Master Mixu. Při delším skladování by měla být uchovávána při teplotě od -25 C do -15 C. 2.3.3 Carrier DNA Pro zamezení ztrát při nízkých koncentracích cílové DNA se používá tzv. nosičová (angl. carrier) DNA. Pro ředění kvantifikačního gradientu byla jako carrier DNA použita DNA z rybích spermií (SERVA Electrophoresis, kat. č. 1858001) v koncentraci 50 ng/µl. 2.3.4 Ředění primerů a sond Primery a sondy se dodávají v lyofilizovaném stavu od firmy VBC Biotech (Německo). Podle návodu uvedeného výrobcem jsou na pracovišti rozpuštěny v PCR vodě tak, aby výsledná zásobní koncentrace byla 100 pmol/µl. Primery a sondy jsou evidovány a uloženy v mrazničce při teplotě -20 C ± 4 C. Sondy musí být uchovávány v tmavém obalu. 2.3.5 Příprava kvantifikačního standardu Při přípravě kvantifikačního plazmidového standardu je výchozím roztokem plazmidový konstrukt, který byl připraven naklonováním amplifikovaného PCR produktu pro cíl č. 1 do pdrive Cloning Vector (Qiagen) a transformován do chemokompetentních buněk Escherichia coli. Po selekci pozitivních kolonií a pomnožení byly plazmidové inzerty ověřeny sekvenováním. Zásobní kultury Escherichia coli obsahující plazmidové konstrukty jsou skladovány při -70 C ± 4 C. U potvrzených plazmidů se určí koncentrace a čistota pomocí měření absorbance. Ze zásobního roztoku plazmidů se desítkovým ředěním připravuje standardní gradient v rozmezí 1 10 6 až 1 10 0 kopií/µl. Plazmidový gradient se ředí v TE pufru s přídavkem carrier DNA 50 ng/µl a je skladován při teplotě -20 C ± 4 C do vypotřebování. 2.3.6 Příprava premixu pro qpcr Pro reprodukovatelnou detekci a kvantifikaci pomocí qpcr je doporučeno připravit si alikvoty premixů pro 100 reakcí skládající se ze všech komponent kromě templátové DNA. Premixy se skladují při cca -20 C ± 4 C. Alikvoty premixů lze opakovaně zamrazovat a rozmrazovat maximálně však 5.

Jednotlivé složky je doporučeno přidávat podle uvedeného pořadí: Složka 1 reakce 100 reakcí (96 + 4 rezerva) Výsledná koncentrace PCR voda 4,25 µl 425,0 µl LightCycler 480 Probes Master 2 10,0 µl 1000,0 µl 1 UNG (Roche) 0,2 µl 20,0 µl 1 U Primery F + R pro cíl č. 1 (100 pmol/µl každý) 2 0,05 µl 2 5,0 µl 250 nm každý Sonda pro cíl č. 1 - FAM (100 pmol/µl) 0,05 µl 5,0 µl 250 nm Primery F + R pro cíl č. 2 (100 pmol/µl každý) 2 0,05 µl 2 5,0 µl 250 nm každý Sonda pro cíl č. 2 - HEX (100 pmol/µl) 0,05 µl 5,0 µl 250 nm Primery F + R pro IAC (100 pmol/µl každý) 2 0,05 µl 2 5,0 µl 250 nm každý Sonda pro IAC - Cy5 (100 pmol/µl), 0,05 µl 5,0 µl 250 nm IAC (1 10 4 kopií/µl) 0,1 µl 10,0 µl 1 10 3 kopií DNA 5,0 µl 100 5,0 µl celkem 20 µl 2000 µl 2.4 Postup zkoušky 2.4.1 Bezpečnostní opatření Provedení metody nevyžaduje žádné zvláštní bezpečnostní opatření. 2.4.2 Okolní podmínky zkoušky Provedení metody nevyžaduje kontrolu žádných limitních podmínek. 2.4.3 Množství vzorku Do každé jamky je napipetováno 15 µl premixu a 5 µl templátové DNA. 2.4.4 Slepý pokus 2.4.4.1 Negativní kontrola Jako negativní kontrola (no template control, NTC) je do qpcr reakce přidána voda pro PCR v ekvivalentním množství. Negativní kontrola musí být použita v každém experimentu.

2.4.4.2 Pozitivní kontrola Použití pozitivní kontroly je doporučeno v každém experimentu. Jako pozitivní kontrola je používán plazmidový standard používaný pro kvantifikaci vzorku. Alternativně, především při kvalitativní analýze, je možné použít jako pozitivní kontrolu genomovou DNA typového kmene Brucella (např. typový kmen B. abortus CAPM 5660/ ATCC 15804/ NCTC 10093/ CIP 65.1/ NIAH 544). 2.4.5 Replikáty Každý vzorek, včetně kontrol, se analyzuje nejméně v duplikátu. Kvantifikace je platná pouze pokud je odečet Cq proveden v rozsahu kvantifikačního plazmidového gradientu, v případě koncentrace vyšší než 10 6 GE/reakci je nutné vzorek naředit. 2.4.6 PCR protokol přístroj: LightCycler 480 II (Roche) 1 cyklus Úvodní denaturace 95 C (7 min) 45 cyklů Denaturace 95 C (10 s) Annealing/ Elongace 60 C (30 s) Acquisition Mode: single 72 C (1 s) 3 Výpočet a vyjádření výsledku 3.1 Hodnocení výstupu 3.1.1 Kvalitativní hodnocení Kvalitativní hodnocení se provádí podle následující tabulky: Cíl č. 1 (Kanál FAM) Cíl č. 2 (Kanál HEX) IAC (Kanál Cy5) Celkový výsledek Pozitivní Pozitivní Pozitivní Vzorek je pozitivní na Brucella spp. Pozitivní Pozitivní Negativní Vzorek je pozitivní na Brucella spp. Negativní Negativní Pozitivní Vzorek je negativní na Brucella spp. Pozitivní Negativní Pozitivní Nejednoznačný

výsledek, nutno ověřit Negativní Pozitivní Pozitivní Nejednoznačný výsledek, nutné ověřit Negativní Negativní Negativní Vzorek je inhibován 3.1.2 Kvantitativní hodnocení Určení množství Brucella spp. v reakci se provádí pomocí metody absolutní kvantifikace na základě kalibrační křivky (Standard Curve Method). Kvantifikace se provádí přes cíl č. 1, který se odečítá v kanálu FAM. Cíl č. 1 se vyskytuje v genomu brucely v jedné kopii, proto počet kopií cíle č. 1 odpovídá počtu buněk Brucella spp. ve vzorku. Odpovídající počet buněk se určuje z kalibrační křivky pomocí hodnoty Cq. Metodika detekce Brucella spp. byla testována na izolaci DNA z matric, které jsou relevantní k výskytu původců. Izolace DNA z tkání a mléka je založena na soupravě DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) s modifikacemi dle Slana et al. (2008 a 2009). Tyto postupy izolace DNA byly použity také stanovení limitu detekce. Určení množství buněk Brucella spp. ve vyšetřovaném vzorku tkáně se provádí přepočtem podle následujícího vzorce: množství buněk Brucella spp. na 1 g tkáně = počet kopií cíle č. 1 v reakci 20 a /50 b a pokud je templátová DNA izolována podle SOP na izolaci DNA z tkání, množství použité v PCR reakci odpovídá 1/20 elučního objemu. Ztráty při izolaci DNA se do kalkulace nezapočítávají. b Výchozím množstvím tkáně je 50 mg, počet buněk B. abortus/1 mg tkáně představuje 1/50 navážky. Určení množství buněk Brucella spp. ve vyšetřovaném vzorku mléka se provádí přepočtem podle následujícího vzorce: množství buněk Brucella spp. na 1 ml mléka = počet kopií cíle č. 1 v reakci 20 a /50 b

a pokud je templátová DNA izolována podle SOP na izolaci DNA z tkání, množství použité v PCR reakci odpovídá 1/20 elučního objemu. Ztráty při izolaci DNA se do kalkulace nezapočítávají. b Výchozím množstvím mléka je 50 ml, počet buněk B. abortus/1 ml mléka představuje 1/50 objemu. 4 Validace Validace qpcr systému byla provedena podle doporučení uvedených v (Raymaekers et al., 2009) a (Friedecký et al., 2004). 4.1 Specifita Navržené sekvence oligonukleotidů byly porovnány pomocí algoritmu BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Všechny primery a sondy měly 100% homologii s klinicky významnými referenčními sekvencemi zastoupenými v databázi a současně nevykazovaly homologii s jinými organismy. Systém byl testován na sbírkových kmenech B. abortus (CAPM 5660, 5520), B. melitensis (CAPM 5659, 5529), B. ovis (CAPM 6467, 6372), B. suis (CAPM 6047), B. inopinata (CAPM 6436), B. canis (CAPM 6468) a B. microti (CAPM 6434, 6435). 4.2 Optimalizace reakčních podmínek Koncentrace jednotlivých primerů a sond byla optimalizována tak, aby poskytovala co nejnižší hodnoty Cq, co nejvyšší R n a nedocházelo k amplifikaci jednoho cíle na úkor druhého. IAC byla optimalizována tak, aby byly přednostně amplifikovány a detekovány cílové sekvence. cíl č. 1 cíl č. 2 IAC

Tvorba primer-dimerů a nespecifických produktů byla zkontrolována pomocí meltingové analýzy. Výsledný produkt byl ověřen sekvenováním. cíl č. 1 cíl č. 2 IAC 4.3 Charakteristiky PCR reakcí Analytické meze byly stanoveny podle Bustin et al., (2009). 4.3.1 Citlivost/limit detekce (LOD) LOD je určena jako koncentrace, kterou je pomocí daného testu možné detekovat s 95% mírou pravděpodobnosti. Pokud bereme v úvahu Poissonovu distribuci, nejnižší teoreticky možný LOD pro qpcr jsou 3 kopie/pcr reakci (Wittwer et al., 2004). 4.3.1.1 LOD Brucella spp. ve tkáních Citlivost byla stanovena umělou kontaminací bráničních pilířů usmrcenými buňkami B. abortus (CAPM 5660). Izolace DNA byla provedena postupem izolace DNA podle Slana et al. (2009). Výpočet teoretického počtu buněk B. abortus byl proveden podle rovnice z bodu 3.1.2.

Ředění Teoretický počet buněk B. abortus/mg tkáně cíl č. 1 cíl č. 2 Počet pozitivních Teoretický počet vzorků/ celkový počet buněk B. analyzovaných vzorků abortus/mg tkáně Počet pozitivních vzorků/ celkový počet analyzovaných vzorků 1 200,00 8/8 200,00 8/8 2 100,00 8/8 100,00 8/8 3 50,00 8/8 50,00 8/8 4 25,00 8/8 25,00 8/8 5 12,50 7/8 12,50 8/8 6 6,25 1/8 6,25 2/8 7 3,10 2/8 3,10 4/8 8 1,56 1/8 1,56 2/8 9 0,78 0/8 0,78 0/8 10 0,31 0/8 0,31 0/8 LOD pro cíl č. 1 je mezi 25 buněk B. abortus/1 mg tkáně a pro cíl č. 2 je 13 buněk B. abortus/1 mg tkáně. 4.3.1.2 LOD Brucella spp. v mléce Citlivost byla stanovena umělou kontaminací mléka usmrcenými buňkami B. abortus (CAPM 5660). Izolace DNA byla provedena postupem izolace DNA podle Slana et al. (2008). Výpočet teoretického počtu buněk B. abortus byl proveden podle rovnice z bodu 3.1.2. Ředění Teoretický počet buněk B. abortus/ml mléka cíl č. 1 cíl č. 2 Počet pozitivních Teoretický počet vzorků/ celkový počet buněk B. analyzovaných vzorků abortus/ml mléka Počet pozitivních vzorků/ celkový počet analyzovaných vzorků 1 200,00 8/8 200,00 8/8 2 100,00 8/8 100,00 8/8 3 50,00 8/8 50,00 8/8 4 25,00 8/8 25,00 8/8 5 12,50 8/8 12,50 8/8 6 6,25 3/8 6,25 8/8 7 3,10 2/8 3,10 4/8 8 1,56 1/8 1,56 2/8 9 0,78 0/8 0,78 0/8 LOD pro cíl č. 1 je mezi 13 buněk B. abortus/1 ml mléka a pro cíl č. 2 je 6 buněk B. abortus/1 ml mléka.

4.3.2 Opakovatelnost (Repeatability) Teoretické Získané množství kopií/ reakci b Počet pozitivních vzorků/ celkový množství kopií/reakci a průměr SD průměru počet analyzovaných vzorků 1000000 805471 11230 6/6 100000 88550 4525 6/6 10000 11384 159 6/6 1000 1156 27 6/6 100 146 11 6/6 10 12 3 6/6 1 1 1 3/6 a Množství kopií kvantifikačního plazmidového standardu na 5 µl qpcr reakce. b Skutečné množství kopií bylo získáno podle příslušné kalibrační křivky zařazené v každém qpcr experimentu a následně byl spočítán průměr a směrodatná odchylka. 4.4 Kruhový test Vzorky na kruhový test byly připraveny na VÚVeL umělou kontaminací masa a mléka lyzátem buněk B. abortus. Izolace DNA a qpcr byly provedeny podle postupu popsaného v této certifikované metodice. Vzorek Teoretický počet buněk B. abortus/ml mléka Získaný počet buněk B. abortus/ml mléka nebo mg tkáně nebo mg tkáně VÚVeL ÚVVÚ Hlučín B1 tkáň 10 4 10 5 10 4 B2 mléko 10 2 10 3 10 2 (+10 8 Listeria monocytogenes) B3 mléko 10 2 10 2 10 2 B4 tkáň 10 6 10 7 10 7 B5 tkáň 10 6 10 6 5x10 6 B6 tkáň negativní 10 2 10 2 B7 tkáň 10 5 10 7 5x10 4 B8 mléko 10 4 10 6 5x10 4 B9 mléko negativní negativní negativní B10 mléko 10 4 (+10 8 Listeria monocytogenes) 10 5 10 5 K+ 10 4 5x10 5 10 4 K- negativní negativní 10 1 NTC negativní negativní negativní Výsledky kruhového testu potvrdily použitelnost metodiky v rutinní laboratorní praxi.

5 Operativní řízení jakosti Je řešeno: 1) pomocí pozitivní a negativní kontroly, 2) interní amplifikační kontrolou (IAC), 3) detekcí dvou nezávislých cílů. III) SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Tato metodika je inovativní v kombinaci detekce dvou nezávislých cílů specifických pro Brucella spp. a interní amplifikační kontroly. Tato kombinace tak umožňuje spolehlivou identifikaci brucely ve vyšetřovaném vzorku a současně umožňuje vyloučit falešně negativní výsledek v důsledku přítomnosti inhibitorů. Pomocí kvantifikačního gradientu je možné určit bakteriální zátěž. Zároveň je pro tuto metodiku otestována metoda izolace DNA a jsou ustanoveny parametry limitu detekce. Předložená metodika byla vyvinuta s ohledem na požadavky ÚVVÚ v Hlučíně. Umožňuje komplexní přístup k detekci a kvantifikaci všech patogenních druhů Brucella spp. a je použitelná pro široké veterinární i humánní využití. IV) POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY Metodika je určena k rychlé diagnostice a kvantifikaci Brucella spp. z klinických vzorků a vzorků potravin. V) SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY Bustin et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin Chem 55 (2009) 611-622. Franco MP, Mulder M, Gilman RH, Smits HL. Human brucellosis. Lancet Infect Dis. 7 (2007) 775-86. Friedecký et al. Validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích (online). Česká společnost klinické biochemie, Datum vydání: 16. 11. 2004, dostupné z: http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--validace-a-verifikace-metod#06, (cit 2013-11- 14).

Raymaekers M et al. Checklist for optimization and validation of real-time PCR assays. J Clin Lab Anal, 23 (2009) 145-151. Rozen S, Skaletsky HJ. Primer3, (1998), dostupné z: http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html Slana I et al. On-farm spread of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in raw milk studied by IS900 and F57 competitive real time quantitative PCR and culture examination. International Journal of Food Microbiology, 128 (2008) 250-257. Slana I et al. Distribution of Mycobacterium avium subsp. avium and M. a. hominissuis in artificially infected pigs studied by culture and IS901 and IS1245 quantitative real time PCR. Vet Microbiol, 144 (2010) 437-443. William S et al. Real-Time Multiplex PCR Assay for Detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J Clin Microbiol, 42(3) (2004) 1290 1293. Wittwer CT et al. eds. Molecular microbiology: diagnostic principles and practice (2004) 71-84, ASM Press Washington. Young EJ. Brucella Species. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Disease. 7th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Churchill Livingstone; (2009) chap 226. Oponenti certifikované metodiky: mjr. MVDr. René Gilar Odbor akreditované laboratoře Vojenský veterinární ústav Hlučín Opavská 29 748 11 Hlučín Telefon: +420 973 487 308 E-mail: kuskusrg@seznam.cz Prof. MVDr. Alois Čížek, CSc. Ústav infekčních chorob a mikrobiologie Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého tř. 1/3 612 42 Brno Telefon: +420 54156 2274 E-mail: cizeka@vfu.cz