M30-Apoptosense ELISA

M30-Apoptosense ELISA REF 10010 Návod k použití PEVIVA AB Strömkarlsvägen 82, SE-167 62 Bromma, Sweden Phone: +46 (0)8 122 053 00; Fax: +46 (0)8-713 16 10 Website: www.peviva.se; E-mail: info@peviva.se Distribuce v ČR a SR: VIDIA spol. s r.o. Nad Safinou II/365, Vestec u Prahy, 252 42 Jesenice, Česká republika Telefon: +420 261 090 565 Fax: +420 261 090 566 Web: www.vidia.cz, E-mail: info@vidia.cz

strana 2

Návod k použití M30 Apoptosense ELISA Obsah Význam symbolů uvedených na štítku 4 Ochranné známky 4 Patenty 4 Transport a skladování 4 Použití 5 Úvod a vysvětlení testu 5 Princip metody 5 Materiál dodaný pro 96 stanovení 6 Další potřebný materiál nedodávaný výrobcem 7 Provedení testu 7 Varování a opatření týkající se uživatele 7 Sběr a příprava vzorků z periferní krve 7 Sběr a příprava vzorků při in vitro experimentech pro výzkumné účely 8 Příprava reagencií 9 Skladování a trvanlivost reagencií po otevření 9 Provedení testu 10 Postupový diagram 11 Zpracování výsledků 11 Technické parametry testu 12 Odvození standardu 12 Vnitřní kontrola kvality 12 Omezení testu 13 Odkazy na literaturu 13 Záruka 13 strana 3

Význam symbolů uvedených na štítku Katalogové číslo Obsahuje množství dostatečné pro n testů Číslo šarže Výrobce Teplotní rozsah Použitelné do Ochranné známky M30-Apoptosense a M65 jsou registrované ochranné známky společnosti PEVIVA AB. Tween 20 je registrovanou ochrannou známkou společnosti ICI America, Inc. Patenty U.S. Patent No. 6,296,850 a 6,716,968 a 6,706,488. Evropský patent No. EP 1,019,438 Japonský patent No. 4372340 Transport a skladování Podle návodu k použití M30-Apoptosense ELISA je dodávána chlazená a měla by být skladována při teplotě 2-8 C. Poznámka! Nezmrazujte! strana 4

Popis testu Použití M30-Apoptosense ELISA je jednokrokový immunoanalytický test pro in vitro měření koncentrace kaspázou naštěpeného keratinu 18, který vzniká v souvislosti s apoptózou buněk (cck18, K18Asp396 nebo M30 neo-epitop), ve vzorcích séra a plazmy. Úvod a vysvětlení testu Během apoptózy štěpí kaspázy různé buněčné proteiny. V epiteliálních buňkách je kaspázami štěpen také protein intermediárních filament keratin 18 (K18). Protilátka M30 rozeznává neo-epitop vznikající v místě štěpění K18 kaspázou za aspartámovou kyselinou na pozici 396 (odkaz č. 1). Ke štěpení kaspázou 9 dochází v časných fázích apoptózy a dále také kaspázou 3 a kaspázou 7 v rozkladné fázi apoptózy (odkaz č. 2). M30-Apoptosense ELISA měří koncentraci kaspázou naštěpených fragmentů K18 (cck18 caspase cleaved K18) obsahujících K18Asp396 neo-epitop. Při indukci apoptózy epiteliálních buněk je nejdříve pozorovatelné zvýšení hladiny cck18 fragmentů v lyzátu z buněk. Uvolnění antigenu do extracellulárního prostoru se projevuje později, a to vlivem sekundární nekrózy apoptotických měchýřků. Zvýšení hladiny cck18 fragmentů během apoptózy je tlumeno přidáním inhibitoru kaspáz zvadfmk (odakz č. 3). M30-Apoptosense ELISA může být použita v kombinaci s M65 ELISA (PEVIVA Prod. No. 10020), která měří koncentraci celkového K18. Kombinace obou testů je obzvláště vhodné pro zjištění typu buněčné smrti (odkaz č. 4). M30-Apoptosense ELISA dokáže měřit pouze cck18 fragmenty lidského původu, nedetekuje myší, krysí anebo psí cck18 (odkaz č. 5). M30-Apoptosense ELISA bude specificky detekovat apoptózu buněk lidských nádorových xenotranplantátů na myších anebo krysích modelech. M30-Apoptosense ELISA je používána ve výzkumu a klinických testech v oblastech onkologie, hepatologie, transplantační medicíny a výzkum sepse. Princip metody M30-Apoptosense ELISA je sendvičový imunoanalytický test na pevné fázi s enzymatickou detekcí. Standardy, kontroly a vzorky reagují s imobilizovanou vazebnou protilátkou M5, která je namířena proti K18, a s konjugátem HRP (křenová poeroxidáza) s protilátkou M30, která je namířena proti K18Asp396 neo-epitopu. Nenavázaný konjugát je odstraněn v promývací fázi testu. Přidáním TMB substrátu dojde k rozvoji barevné reakce. Po zastavení reakce je odečtena absorbance. Výsledné zbarvení je přímo úměrné koncentraci analytu. strana 5

Při vytvoření standardní křivky vynesením známých koncentrací na naměřené absorbanci je možné spočítat množství antigenu v testovaných vzorcích. Koncentrace antigenu je udávána v jednotkách (unit) na litr (U/L). Materiál dodaný pro 96 stanovení Mikrostripy potažené protilátkou M30: Jedna mikrotitrační destička, 96 vysušených jamiček (12x8). Jamičky jsou potažené myší monoklonální protilátkou M5 namířenou proti K18. Mikrotitrační destička je zatavená v hliníkovém sáčku, který uvnitř obsahuje prostředek pro pohlcování vlhkosti. Jestliže nepoužijete všechny stripy najednou, vraťte nepoužité stripy do sáčku společně s prostředkem pro pohlcování vlhkosti. Připravené k použití! Konjugát M30-HRP: Koncentrát (24x koncentrovaný). Jedna lahvička obsahující 0,4 ml konjugátu myšší monoklonální protilátky M30 (anti-k18asp396 neo-epitop) s křenovou peroxidázou (HRP) ve fosfátovém pufru s přidanými stabilizátory proteinů. Nařeďte ředícím pufrem pro M30 Konjugát. S přísadou konzervačních látek. Poznámka! Chraňte před světlem! Ředící pufr pro M30-HRP konjugát: Jedna lahvička obsahující 12 ml fosfátového pufru s přidanými stabilizátory proteinů určená pro naředění konjugátu M30-HRP. S přísadou konzervačních látek. Modře zabarvený. Připravené k použití. M30 Standardy A-G : Standard A obsahuje 4 ml fosfátového pufru s FTS (fetální telecí sérum). Standardy B-G, každý 0,5 ml, obsahují standard rozpuštěný ve fosfátovém pufru s FTS. Hodnoty standardů A-G jsou 0, 75, 150, 250, 500, 750 a 1000 U/L, respektive. S přísadou konzervačních látek. Žlutě zabarvené. Připravené k použití! Vzorky s koncentrací vyšší než 1000 U/L mohou být ředěny 1:1 pomocí Standardu A, ale doporučujeme ředit vzorky směsným lidským sérem (podrobně v sekci Funkční parametry testu ) M30 Kontroly, Nízká a Vysoká: Dvě lahvičky s 0,5 ml roztoku obsahujícím reaktivní látku ve fosfátovém pufru s FTS. Koncentrační rozmezí hodnot pro Nízkou a Vysokou kontrolu je vyznačené na lahvičkách. S přísadou konzervačních látek. Žlutě zabarvené. Připravené k použití. TMB substrát: Jedna lahvička obsahující 22 ml roztoku TMB (3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine). Poznámka! Chraňte před světlem! Připravené k použití. Stop roztok: Jedna lahvička obsahující 8 ml 1,0 M kyseliny sírové. Připravené k použití! Promývací roztok: 1 lahvička obsahující 50 ml koncentrovaného (10x koncentrovaný) Promývacího roztoku. Před použitím nařeďte přidáním 450 ml destilované vody. Naředěný pufr obsahuje 0,014 M fosfátový pufr, 0,15 M chlorid sodný a 0,1 % Tween -20. S přísadou konzervačních látek. Lepící fólie : jeden list Návod k použití. Certifikát strana 6

Další potřebný materiál nedodávaný výrobcem ELISA reader (vlnová délka 450 nm, lineární rozsah 0-3 OD) Třepačka mikrotitračních destiček (oscilace~600 rpm, výkyv 1,54 mm) Promývačka mikrotitračních destiček nebo multikanálová pipeta (objem 250 µl) Vortex Automatické pipety : 25, 50, 75 a 200 μl Odměrný válec (500 ml) Deionizovaná voda Provedení testu Varování a opatření týkající se uživatele M30-Apoptosense ELISA je určena pouze pro in vitro použití. Nekombinujte reagencie z různých šarží kitu. Všechny pacientské vzorky považujte za infekční materiál. Zacházejte s nimi a likvidujte je podle příslušných předpisů. Nepoužívejte vzorky, které jsou kontaminované. Stop roztok obsahuje 1.0 M kyselinu sírovou, která může způsobovat poleptání kůže a očí. V případě potřísnění opláchněte velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc. Bezpečností listy jsou k dispozici na internetových stránkách www.peviva.se nebo na vyžádání u distributora. Sběr a příprava vzorků z periferní krve Minimální odebíraný objem by měl být dostatečný pro změření každého vzorku v duplikátech (testovací objem 2x25 μl). Není nutné, aby byl dárce před odběrem nalačno. Sérum : Odeberte krev venepunkcí do zkumavek bez antikoagulačních přísad, oddělte sérum od krevních buněk. Plazma : M30-Apoptosense ELISA lze použít i pro vzorky plazmy (EDTA, heparin anebo citrát). Poznámka! Pro daný projekt používejte vždy stejný typ materiálu, tj. sérum anebo plazmu se shodným antikoagulans. Pro další informace o použitelnosti M30-Apoptosense ELISA pro jiný typ vzorků se prosím obraťte na distributora nebo navštivte internetovou stránku www.peviva.se. Vzorky lze skladovat při teplotě 4-8 ºC po dobu 4 hodin. Pro dlouhodobé skladování uchovávejte vzorky při teplotě -20ºC anebo nižší. Vzorky lze zmrazit a rozmrazit bez ztráty aktivity, přesto nedoporučujeme opakované zmrazování a rozmrazování vzorků. Ředění vzorků je popsáno v sekci Funkční parametry testu. strana 7

Sběr a příprava vzorků při in vitro experimentech pro výzkumné účely Příprava materiálu z buněčných linií Pro většinou aplikací je výhodné měřit reaktivitu M30 (cck18) v jedné, konečné fázi experimentu. Taková měření poskytují ucelený obraz o proběhlé apoptóze. Pro tento typ měření přidávejte neionické detergenty přímo do kultivačního media pěstovaných buněk a změřte celkovou koncentraci cck18 (směs cck18 z buněk a z kultivačního media). Den 1 : Nasaďte buňky. Množství nasazovaných buněk je pro daný určitý typ buněk a druh testovaného cytotoxického agens různé; obyčejně je přiměřené množství mezi 5.000-10.000 buněk na jamičku v 96-ti jamkové kultivační destičce. Den 2 : Buňky opláchněte PBS a přidejte čerstvé medium (200 µl/jamičku). Vystavte buňky účinkům požadovaného agens. Den 2-4 : Do každé jamky 96-ti jamkové destičky s 200 μl kultivačního media přidejte 10 µl 10% NP-40. Nechte za stálého třepání proběhnout buněčnou lýzu po dobu 5 minut při laboratorní teplotě. Jemně promíchejte lyzát pipetováním nahoru a dolů, opatrně, aby nevznikaly bubliny, a přeneste 2x25 μl media/lyzátu do ELISA jamiček potažených protilátkou M30. Příprava materiálu z kultivačního media M30 Apoptosense ELISA a M65 ELISA dovolují odhad způsobu buněčné smrti vypočítáním poměru mezi M30:M65 (odkaz č. 3). Pro tato měření byste jako vzorek měli použít kultivační medium! Poměr M30:M65 by měl být počítán při kalibraci na patřičné kontroly pro každou testovanou karcinomovou linii: tj. použití agens, o němž je známo, že způsobuje apoptózu (např. genotoxická agens, staurosporine) a/nebo hlavně nekrózu (např. glukózová deprivace nebo peroxid vodíku). Den 1/Den 2 : Nasaďte buňky, opláchněte a přidejte zkoumaná agens podle výše uvedeného postupu. Den 2-4: Odebírejte z jamek vzorky kultivačního media. Abyste předešli artefaktům, které způsobuje odpařování/vysychání media, doporučujeme neodebírat více vzorků z jedné jamičky. Medium stočte a odeberte buněk zbavený supernatant. Poznámka! Vyvarujte se nasátí buněk do špičky při odebírání supernatantu. Pro měření použijte 2x25 µl ze vzorku supernatantu. Vzorky můžete skladovat při 4-8 ºC, jestliže bude měření provedeno tentýž den. Vzorky zamýšlené k pozdějším vyšetření skladujte při teplotě -20 ºC nebo nižší. Vyvarujte se opakovanému zmrazování a rozmrazování. strana 8

Příprava reagencií Ředění Konjugátu M30-HRP Konjugát M30-HRP řeďte v ředícím pufru pro M30 konjugát. Lahvička s M30-HRP konjugátem obsahuje přesně 400 µl roztoku. Přidejte 9,2 ml ředícího pufru pro M30-HRP konjugát přímo do lahvičky a zamíchejte. Ředění Promývacího roztoku Promývací roztok je dodáván 10x koncentrovaný, Nařeďte Promývací roztok (50 ml) pomocí 450 ml čerstvé deionizované vody a promíchejte. Skladování a trvanlivost reagencií po otevření Jestliže nespotřebujete najednou celou soupravu, skladujte reagencie v jejich originálních obalech při 2-8ºC. Jestliže nespotřebujete všechny stripy, uzavřete zbylé stripy do sáčku a nezapomeňte vložit vysoušedlo. TMB substrát a M30-HRP konjugát jsou citlivé na světlo a na přítomnost kovových iontů a měly by být po celý čas mei experimenty skladovány při 2-8ºC ve svých originálních pro světlo nepropustných obalech. Jestliže použijete jiný obal, musíte zajistit ochranu obsahu před světlem. TMB roztok není použitelný po té, co byl vystaven světlu. Jestliže budete používat soupravu několikrát za sebou, skladujte naředěný M30- HRP konjugát při teplotě 2-8ºC. Chraňte před světlem. Naředěný M30-HRP konjugát je stabilní 3 týdny Naředěný promývací roztok je stabilní 5 týdnů při skladování za teploty 2-8ºC. strana 9

Provedení testu Všechny kroky testu M30-Apoptosense ELISA provádějte při laboratorní teplotě (24+/-3º). 1. Před použitím nechte všechny složky soupravy vytemperovat na laboratorní teplotu. Všechny reagencie před použitím promíchejte. 2. Nařeďte ředící roztok čerstvou deionizovanou vodou (viz. Příprava reagencií) a promíchejte. 3. Nařeďte M30-HRP konjugát v Ředícím pufru pro M30-konjugát (viz. Příprava reagencií) a promíchejte. 4. Napipetujte do jamiček á 25 µl M30 Standardů (A-G), M30 Vysoké kontroly, M30 Nízké kontroly a vzorků (doporučujeme měření v duplikátech). 5. Přidejte 75µl naředěného M30-HRP konjugátu do každé jamičky. Poznámka! Kroky č. 4 a č. 5 by měly následovat po sobě bez přerušení a během 20-ti minut. 6. Překryjte jamičky lepící folií nebo víčkem. 7. Inkubujte na třepačce po dobu čtyř (4) hodin. Nastavení třepání: 600 rpm. 8. Pětkrát promyjte destičku 400-450 µl/jamku (overflow) Promývacího roztoku pomocí automatické promývačky mikrotitračních destiček nebo promývejte manuálně, odsajte roztok z jamiček a pětkrát promyjte jamičky á 250 µl/jamku naředěného Promývacího roztoku. Vyvarujte se kontaminace mezi sousedními jamičkami. 9. Přidejte do každé jamičky 200 µl TMB substrátu. Inkubujte v temnu za labora torní teploty po dobu 20 minut +/- 1 minuta. 10. Přidejte do každé jamičky 50 µl Stop roztoku. Promíchejte obsah třepáním nebo poklepáváním na hranu mikrotitrační destičky po dobu 5-10 vteřin, abyste zajistili důkladné promíchání TMB substrátu a Stop roztoku. Ponechte destičku stát 5 minut před odečítáním absorbance. 11. Do 30 minut změřte absorbanci v ELISA readeru při 450 nm a zaznamenejte výsledky. 12. Spočítejte odpovídající hodnoty podle návodu v sekci Zpracování výsledků. strana 10

Postupový diagram Nařeďte M30-HRP konjugát a Promývací roztok, v tomto pořadí. Přidejte 75 µl M30-HRP konjugátu Napipetujte do jamiček 25 µl Standardů, Kontrol a vzorků Inkubujte 4 hodiny na třepačce (~600 rpm) Promyjte destičku v promývačce 5x 400-450 µl/well (overflow) nebo manuálně 5x 250 µl Přidejte do jamiček 200 µl TMB. Inkubujte v temnu po dobu 20 minut +/- 1 minuta Přidejte do jamiček 50 µl Stop roztoku. Třepejte 5-10 vteřin. Změřte absorbanci po 5 minutách. Zpracování výsledků Výsledky M30-Apoptosense ELISA jsou zpracovávány za použití počítače. Vypočítejte hodnoty v U/L pro Kontroly a vzorky použitím vhodného programu pro zpracování dat z testů ELISA. Příhodný algoritmus pro proložení křivky: (kubická interpolace-cubic spline). Osa X: Koncentrace (U/L); osa Y: Absorbance při 450 nm (A450). Poznámka! Jestliže jste vzorky ředili musíte vypočtené koncentrace vynásobit faktorem ředění, v případě, že bylo pro ředění vzorků použito sérum/plazma krevních dárců, musí být počítáno i s jejich koncentracemi M30. strana 11

Technické parametry testu Rozsah měřitelnosti: rozsah měření je 0-1000 U/L Vliv vysoké koncentrace (High dose effect): Nebyl pozorován žádný efekt vysoké koncentrace až do hodnot 50 000 U/L. Reprodukovatelnost: Intraassay (% koeficientu variability) variabilita je < 10%, interassay (% koeficientu variability) variabilita je <10% pro vzorky s koncentrací >100 U/L. Citlivost: Nejnižší detekovatelná koncentrace K18Asp396 neo-epitopu při použití M30-Apoptosense ELISA je 25 U/L. Detekční limit byl stanoven jako koncentrace M30, která odpovídá hladině průměrné absorbance Standardu 0 navýšené o dvě směrodatné odchylky průměru. Výtěžnost (spiking recovery): Standard dodávaný s testem obsahuje rekombinantní materiál, který se chová jinak než cck18 fragmenty ve vzorcích krve, tudíž jej nelze považovat za vhdoný pro testy výtěžnosti. Linearita/test ředění: Výtěžnost lidského séra ředěného M30 Standardem 0 (0 U/L): 116% (průměr) a 106-124% (rozsah hodnot). Výtěžnost lidského séra ředěného sérem od krevního dárce: 97% (průměr) a 81-106% (rozsah hodnot). Referenční rozmezí: Medián pro séra od 236 švédských krevních dárců byl 132 U/L a 95-percentil odpovídal hodnotě 260 U/L. Doporučujeme, aby si každá laboratoř ustanovila vlastní referenční rozmezí. Odvození standardu Jednotky měřené testem M30-Apoptosense ELISA jsou definovány pomocí syntetického peptidu, který obsahuje M30 a M5 epitop. 1 U/L = 1.24 pm (odkaz č. 8). Vnitřní kontrola kvality Dodávané kontroly s určenými koncentracemi (Vysoká a Nízká kontrola) by měly dostačovat k ověřování funkčnosti testu a měly by být zařazené při každém provádění testu, a to minimálně v duplikátech. Jestliže je tento postup ověřování funkčnosti nedostačující, tak si bude muset příslušná laboratoř vytvořit vlastní kontrolní vzorky podle návodu v sekci Sběr a příprava vzorků při in vitro experimentech pro výzkumné účely anebo postupem podle vlastní laboratorní praxe. Tyto kontrolní vzorky by měly být udržovány zmrazené v aliquotech a při provádění testu by s nimi mělo být zacházeno pokaždé stejným způsobem. strana 12

Omezení testu Klinický význam měření koncentrace cck18 ve vzorcích krve jako prognostického indikátoru anebo pro sledování terapeutického postupu nebyl doposud plně ověřen. Silně lipemické ( 1250 mg/dl], ikterické ( 12,5 mg/dl) nebo hemolyzované ( 100 mg/dl) vzorky nemají vliv na výsledek testu. Odkazy na literaturu 1. Leers et al., J Pathol. 187,1999, 567. 2. Schutte et al., Exp Cell Research 297, 2004, 11. 3. Hägg et al., Invest New Drugs 20, 2002, 253. 4. Kramer et al., Cancer Res 64, 2004, 1751. 5. Olofsson et al. Cancer Biomarklers 5, 2009, 117. 6. Graystoke et al., Ann Oncol 19,2008,990. 7. Olofsson et al. Clin Cnacer Re 13, 2007, 3198. 8. Uenao et al., Eur J Cancer 39, 2003, 769. Pro další literaturu a informace prosím navštivte webovou stránku www.peviva.se/ literature.apsx anebo www.vidia.cz. Záruka Data uvedená v odstavci o technických parametrech testu byla získána postupem popsaným v návodu k použití. Jakékoliv změny anebo odchylky od postupu doporučeného PEVIVA AB mohou ovlivnit výsledky. V takovém případě se PEVIVA AB zříká odpovědnosti poskytovat všechny záruky za jakost výrobku, včetně těch, které vyplývají ze zákona, tj. záruky za obchodovatelnost a vhodnost pro určitý účel. V takovém případě neodpovídá PEVIVA AB ani její autorizovaní distributoři za přímé či nepřímé škody vzniklé v souvislosti s používáním výrobku. strana 13

Produkty firmy PVEIVA ELISA testy M30 Apoptosense ELISA M65 ELISA Číslo produktu 10010 Číslo produktu 10020 M30 Cytodeath ELISA M65 EpiDeath ELISA Číslo produktu 10900 Číslo produktu 10040 Protilátky M30 CytoDeath -Nekonjugovaná Číslo produktu 10700 -Biotin Číslo produktu 10750 -Fluorescein Číslo produktu 10800 -Orange Číslo produktu 10830 -Red Číslo produktu 10850 M5 Keratin 18 Číslo produktu 10600 M6 Keratin 18 Číslo produktu 10650 Verze: 90015 Datum originálního vydání: 2010-06-04 Překlad: 2010-12-12 strana 14