Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice Plíšková L., Kutová R., Bolehovská R., Ryšková L. ÚKBD, ÚKM FN Hradec Králové FONS 2012
Široké použití v mikrobiologii Identifikace mikroorganizmů (bakterie, houby) kultivace Vyhledávání mutací spojených s rezistencí a léčbu (antivirotika CMV, HSV, HBV, HCV, HIV ; antibiotika MRSA ) Epidemiologie Identifikace nových virů
Identifikace mikroorganizmů Provádění specifických PCR reakcí - cílená diagnostika, využití specifických primerů umožňujících detekci konkrétní bakterie Provádění broad-range širokospektré, panbakteriální, panfungální PCR s následnou sekvenací dle Sangera - primery z oblasti 16S rrna (18S) společné všem bakteriím (houbám) - spektrum obdobné jako při mikroskopii nebo kultivacích!! nahrazuje ji v případech, kdy kultivovat nelze
Sekvenační analýza Využití v diagnostice mikroorganizmů - často dlouhodobá ATB terapie PCR diagnostika zásadní pro nalezení původce -biofilmy - dg. endokarditid na chlopenních náhradách - periprotetické infekce - infekce drenážních likvorových systém tkáně, punktáty (kolene), abscesy plodová voda, likvor atd. krev??? moč???, BAL???
PCR/sekvenace Extrakce DNA, PCR, gelová elfo Čištění PCR produktu po PCR Sekvenační PCR s forward/reverse primerem Čištění po sekvenační PCR před vlastní sekvenací Sekvenace (ABI 3130) kapilární elektroforéza Sekvence ve FASTA formátu TCTGGTATCCCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAG TATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTA CGATCGGTTTTCTGGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTGGCTACCCTCTGTACCGACCATTGTATGACG TGTGAAGCCCTGGTCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG Zhodnocení
Analytické hodnocení výsledku Hledá se shoda s referenčními sekvencemi bakterií FASTA formát získané sekvence se vkládá do 3 databází volně přístupných na internetu - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - RDPII (Ribosomal Database Project) - SepsiTest BLAST (Identification by 16S/18S rdna Sequence Analysis) a automaticky se vyhodnocuje Výsledek bakterie se 100% pravděpodobností identifikace ve všech 3 použitých databázích
Interpretace výsledků Zásadní je rozhodnout, zda určená bakterie je: Patogen (etiologický původce, příčina onem.) Kontaminující nebo kolonizující bakterie (neidentifikovatelný, nekultivovatelný, všudypřítomný nebo bez bez patogenity u lidí a zvířat) Je nutné zvážit: - klinické (anamnestické údaje, imunita pacienta, klinický a biochemický profil, odpověď na ATB) odběr vzorku před/po ATB, místo odběru Nutná spolupráce s mikrobiologem a klinikem!
Případ č. 1 68-letý pacient Dg. akutní a subakutní infekční endokarditida 9.3.2010 Materiál k vyšetření aortální chlopeň PCR + sekvenace 12.3.2010 výsledek : Enterococcus faecalis Kultivace 16.3.2010 aerobní negativní anaerobní kmen k dourčení
Případ č. 2 52-letý pacient Dg. akutní infekční endokarditida 9.8.2012 Materiál k vyšetření aortální chlopeň 10.8. PCR + sekvenace 14.8.2012 výsledek : Bartonella sp. Kultivace negativní sérologie hraniční protilátky
Případ č. 3 69-letý pacient (překlad z Nem. Chrudim) - dg. I339 akutní endokarditida - materiál: aortální chlopeň (2. 9.) - ÚKM- kultivace negativní(atb léčba) - PCR + sekvenace duální infekce nejsme schopni určit překrytí sekvencí specif. PCR SA, + další patogen??? (HK - nem. Chrudim Enterococcus)
Případ č. 4 41-letá pacientka Několika měsíční bolesti v laterální části levého stehna bez úrazu, MRI suspekce na tumor zhoršení stavu, sepse, nález abscesů okolo femuru a osteomyelitidy, nasazena ATB kultivace G- vláknité tyče, změna ATB (i na anaeroby), nepotvrzeny zdroj??? - PCR specif. PCR (TBC + atyp.) negat. - PCR + sekvenace Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum změna ATB, zlepšení stavu, postupně se upravil
Případ č. 5 28-letý pacient - Přijat na infekční kliniku jako septický stav nejasné etiologie Dg.: susp. IMO?, pneumokoková infekce? Odběr krve na PCR, HK + aglutinace (negat. NM, HI, SP), zahájena ATB léčba - Po 2 dnech. zhoršení stavu, UPV, CRP 322 provedena detekce panbakteriální DNA v krvi, moči pozitivní, sekvenačně Streptococcus suis streptokoková sepse s multiorgánovým selháním, PNC kryst. postupné zlepšení stavu. kultivace obtížná, později po několika dnech narostlo několik kolonií, které nelze dourčit
Pyrosekvenování Využití hdna, mikroby, zvířecí a rostlinná DNA Začíná se objevovat v klinickém použití zejména hdna Pro rutinní v mikrobiologii použití chybí protokoly, validace, programy pro zpracovávání výsledků výzkum, studie, granty Sekvenátory vyšší generace (NGS) (Roche454 FLX, Illumina, Solid Helicos, IonTorrent, GS Junior )
Pyrosekvenování v mikrobiologii Hlavní rozdíl: více pacientů současně více sekvencí (nevýhoda naplnění kapacity přístroje) Citlivost detekuje minimální množství mikroorganizmů i na pozadí jiných Umožní analyzovat spektrum mikroorganizmů v jakémkoli materiálu či prostředí
Rozdíly mezi Sangerem a NGS Sangerovo sekvenování vznik fragmentů DNA o různé délce, kapilární elektroforéza, seřazení dle velikosti, detekce značených nukleotidů, přečtení kolem 500 bazí, vždy 1 sekvence NGS syntetická reakce v pyrosekvenátoru syntéza celého vlákna přímo v jamkách destičky
Princip sekvenování podle Sangera Rozdělení podle velikosti jednotlivých sekvencí DNA pomocí kapilární elektroforézy (v 1 kapiláře), automatizováno
Princip pyrosekvenování
Pyrosekvenování Výstup dat ze sekvenátorů změť sekvencí, soubor různých sekvencí Zhodnocení -rozdělení dat pro jednotlivé vzorky (rozlišení pacientů) - clustely konsensuálních sekvencí různé skupiny sekvencí, různý počet čtení důležité zvolit citlivost (dle počet čtení) - vkládání do BLASTu identifikace - interpretace dat
Mikrobiom recta rectum počet čtení celkem 2000 mikroorganismy počet čtení zastoupení v % Streptococcus anginosus 800 40,12% Parasutterella excrementihominis 167 8,38% Streptococcus agalactiae 108 5,42% Lactobacillus acidophilus 97 4,86% Dialister micraerophilus 57 2,86% Bilophila wadsworthia 40 2,01% Parvimonas micra 40 2,01% Celkem 78 mikroorganizmů Mikrobiom cervixu cervix počet čtení celekm 1600 mikroorganismy počet čtení zastoupení v % Lactobacillus iners 1155 68,18% Gardnerella vaginalis 374 22,08% Atopobium vaginae 23 1,36% Aerococcus christensenii 16 0,94% Parvimonas micra 2 0,12% Lactobacillus iners Gardnerella vaginalis Atopobium vaginae Aerococcus christensenii Parvimonas micra
Pyrosekvenování v mikrobiologii Zkoumání spektra bakterií, ochranná role některých, změna poměru zastoupení hledání příčin onemocnění (postantibiotické kolitidy CD, mykózy u žen, infekční příčina předčasných porodů ) Viry celogenomové sekvenování, genomová variabilita, možné zachytit změny u starých agens, mutace identifikace nových virových patogenů Dále?????
Děkuji za pozornost