Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice



Podobné dokumenty
v diagnostice infekčních onemocnění

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Zkušenosti s diagnostikou sepse pomocí testu SeptiFast Test M GRADE. Zdeňka Doubková Klinická mikrobiologie a ATB centrum VFN Praha

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

AKTUÁLNÍ DOPORUČENÍ MIKROBIOLOGICKÉ DIAGNOSTIKY A ANTIBIOTICKÉ LÉČBY INFEKČNÍ ENDOKARDITIDY 21ST COLOURS OF SEPSIS, OSTRAVA

Sekvenace aplikace ve virologické diagnostice. Plíšková Lenka FN Hradec Králové

Automatizace v klinické mikrobiologii

Nové technologie v mikrobiologické diagnostice a jejich přínos pro pacienty v intenzivní péči

Nové technologie v mikrobiologické laboratoři, aneb jak ovlivnit čas k získání klinicky relevantního výsledku

Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse

Mikrobiologické vyšetření jako podklad pro racionální cílenou antibiotickou terapii. Význam správné indikace vyšetření a dodržování

Využití molekulárně-biologických postupů a multimarkerových strategií v intenzívní péči. Marek Protuš

Využití molekulárně-biologických postupů a multimarkerových strategií v intenzívní péči. Marek Protuš

SeptiFast. rychlá detekce sepse. Olga Bálková Roche s.r.o., Diagnostics Division

Citlivost a rezistence mikroorganismů na antimikrobiální léčiva

Pracovní skupina pro molekulární mikrobiologii TIDE

Interpretace výsledků bakteriologických vyšetření

Lékařská mikrobiologie II

LÉČBA VENTILÁTOROVÉ PNEUMONIE SPOLUPRÁCE INTENZIVISTY A MIKROBIOLOGA

Zubní kaz v časném dětství a mikrobiální flóra. I. Sedláček, L. Žáčková, M. Kukletová, L. Klapušová, J. Kuklová, D. Nováková, P.

Met e o t d o y d m ol o ek e ul u ár á n r í n í g e g n e e n t e i t ky v m ikro r b o i b ol o og o i g i Pavel Dřevínek

LABORATOŘE EUROMEDIC s.r.o. Oddělení klinické mikrobiologie a autovakcín

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii

PREGRADUÁLNÍ VZDĚLÁVÁNÍ V LÉKAŘSKÉ MIKROBIOLOGII

LÉČBA A ATB PROFYLAXE INFEKČNÍ ENDOKARDITIDY (nové doporučené postupy) Jiří Beneš Infekční klinika 3. LF UK Nemocnice Na Bulovce, Praha

PAROTITIDA VRACEJÍCÍ SE ONEMOCNĚNÍ. Vlasta Štěpánová 1, Miroslav Fajfr 1,2, Lenka Plíšková 3

RESPIRAČNÍ INFEKCE. Milan Kolář


ANTIBIOTICKÉ LÉČBY V INTENZIVNÍ MEDICÍNĚ

Lékařská mikrobiologie současné možnosti oboru v AČR

Diagnostická laboratoř Praha. Laboratorní příručka Příloha č.1. Přehled vyšetření prováděných v Laboratoři klinické mikrobiologie

Novorozenecká sepse a její diagnostická úskalí. Jan Hálek, Anna Medková Novorozenecké oddělení a Dětská klinika FNO

Urogenitální infekce. Infekce močových cest. Genitouretrální infekce u muže. Infekce reprodukčních orgánů ženy. MUDr. Drahomíra Rottenbornová

Mikroskopie versus kultivace, kdy, komu a proč? Jan Kestřánek PGK, FNHK

Odběr a transport biologického materiálu do mikrobiologické laboratoře. Jana Juránková OKM FN Brno

Mikrobiologické vyšetření moči

Laboratorní di agnostik HBV HCV a Vratislav Němeček Státní zdravotní stav ústav

Změny sazebníku výkonů pro mikrobiologické obory

V. Adámková Klinická mikrobiologie a ATB centrum 1.LF UK a VFN, Praha. Colours of Sepsis; ATB STEWARDSHIP V INTENZIVNÍ MEDICÍNĚ, 30.1.

CZ.1.07/1.5.00/

Využití metagenomiky při hodnocení sanace chlorovaných ethylenů in situ Výsledky pilotních testů

Atestace z lékařské genetiky inovované otázky pro rok A) Molekulární genetika

APLIKACE METAGENOMIKY PRO HODNOCENÍ PRŮBĚHU SANAČNÍHO ZÁSAHU NA LOKALITÁCH KONTAMINOVANÝCH CHLOROVANÝMI ETHYLÉNY

ANTIBIOTICKÁ LÉČBA OFF-LABEL Z POHLEDU MIKROBIOLOGA. Milan Kolář Ústav mikrobiologie FNOL a LF UP v Olomouci

synlab czech s.r.o. Laboratoř České Budějovice, Vrbenská 197/23 sekce mikrobiologie Vrbenská 197/23, České Budějovice SOP A.

Jak může laboratoř zvýšit relevanci výsledku? V. Adámková Ústav lékařské mikrobiologie FNKV, Praha

Fakultní nemocnice Brno Laboratoře Oddělení klinické mikrobiologie Jihlavská 20, Brno

POH O L H E L D E U D U M

POH O L H E L D E U D U M

Antibiotická profylaxe v gynekologické operativě

Stafylokoky v současné době patří mezi důležité bakteriální patogeny. Např. u nozokomiálních infekcí krevního řečiště jsou spolu s enterokoky

Infekce močových cest (IMC) Kurs Modulu IIC Horečnaté stavy Jan Smíšek ÚLM 3. LF UK 2008

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

laboratorní technologie

Vzdělávání zdravotních laborantek v oblasti molekulární biologie

Enterotoxiny Staphylococcus aureus. Jana Kotschwarová Andrea Koťová

prezentace OKMP 1

Věstník OBSAH: o dotaci ze státního rozpočtu na rezidenční místo nelékařské obory pro rok

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

Molekulárně biologické metody princip, popis, výstupy

VÝVOJ REZISTENCE BAKTERIÁLNÍCH PATOGENŮ

Nové technologie v diagnostice septických pacientů. Franeková J., Hrouda M., Ročeň M., Kieslichová E., Jabor A.,

Sérologická diagnostika chřipky možnosti a diagnostická úskalí

Epidemiologie spály. MUDr. František BEŇA

ZÁNĚTLIVÁ ONEMOCNĚNÍ CNS. Markéta Vojtová VOŠZ a SZŠ Hradec Králové

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

Metamorfózy SIRS pohled mikrobiologa. Dana Němcová Oddělení klinické mikrobiologie PLM IKEM Ostrava

Elektroforéza Sekvenování

M KR K O R BI B OLO L GA

Přínos metody ELISPOT v diagnostice lymeské boreliózy

VÝVOJ REZISTENCE BAKTERIÁLNÍCH PATOGENŮ

Varovné meze a jejich hlášení. Nahrazuje dokument I-ÚLBLD-1 Varovné meze a jejich hlášení vyd.5, zm.1 ze dne

VÍME VŠE O PREVENCI NEMOCNIČNÍ INFEKCÍ SPOJENÝCH S KATETRIZACÍ CENTRÁLNÍ ŽÍLY?

Mikrobiologická diagnostika v intenzivní medicíně

Odběry vzorků u pacientů s podezřením na infekci krevního řečiště

Sepse a infekční endokarditida Michal Holub

1.Nevycházející zkouška kompatibility 2.Pozitivní screening antierys.protilátek 3.Nevycházející vyšetření krevní skupimy Coombs přímý - pozitivní -

Plán programů zkoušení způsobilosti/externího hodnocení kvality (PT/EHK) na rok 2015

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

LABORATOŘ MIKROBIOLOGIE II ROD STREPTOCOCCUS ROD ENTEROCOCCUS

Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové

Nabídka služeb. Mikrobiologie a serologie. RNDr.Zdeněk Čecháček s.r.o. Člen klinických laboratoří IFCOR Spektrum nabízených služeb

Pavel Čermák. Thomayerova nemocnice Praha - Krč výroční zasedání SLM

Odůvodnění veřejné zakázky podle 156 odst. 1 zákona č. 137/2006 Sb., o zadávání veřejných zakázek pro veřejnou zakázku na dodávky

Mikrobiologická diagnostika v intenzivní medicíně

Úloha nemocniční epidemiologie v prevenci infekcí v intenzivní péči. MUDr. Eva Míčková

ŽIVOT OHROŽUJÍCÍ INFEKCE V DĚTSKÉM VĚKU COLOURS OF SEPSIS, AKTUALITY V DĚTSKÉ INTENZIVNÍ PÉČI,

Invazivní meningokokové onemocnění u dětí

Prenatální diagnostika kongenitální toxoplasmózy a její úskalí


Mikrobiologické diagnostické metody. MUDr. Pavel Čermák, CSc.

DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH CHOROB KULTIVACE V LABORATORNÍCH PODMÍNKÁCH

Problematika epidemiologicky závažných bakteriálních kmenů ve FNUSA

Infekční endokarditida pravého srdce - endokarditida na trikuspidální chlopni. H. Línková III.interní kardiologická klinika FNKV a 3.

Dekontaminační rohože rozbor složení a jejich použití

MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ METODY V SURVEILLANCE A ŠETŘENÍ EPIDEMIÍ

PCT kontrolovaná ATB terapie nosokomiální pneumonie ventilovaných nemocných

Ondřej Scheinost Nemocnice České Budějovice, a.s.

Transkript:

Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice Plíšková L., Kutová R., Bolehovská R., Ryšková L. ÚKBD, ÚKM FN Hradec Králové FONS 2012

Široké použití v mikrobiologii Identifikace mikroorganizmů (bakterie, houby) kultivace Vyhledávání mutací spojených s rezistencí a léčbu (antivirotika CMV, HSV, HBV, HCV, HIV ; antibiotika MRSA ) Epidemiologie Identifikace nových virů

Identifikace mikroorganizmů Provádění specifických PCR reakcí - cílená diagnostika, využití specifických primerů umožňujících detekci konkrétní bakterie Provádění broad-range širokospektré, panbakteriální, panfungální PCR s následnou sekvenací dle Sangera - primery z oblasti 16S rrna (18S) společné všem bakteriím (houbám) - spektrum obdobné jako při mikroskopii nebo kultivacích!! nahrazuje ji v případech, kdy kultivovat nelze

Sekvenační analýza Využití v diagnostice mikroorganizmů - často dlouhodobá ATB terapie PCR diagnostika zásadní pro nalezení původce -biofilmy - dg. endokarditid na chlopenních náhradách - periprotetické infekce - infekce drenážních likvorových systém tkáně, punktáty (kolene), abscesy plodová voda, likvor atd. krev??? moč???, BAL???

PCR/sekvenace Extrakce DNA, PCR, gelová elfo Čištění PCR produktu po PCR Sekvenační PCR s forward/reverse primerem Čištění po sekvenační PCR před vlastní sekvenací Sekvenace (ABI 3130) kapilární elektroforéza Sekvence ve FASTA formátu TCTGGTATCCCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAG TATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTA CGATCGGTTTTCTGGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTGGCTACCCTCTGTACCGACCATTGTATGACG TGTGAAGCCCTGGTCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG Zhodnocení

Analytické hodnocení výsledku Hledá se shoda s referenčními sekvencemi bakterií FASTA formát získané sekvence se vkládá do 3 databází volně přístupných na internetu - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - RDPII (Ribosomal Database Project) - SepsiTest BLAST (Identification by 16S/18S rdna Sequence Analysis) a automaticky se vyhodnocuje Výsledek bakterie se 100% pravděpodobností identifikace ve všech 3 použitých databázích

Interpretace výsledků Zásadní je rozhodnout, zda určená bakterie je: Patogen (etiologický původce, příčina onem.) Kontaminující nebo kolonizující bakterie (neidentifikovatelný, nekultivovatelný, všudypřítomný nebo bez bez patogenity u lidí a zvířat) Je nutné zvážit: - klinické (anamnestické údaje, imunita pacienta, klinický a biochemický profil, odpověď na ATB) odběr vzorku před/po ATB, místo odběru Nutná spolupráce s mikrobiologem a klinikem!

Případ č. 1 68-letý pacient Dg. akutní a subakutní infekční endokarditida 9.3.2010 Materiál k vyšetření aortální chlopeň PCR + sekvenace 12.3.2010 výsledek : Enterococcus faecalis Kultivace 16.3.2010 aerobní negativní anaerobní kmen k dourčení

Případ č. 2 52-letý pacient Dg. akutní infekční endokarditida 9.8.2012 Materiál k vyšetření aortální chlopeň 10.8. PCR + sekvenace 14.8.2012 výsledek : Bartonella sp. Kultivace negativní sérologie hraniční protilátky

Případ č. 3 69-letý pacient (překlad z Nem. Chrudim) - dg. I339 akutní endokarditida - materiál: aortální chlopeň (2. 9.) - ÚKM- kultivace negativní(atb léčba) - PCR + sekvenace duální infekce nejsme schopni určit překrytí sekvencí specif. PCR SA, + další patogen??? (HK - nem. Chrudim Enterococcus)

Případ č. 4 41-letá pacientka Několika měsíční bolesti v laterální části levého stehna bez úrazu, MRI suspekce na tumor zhoršení stavu, sepse, nález abscesů okolo femuru a osteomyelitidy, nasazena ATB kultivace G- vláknité tyče, změna ATB (i na anaeroby), nepotvrzeny zdroj??? - PCR specif. PCR (TBC + atyp.) negat. - PCR + sekvenace Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum změna ATB, zlepšení stavu, postupně se upravil

Případ č. 5 28-letý pacient - Přijat na infekční kliniku jako septický stav nejasné etiologie Dg.: susp. IMO?, pneumokoková infekce? Odběr krve na PCR, HK + aglutinace (negat. NM, HI, SP), zahájena ATB léčba - Po 2 dnech. zhoršení stavu, UPV, CRP 322 provedena detekce panbakteriální DNA v krvi, moči pozitivní, sekvenačně Streptococcus suis streptokoková sepse s multiorgánovým selháním, PNC kryst. postupné zlepšení stavu. kultivace obtížná, později po několika dnech narostlo několik kolonií, které nelze dourčit

Pyrosekvenování Využití hdna, mikroby, zvířecí a rostlinná DNA Začíná se objevovat v klinickém použití zejména hdna Pro rutinní v mikrobiologii použití chybí protokoly, validace, programy pro zpracovávání výsledků výzkum, studie, granty Sekvenátory vyšší generace (NGS) (Roche454 FLX, Illumina, Solid Helicos, IonTorrent, GS Junior )

Pyrosekvenování v mikrobiologii Hlavní rozdíl: více pacientů současně více sekvencí (nevýhoda naplnění kapacity přístroje) Citlivost detekuje minimální množství mikroorganizmů i na pozadí jiných Umožní analyzovat spektrum mikroorganizmů v jakémkoli materiálu či prostředí

Rozdíly mezi Sangerem a NGS Sangerovo sekvenování vznik fragmentů DNA o různé délce, kapilární elektroforéza, seřazení dle velikosti, detekce značených nukleotidů, přečtení kolem 500 bazí, vždy 1 sekvence NGS syntetická reakce v pyrosekvenátoru syntéza celého vlákna přímo v jamkách destičky

Princip sekvenování podle Sangera Rozdělení podle velikosti jednotlivých sekvencí DNA pomocí kapilární elektroforézy (v 1 kapiláře), automatizováno

Princip pyrosekvenování

Pyrosekvenování Výstup dat ze sekvenátorů změť sekvencí, soubor různých sekvencí Zhodnocení -rozdělení dat pro jednotlivé vzorky (rozlišení pacientů) - clustely konsensuálních sekvencí různé skupiny sekvencí, různý počet čtení důležité zvolit citlivost (dle počet čtení) - vkládání do BLASTu identifikace - interpretace dat

Mikrobiom recta rectum počet čtení celkem 2000 mikroorganismy počet čtení zastoupení v % Streptococcus anginosus 800 40,12% Parasutterella excrementihominis 167 8,38% Streptococcus agalactiae 108 5,42% Lactobacillus acidophilus 97 4,86% Dialister micraerophilus 57 2,86% Bilophila wadsworthia 40 2,01% Parvimonas micra 40 2,01% Celkem 78 mikroorganizmů Mikrobiom cervixu cervix počet čtení celekm 1600 mikroorganismy počet čtení zastoupení v % Lactobacillus iners 1155 68,18% Gardnerella vaginalis 374 22,08% Atopobium vaginae 23 1,36% Aerococcus christensenii 16 0,94% Parvimonas micra 2 0,12% Lactobacillus iners Gardnerella vaginalis Atopobium vaginae Aerococcus christensenii Parvimonas micra

Pyrosekvenování v mikrobiologii Zkoumání spektra bakterií, ochranná role některých, změna poměru zastoupení hledání příčin onemocnění (postantibiotické kolitidy CD, mykózy u žen, infekční příčina předčasných porodů ) Viry celogenomové sekvenování, genomová variabilita, možné zachytit změny u starých agens, mutace identifikace nových virových patogenů Dále?????

Děkuji za pozornost