Protilátky proti Treponema pallidum (IgM) Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig Substrát Formát EI 2111-9601M Treponema pallidum IgM Ag-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96) Princip testu: ELISA test umožňuje kvantitativní in-vitro stanovení lidské protilátky třídy IgM proti Treponema pallidum. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy rekombinantními antigeny Treponema pallidum. V prvním reakčním kroku se v jamce inkubují ředěné vzorky séra od pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgM (také IgA a IgG) protilátky navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgM značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Intenzita vzniklé barevné reakce je úměrná koncentraci protilátek proti antigenům Treponema pallidum. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační sérum: (lidské IgM): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno modře. - Negativní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené kozí protilátky proti lidským IgM: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno červeně. - Vzorkový pufr: obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti lidskému IgG): 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 0,5 M kyselina sírová. - Návod k provedení testů - Protokol s kalibračními hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až + 8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal. Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až + 8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrace a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití. Zeleně obarvený vzorkový pufr obsahuje IgG/RF Absorbent. Pro stanovení protilátek třídy IgM proti Treponema pallidum se musí vzorky séra nebo plazmy naředit tímto pufrem. Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 o C až + 8 o C. Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním ho promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok: Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Úvod: Předtím, než mají být ve vzorcích séra pacientů stanoveny protilátky třídy IgM, musí se odstranit protilátky třídy IgG. Toto lze provést ultracentrifugací, chromatografií nebo imunoabsorpcí. Tento proces musí být proveden tak, aby se zabránilo revmatickým faktorům reagovat se specifickými vázanými IgG, což by vedlo k falešně pozitivním výsledkům v testech pro IgM a dále se musí zabránit náhradě IgM za specifické IgG vázané k antigenu, což by naopak vedlo k falešně negativním výsledkům pro IgM. Princip: Vzorkový pufr (značeno zeleně ) obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti lidskému IgG). IgG ze séra nebo plazmy se navážou s vysokou specificitou na tyto protilátky a precipitují. Jestliže vzorek obsahuje revmatické faktory, tyto jsou absorbovány pomocí komplexu IgG/anti-lidský IgG komplex. Vlastnosti oddělení: -Všechny IgG podtřídy se navážou a precipitují pomocí anti-lidských IgG protilátek. -IgG se z lidského séra odstraní až do koncentrace 15 mg na mililitr (průměrné sérum dospělého člověka obsahuje koncentraci IgG okolo 12 mg na mililitr)
-Odstraní se revmatické faktory - Výtěžek IgM frakce je téměř 100%. Provedení: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Inkubujte reakční směs po dobu alespoň 10 minut při pokojové teplotě. Potom naneste vzorky podle pipetovacího protokolu do jamek mikrotitrační desky. Poznámky: -Protilátky třídy IgG nelze pomocí této reakční směsi stanovit. -Ověření účinnosti absorbentu IgG/RF se udělá tak, že se provede paralelní test na stanovení - IgG ve směsi pro IgM stanovení IgM je spolehlivé pouze tehdy, je-li test na IgG negativní. -Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu. Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí 300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgM) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku.
Pipetovací protokol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C P6 P14 P22 B Poz. P7 P15 P23 C Neg. P8 P16 P24 D P1 P9 P17 E P2 P10 P18 F P3 P11 P19 G P4 P12 P20 H P5 P13 P21 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem kvantitativní analýzy sér od 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C), pozitivní a negativní kontrolní séra (poz. a neg.) a všechny vzorky sér od pacientů byly inkubovány jednotlivě v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. Výpočet výsledků: Hodnota absorbance kalibračního séra definuje horní hranici referenčního rozsahu pro neinfikované osoby (cut-off value). Hodnoty vyšší, než je tato hranice, se považují jako pozitivní, pod touto hranicí jako negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také jemnější vyhodnocení výsledků. Poměry > 1,0 se považují jako pozitivní, poměry < 1,0 jako negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu, musí být proto zařazeny v každém prováděném testu. Poměry se vypočítají z následujícího vztahu: Extinkce kontrolního vzorku nebo vzorku séra Extinkce kalibračního séra (cut-off) = Poměr Charakteristiky testu Kalibrace: Jelikož neexistuje referenční sérum pro protilátky třídy IgM proti Treponema pallidum, vyjadřují se výsledky ve formě poměrů, které jsou v relaci ke koncentraci protilátek. Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a poměry určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty pro každý kit. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a musel by se opakovat. Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra se vystaví stejnému vlivu, a proto nastalé změny jsou povětšinou zakalkulovány ve výpočtu výsledků. Tato situace se bere následně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě:
Pokojová teplota 14 o C 18 o C Pokojová teplota 19 o C 23 o C Pokojová teplota 24 o C - 30 o C doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min Antigen: Jako zdroj antigenu slouží směs rekombinantních antigenů Treponema pallidum. Obsahuje T.pallidum p15-, T.pallidum p17-, T. pallidum p 47- a T.pallidum TmpA antigeny. Klinický význam Treponema pallidum je bakterie patřící do rodiny spirochaetaceae. Do této rodiny patří pět rodů: borelie, spirocheta, kristispira, treponema a leptospira. Treponema pallidum je infekční patogenní agens způsobující syfilis (lues), chronickou infekční chorobu. Přenos choroby se děje hlavně sexuálním kontaktem, ačkoli přenos krevní transfuzí či přes poranění, či diaplacentálně nelze vyloučit. Infekce se šíří mízními cévami a lymfatickými uzlinami do krve a krví dále do orgánů. Syfilis patří mezi všeobecně známé choroby a její průběh lze rozdělit do několika různých stadií. Primární a sekundární stádium je známo jako časná syfilis a terciární a kvarterní stádium jako pozdní stádia syfilis. Primární stádium: Typickým primárním projevem exogenní infekce Treponema pallidum je ohraničený výskyt vláknité eroze, či ztvrdliny v místě infekce, která se objeví tři týdny po infekci. Potom se může vyvinout vřed, či se zhorší vzniklé leze, vznikne tzv.tvrdý vřed.do týdne se zvětší mízní uzliny. Sekundární stádium: Kromě zvětšení mízních uzlin se u 90 % pacientů ukazují tzv. lokální či po celém těle rozmístěná poranění kůže, která mohou být symetrická, či se mohou projevit ve formě skvrn, pupínků, odlupující se kůže a/nebo vřídků. Převládající jsou projevy ve formě bradavičnatých útvarů. Dále se mohou vyvinout další poškození orgánů, například keratitida, irititida, hepatitida, vaskulitida a potíže myokardu. Sekundární stádium syfilitidy následuje klinicky se neprojevující (klidové) stádium (syphylis latens). Toto stádium může trvat i několik let. Terciární stádium: Typickými projevy syfililitidy ve třetím stádiu jsou velké pupeny a vředy na kůži a sliznicích. Vnitřními projevy syfilitidy jsou změny na různých orgánech, které se mohou projevit ve formě gumatózních a intersticiálních zánětů, perivaskulitidy, kardiovaskulární syfilis, neurosyfilis (v asymptomatické, či symptomatické formě), osteitis (zánět kostní dřeně) a periosteitis. Kvarterní stádium: Kvarterní projevy infekce Treponema pallidum ve formě neurosyfilitidy se mohou projevit až 30 let po nakažení. Neurosyfilis se projevuje v tomto stadiu nejprve vznikem primární formy progresivní paralýzy a tabes dorsalis (onemocnění míchy následující po infekci neléčené syfilitidy). Diagnóza syfilitidy je založená na klinických příznacích, odpovídajících stádiu nemoci, mikroskopické detekci infekčního agens (tmavé pole) a sérologických detekcích pomocí protilátek proti Treponema pallidum. Literární odkazy: 1. Oschmann P., Nuckel M., Wellensiek H.J., Hornig C.R., Dorendorf W.: Immunoblot as a Diagnostic Tool in Neurosyphilis. J.Lab.Med. 1997; 21(1):037-042. 2. Meyer P.M., Eddy T. Baughn R.E.: Analysis of Western Blotting (Immunoblotting) Technique in Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin.Microbiol. Mar. 1994:629-633. 3. Lewis L.L., Taber L.H., Baughn R.E.: Evaluation of Immunoglobulin M Western Blot Analysis in the Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin. Microbiol.Fed. 1990:296-302.