Metodika tvorby rodičovských komponent a hybridů ozimé řepky (Brassica napus L.) na bázi CMS Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného projektu MZe QI 111A075 Využití biotechnologických metod, nových výchozích materiálů a efektivních postupů ve šlechtění ozimé řepky. Autoři: Ing. Vratislav Kučera, CSc., Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc., Ing. Miroslav Klíma, Ph.D., prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D., Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D., Ing. Eva Jozová, Ing. Ivana Macháčková Praha, září 2013
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Praha - Ruzyně Metodika tvorby rodičovských komponent a hybridů ozimé řepky (Brassica napus L.) na bázi CMS Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného projektu MZe QI 111A075 Využití biotechnologických metod, nových výchozích materiálů a efektivních postupů ve šlechtění ozimé řepky. Ing. Vratislav Kučera, CSc. 1 Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc. 1 Ing. Miroslav Klíma, Ph.D. 1 prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D. 2 Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D. 2 Ing. Eva Jozová 2 Ing. Ivana Macháčková 3 1 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha-Ruzyně 2 Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích 3 SELGEN, a.s., Šlechtitelská stanice Chlumec nad Cidlinou Praha, 2013
Metodika tvorby rodičovských komponent a hybridů ozimé řepky (Brassica napus L.) na bázi CMS Vratislav Kučera a kol. kucerav@vurv.cz Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha - Ruzyně Vypracováno za podpory výzkumného projektu MZe 111A075 Využití biotechnologických metod, nových výchozích materiálů a efektivních postupů ve šlechtění ozimé řepky. Oponenty metodiky byli: prof. Ing. Jaroslava Ehrenbergerová, CSc., Mendelova univerzita Brno Ing. Petr Zehnálek, ÚKZÚZ ZS Hradec nad Svitavou Podíl autorů na vypracování metodiky: Ing. Vratislav Kučera, CSc. (20%), Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc. (15%), Ing. Miroslav Klíma, Ph.D. (15%), prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D. (20%), Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D. (10%), Ing. Eva Jozová (10%), Ing. Ivana Macháčková (10%) Text: Kučera V. a kol. Foto: Klíma M. Vydáno bez jazykové úpravy Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2013 ISBN 978-80-7427-148-9
Obsah: I. Cíl metodiky...5 II. Vlastní popis metodiky...6 II.1. Úvod...6 II.2. Metodika tvorby mateřských komponent hybridů...8 Tvorba mateřských CMS linií...8 Udržování a množení CMS linií...8 Tvorba sterilních F 1 mateřských komponent...8 II.3. Metodika tvorby otcovských komponent hybridů -linií Rf...9 Tvorba a udržování Rf linií tradičními metodami...9 Praktická metoda testu obnovy fertility...9 Tvorba a udržování Rf linií s využitím metody dihaploidů...10 II.4. Metodika tvorby pylově fertilních hybridů...10 Tvorba jednoduchých dvouliniových hybridů...10 Tvorba tříliniových hybridů...10 Výroba hybridního osiva v chráněných prostorách...11 Využití hmyzích opylovačů při výrobě hybridního osiva...11 II.5. Metodika hodnocení genetické diverzity rodičovských komponent na základě analýzy molekulárních markerů...12 Izolace DNA...12 Analýza SSR markerů...12 Analýza ISSR markerů...12 Analýza AFLP markerů...13 Digitální obrazová analýza...13 Molekulární detekce obnovitelů fertility nesoucích geny obnovy fertility (Rf) u CMS typu Ogu-INRA a Shaan2A...13 III. Srovnání novosti postupů...14 IV. Popis uplatnění metodiky...14 V. Ekonomické aspekty...15 VI. Seznam použité související literatury...16 VII. Seznam publikací, které předcházely metodice...17 VIII. Přílohy...19 Příklady výstupů analýzy molekulárních markerů...19 Test fertility v kořenáčích o průměru 8 cm...21
I. Cíl metodiky Řepka olejka (Brassica napus L.) patří mezi nejvýznamnější olejniny a v současné době se ve světovém měřítku řadí na druhé místo za sóju (Ash 2012). V Evropě je z hlediska výměry nejvýznamnější olejninou, je pěstována na 60% (6,5 mil. ha) celkové plochy (10,8 mil. ha) této skupiny plodin (Kolektiv 2009). V České republice sklizňové plochy řepky olejky kolísají v rozmezí 350-400 tis. ha. Řepka ozimá je tak v ČR co do výměry druhou nejvýznamnější plodinou na orné půdě, po pšenici a před jarním ječmenem. Řepkové semeno má mnoho možností využití: v potravinářství /rafinované jedlé oleje, jedlé tuky/, v krmivářství /extrahované šroty jako součást krmných směsí pro hospodářská zvířata/, v oleochemii /technické oleje a jejich deriváty/ a ve využití pro energetické účely /bionafta, řepkové šroty, výlisky a sláma jako paliva/ (Baranyk a kol. 2010). Řepka patří mezi mladé zemědělské plodiny s poměrně krátkou šlechtitelskou historií. Jako kulturní plodina, pěstovaná pro olejnatá semena, se vyskytuje v Evropě od 16. století, ale začátky intenzivnějšího šlechtění a využití v potravinářství se datují až od přelomu 19. a 20. století (Fábry a kol. 1992). Intenzivním šlechtěním bylo dosaženo zásadní změny složení oleje a tím i jeho převedení z kategorie nejedlého oleje, vhodného jen pro technické účely, na olej potravinářský s vhodnou skladbou mastných kyselin, který v mnohém předčí i velmi kvalitní olej olivový (Baranyk a kol. 2007). Odrůdová skladba a genetická struktura pěstovaných odrůd procházela vývojem od krajových odrůd a odrůd populací se standardním obsahem kyseliny erukové a glukosinolátů přes 0 a 00 liniové odrůdy, tj. odrůdy se sníženým obsahem kyseliny erukové a glukosinolátů. V průběhu šlechtění došlo k významným posunům ve skladbě mastných kyselin. Nyní existuje řada šlechtitelských programů cíleně zaměřených na získání odrůd se změněnou skladbou mastných kyselin dle specifického využití dané odrůdy, např. LL (Low Linolenic), HO (High Oleic) a HOLL(High Oleic Low Linolenic) odrůdy. V současnosti je velký důraz kladen na šlechtění hybridních odrůd řepky, které dosahují o 10 15% vyššího výnosu semen ve srovnání s liniovými odrůdami, vyšší olejnatosti a vyšší odolnosti vůči biotickým i abiotickým stresům. Důvody, které podmínily rozvoj hybridního šlechtění a značné rozšíření hybridních odrůd jsou: vysoký množitelský koeficient, heterozní efekt a existence geneticky podmíněných systémů sterility/autoinkompatibility. Hybridy řepky zaujímají v Evropské unii již 50 60 %, v České republice přibližně 50% osevní plochy (SPZO 2011) a ve šlechtění je využívána řada hybridních systémů (např. kompozitní a restaurované hybridy, systém MSL a Ogu-INRA, v zahraničí používané transgenní hybridní systémy LibertyLink a SeedLink). Cílem této metodiky je předložit ucelený přehled metod tvorby rodičovských komponent a hybridů řepky na bázi CMS s využitím moderních biotechnologických technik a postupů při výrobě hybridního osiva. 5
II. Vlastní popis metodiky II.1. Úvod Řepka olejka je vhodnou plodinou pro využití hybridů z důvodu u ní prokázané heteroze. Heterozní efekt byl u řepky olejky prokázán mnoha studiemi (Röbbelen 1985; Brandle a McVetty 1989). V hybridním šlechtění řepky se využívá heterozního efektu pro zlepšení mnoha agronomických znaků (Paulmann 1999). U řepky se uvádí heterozní efekt ve formě zvýšené produkce semen na úrovni 15-20 %. Dalším předpokladem pro tvorbu hybridů je vysoký množitelský koeficient a existence několika systémů samčí sterility. Morfologie květů řepky, oboupohlavní květ a délka období kvetení nedovolují u řepky použít mechanickou ani chemickou kastraci ve větším rozsahu. Jedinou možností, jak dosáhnout tvorby hybridů, je proto využití některého ze systémů samčí pylové sterility, popř. autoinkompatibility (AI). Samčí pylová sterilita je důsledkem poruchy vytváření pylu v prašnících nebo přerušení jeho vývinu. Nejčastěji se jedná o cytoplazmatickou, genovou, nebo cytoplazmatickogenovou samčí sterilitu. Charakterizace typů sterility: a) Genová (jaderná) samčí sterilita Tato sterilita je řízena jadernými geny. Je determinována převážně recesivní alelou jednoho genu. K označení genů podmiňujících samčí sterilitu se používá většinou symbolika ms (male sterility) nebo rf (restorer fertility). b) Cytoplazmatická sterilita Tento typ sterility je kontrolován výlučně faktory přítomnými v cytoplazmě mitochondriálními geny. Sterilní rostliny mají plazmotyp S, fertilní rostliny mají plazmotyp F. c) Cytoplazmaticko-genová samčí sterilita V mnoha případech je tento typ sterility označován jako cytoplazmatická samčí sterilita CMS (Cytoplasmic Male Sterility), i když se ve skutečnosti na výsledném fenotypu podílejí i jaderné geny. V současnosti jsou v Evropě nejvíce využívány hybridní systémy CMS Ogu-INRA a MSL (Mänlicher Sterilität Lembke). V podmínkách ČR se při šlechtění hybridů řepky využívají dva systémy cytoplasmatické samčí sterility - Ogu-INRA, původem z Francie a Shaan 2A z Číny, který je příbuzný systému CMS Polima. CMS Polima je využívána hlavně v Číně. V důsledku její nedostatečné stability u ozimé řepky se však v Evropě nevyužívá (Paulmann, 1999). Podle literárních zdrojů není sterilita tohoto systému úplná, ale je do značné míry závislá na teplotě v době kvetení. Tato skutečnost komplikuje dosažení vyso- 6
kého stupně hybridnosti v osivu F 1. Práce z posledních let i naše výsledky však nasvědčují tomu, že díky intenzivnímu šlechtění hybridů na bázi systémů Polima a Shaan 2A došlo k tvorbě sterilních linií s velmi vysokou úrovní sterility i při vysokých teplotách (Kučera a kol. 2010). Hybridní systémy Ogu-INRA i Shaan 2A jsou typem cytoplazmaticko-genové sterility, při které je výsledný genotyp mateřské pylově sterilní linie závislý nejen na sterilním plazmotypu S, ale také na přítomnosti genů obnovy fertility Rf v jádře. Genetické založení pylově sterilních CMS linií je (S) rfrf, kde S značí sterilní cytoplazmu a rf jaderný gen pro obnovu fertility v homozygotně recesivní konstituci. Pylová sterilita v cytoplazmě S je založena mitochondriálními geny a je dominantní nad fertilní cytoplazmou F. Gen obnovy fertility Rf je dominantní nad sterilní cytoplazmou i v heterozygotní konstituci Rfrf. Pylově fertilní udržovatelé sterility mají založení (F) rfrf, kde F značí fertilní cytoplazmu. V případě úplného obnovitele fertility (restorer RF) je genotyp rostliny (S) RfRf, kde alelický pár Rf genu je v dominantně homozygotní sestavě. Pokud dojde k opylení sterilní linie heterozygotním obnovitelem fertility Rfrf, výsledkem je generace F 1, která je z 50 % fertilní (S) Rfrf a z 50 % sterilní (S) rfrf. Charakteristika komponent pro tvorbu hybridů Komponenta Cytoplazma Jádro Fenotyp (produkce pylu) CMS sterilní linie S rfrf Sterilní Udržovatel sterility F rfrf Fertilní (fertilní linie, odrůda) Úplný obnovitel fertility S RfRf Fertilní Neúplný obnovitel fertility S Rfrf Fertilní Před tvorbou hybridů se testuje kombinační schopnost jednotlivých komponent. Kombinační schopnost je vlastnost rodičovských komponent projevující se vznikem heteroze u hybridů. Kombinační schopnost (KS) se dělí na obecnou KS (General Combining Ability GCA) a specifickou KS (Specific Combining Ability SCA). Při GCA konkrétní rodičovská komponenta se statistickou pravděpodobností poskytne heterozní efekt po nakřížení s jakýmkoliv jiným rodičem. GCA je řízena aditivní činností genů. O SCA se jedná v případě, že konkrétní rodičovská komponenta poskytuje heterozní efekt jen po nakřížení s určitým rodičem. SCA je většinou řízena neaditivní činností genů. Předpokladem projevu heteroze je do jisté míry genetická vzdálenost diversita rodičovských komponent, která se v současné době zjišťuje metodami molekulární genetiky. Vhodným markerovacím systémem jsou DNA markery jak pro účely popisu a identifikace odrůd, DUS testování a právní ochranu odrůd, tak i jako systému pro hodnocení genetické diverzity genetických zdrojů. Stanovení genetické diverzity molekulárními metodami umožňuje šlechtitelům výběr vhodných rodičovských komponent pro získání hybridních kombinací vykazujících heterozní efekt (Čurn a kol 2012). Značné urychlení a zefektivnění procesu tvorby rodičovských komponent hybridů přináší využití metody produkce dihaploidů technikou mikrosporových kultur in vitro (Vyvadilová a kol 2008). 7
II.2. Metodika tvorby mateřských komponent hybridů Tvorba mateřských CMS linií Mateřské CMS linie pro tvorbu hybridů s požadovanou kvalitou a výnosovými parametry se vytvářejí z původních výchozích materiálů opakovaným zpětným křížením (backcross BC) s perspektivními liniemi typu (F) rfrf, kterými jsou prakticky veškeré pylově fertilní odrůdy, šlechtitelské materiály a dihaploidní (DH) linie ozimé řepky. Ustálení takové mateřské linie vyžaduje nejméně šest BC. Udržování a množení CMS linií Pro udržení a množení mateřské CMS linie (A) se využívá křížení této linie s udržovatelem sterility (B), kterým je zpravidla linie použitá k opakovanému BC s genotypem (F) rfrf. Postup při udržovacím šlechtění CMS linií a udržovatelů sterility: 1. Homozygotizace fertilních udržovatelů sterility dihaploidizací výchozích linií 2. Křížení CMS linie s udržovatelem sterility (maintainer MT) A (S) rfrf x B (F) rfrf = AB (S) rfrf - Výsev CMS linie A do chráněných izolovaných prostor (izolační klece), s fertilním udržovatelem sterility B v poměru 3:1 nebo 2:1 ve střídavých řádcích, nejlépe orientovaných kolmo na směr výletu opylovačů. - Opylování v období květu hmyzími opylovači (čmeláci, včely) - Sklizeň osiva linií a) osivo mateřské CMS linie pro výrobu hybridního osiva b) osivo fertilního udržovatele sterility pro další cyklus množení CMS linie Tvorba sterilních F 1 mateřských komponent Vzhledem k tomu, že mateřské CMS linie je možné zlepšovat pouze opakovaným BC po několik generací, lze pro urychlení tvorby mateřských komponent hybridů využívat pylově sterilních F 1 hybridů CMS linií s vhodně zvolenými donory požadovaných znaků D. Tyto linie s genotypem (F) rfrf vybrané na základě výnosových parametrů, znaků kvality a genetické vzdálenosti od výchozí CMS linie jsou udržovateli sterility v F 1 hybridu, který slouží jako mateřská komponenta k tvorbě tříliniových hybridních odrůd. Schéma tvorby sterilních F 1 mateřských komponent: A (S) rfrf x D (F) rfrf = AD (S) rfrf S F S 8
II.3. Metodika tvorby otcovských komponent hybridů -linií Rf Tvorba a udržování Rf linií tradičními metodami Otcovské linie obnovitelé fertility - Rf se vytvářejí z původních výchozích materiálů opakovaným zpětným křížením BC s perspektivními liniemi typu (F) rfrf, kterými jsou prakticky veškeré pylově fertilní odrůdy, šlechtitelské materiály a dihaploidní (DH) linie ozimé řepky. Postup při tvorbě a udržování Rf linií: Výchozí materiály obnovitelů fertility jsou zpravidla odvozeny z linií se sterilní cytoplazmou, jejich genotyp je tedy (S) RfRf nebo (S) Rfrf. V případě křížení dominantního homozygota (S) RfRf s recesivním homozygotem (F) rfrf vznikne pylově fertilní heterozygotní potomstvo (S)Rfrf které by po křížení s mateřskou CMS linií obnovovalo fertilitu z 50 %. Po křížení heterozygota (S)Rfrf s recesivním homozygotem (F) rfrf vznikne potomstvo fertilních heterozygotů (S) Rfrf a pylově sterilních recesivních homozygotů (S) rfrf v poměru 1:1. Úplní obnovitelé fertility se získají z potomstva po samoopylení heterozygotů, štěpícího na dominantní homozygoty, heterozygoty a recesivní homozygoty v poměru 1:2:1. Ve vybraných fertilních potomstvech nelze fenotypově rozlišit dominantní homozygoty od heterozygotů podle fenotypu, ani pomocí molekulárních markerů, proto je nutné provádět testovací křížení obnovy fertility se sterilní mateřskou linií. Pouze ta potomstva, která vykazují v hybridních kombinacích po tomto křížení 100% obnovu fertility lze spolehlivě považovat za dominantní homozygoty pro Rf gen. Praktická metoda testu obnovy fertility Fertilní rostliny, vybrané z potomstva po samoopylení heterozygotů pro Rf gen, se jednotlivě nakříží na sterilní CMS mateřskou linii ve skleníkových podmínkách. Získané osivo kříženců se vyseje do výsevních truhlíků, klíční rostlinky se přepichují do pěstebního substrátu v kořenáčích o průměru 8 cm. Po 32 rostlinách od každé kombinace se pěstuje v plastových přepravkách o rozměrech A x B cm, ve fázi 3 5 pravých listů se umístí v jarovizační komoře s teplotou 4-6 o C na dobu 7-8 týdnů. Po proběhlé jarovizaci se rostliny v přepravkách dopěstují do květu ve skleníkových podmínkách (Obr. 1 viz Příloha). Za homozygoty pro Rf gen lze považovat pouze rostliny, jejichž kříženci vykazují 100% obnovy fertility. Homozygotní linie obnovitelů fertility Rf se udržují a množí v technických izolacích s použitím hmyzích opylovačů. K reprodukci Rf linií lze využít i osivo dopěstované v izolaci při hybridizaci s CMS liniemi. 9
Tvorba a udržování Rf linií s využitím metody dihaploidů Pro urychlení a zefektivnění tvorby Rf linií se využívá metoda produkce dihaploidních (DH) linií technikou mikrosporových kultur (Vyvadilová a kol. 2008). Tato metoda umožňuje získat dominantní homozygoty pro Rf gen z kříženců s donory požadovaných znaků prakticky během jedné generace. Postup při tvorbě a udržování Rf linií metodou dihaploidů: Výchozí Rf linie (S) RfRf nebo (S) Rfrf se kříží s donorem D (F) rfrf. Vybraní heterozygotní fertilní jedinci z potomstva po křížení se použijí jako donorové rostliny pro zakládání mikrosporových kultur. Odvozené mikrosporové regeneranty, vykazující pylovou fertilitu, lze považovat za dominantní homozygoty pro Rf gen (S) RfRf. Takto vytvořené Rf linie se dále udržují a přemnožují obvyklými postupy. II.4. Metodika tvorby pylově fertilních hybridů Tvorba jednoduchých dvouliniových hybridů Jednoduché - dvouliniové pylově fertilní hybridy vznikají křížením mateřských CMS linií (S) rfrf s úplnými obnoviteli fertility (S) RfRf. Schéma výroby hybridního osiva: (S) rfrf x (S) RfRf S F F 1 (S) Rfrf F Tvorba tříliniových hybridů Tříliniové hybridy se vytvářejí ve dvou cyklech křížení a) křížením mateřské CMS linie s donorem D, udržovatelem sterility vzniká sterilní F 1 mateřská komponenta b) křížením této F 1 komponenty s obnovitelem fertility Rf vzniká pylově fertilní hybrid 10
Schéma výroby hybridního osiva: A (S) rfrf x D (F) rfrf S F F 1 AD (S) rfrf x (S) RfRf S F F 1 ' (S) Rfrf F Výroba hybridního osiva v chráněných prostorách Postup při výrobě menšího množství hybridního osiva pro zkoušky výkonu: - Výsev mateřských CMS a otcovských Rf linií do izolovaných prostor (izolační tunely 1,5 x 10m) v poměru 2 3:1, před začátkem kvetení zakrytí potahem z netkané textilie a umístění hmyzích opylovačů čmeláků (Macháčková a kol. 2012). Sklizeň hybridního osiva z mateřské komponenty. - Agrotechnika a ochrana porostu se řídí doporučovanými metodikami semenářství brukvovitých plodin - Sklizeň hybridního osiva z mateřské CMS linie, z otcovské fertilní komponenty lze sklidit osivo pro její reprodukci Hybridní osivo ve velkém je nutné vyrábět v polních podmínkách v prostorové izolaci, rodičovské komponenty vysévat ve střídavých pásech v poměru mateřské komponenty k obnoviteli sterility 3:1. Využití hmyzích opylovačů při výrobě hybridního osiva V rámci programů hybridního šlechtění je nezbytné při tvorbě hybridů v technických izolacích využití opylovačů. Přenos pylu z fertilních otcovských na sterilní mateřské rostliny v izolačních klecích pomocí větru je ve srovnání s polními podmínkami minimální. Pro zajištění dostatečného výnosu semen na mateřských liniích se proto využívá hmyzích opylovačů, a to zejména včel a čmeláků (Macháčková et al.2012). Výhodou použití čmeláků při opylování rostlin v technických izolátorech je zejména fakt, že čmeláci nepodléhají v uzavřeném prostoru stresu, rychle se orientují a po seznámení se s prostředím začínají okamžitě pracovat. Pracují již při teplotách 6 8 C (maximálně však do 35 C). Na rozdíl od včel létají v zamračeném dni, i za deště. To je využíváno zejména na jaře při opylování časně kvetoucí ozimé řepky. Čmeláci se v uzavřeném prostoru nechovají tak agresivně jako včely, to usnadňuje následné ošetřování porostů v izolátorech. 11
II.5. Metodika hodnocení genetické diverzity rodičovských komponent na základě analýzy molekulárních markerů Pro hodnocení genetické diverzity a výběr geneticky vzdálených rodičovských komponent ke křížení a tvorbě experimentálních F 1 hybridů lze využít výstupy analýzy molekulárních markerů. Metodický postup pak zahrnuje izolaci DNA, vlastní analýzu molekulárních markerů, digitální obrazovou analýzu a statistické vyhodnocení molekulárních dat. Izolace DNA DNA je izolována z děložních lístků 1 týden po vyklíčení, děložní lístky jsou vysušeny pomocí silikagelu a z 36 rostlin je vytvořen bulk. Pro izolaci DNA je možné použít celé řady metod (přehled a komentáře viz.čurn at al. 2012). U řepky je s úspěchem využívána metoda izolace DNA dle Doyle and Doyle (1987), Williams et al. (1992) nebo pomocí komerčních kitů (Havlíčková et al. 2012a; Havlíčková et al. 2012b; Jozová et al. 2012). Kitové metody poskytují dostatečný výtěžek DNA, jsou relativně rychlé a méně pracovně náročné, je možné zpracovat maximální počet vzorků za jednotku času při uspokojivé kvalitě DNA nicméně jejich finanční náročnost je vyšší. Metody založené na CTAB extrakci jsou finančně daleko příznivější a je získán vysoký výtěžek kvalitní DNA, ale tento fakt je vyvážen větší časovou náročností. Analýza SSR markerů Markerovací systém využívající mikrosatelity u řepky ozimé je vhodným systémem z důvodu řady známých specifických SSR primerů pro druhy rodu Brassica a pro analýzu genetických zdrojů řepky je možné využít i cross-species mikrosatelitové primery, např. primery odvozené pro Arabidopsis. Vlastní protokol analýzy mikrosatelitů vychází z metodiky vypracované na pracovišti Biotechnologického centra ZF JU (Sobotka et al. 2004) upravený dle metodiky Čurn et al. (2012). Nevýhodou mikrosatelitů je potřeba nalezení značného počtu vhodných (publikovaných) primerových párů a jejich otestování. Analýza ISSR markerů Technika ISSR markerů je modifikací techniky SSR markerů. Tato technika je založena na použití PCR amplifikace s náhodně ukotveným mikrosatelitovým motivem. Na rozdíl od techniky SSR není při ISSR nutná žádná předchozí znalost sekvence. Metoda ISSR markerů zároveň poskytuje větší polymorfismus. Oproti mikrosatelitům jsou ale ISSR markery dominantní. Protokol ISSR analýzy vychází z metodiky Prevost and Wilkinson (1999) upravené na pracovišti Biotechnologického centra ZF JU. 12
Analýza AFLP markerů Technika AFLP kombinuje principy technik RFLP a PCR, kdy dochází nejprve k specifickému štěpení pomocí vybraných restrikčních endonukleáz a následné PCR amplifikaci. Polymorfismus se pak zjišťuje na základě vyhodnocování přítomnosti/nepřítomnosti amplifikovaných fragmentů dané velikosti po fragmentační analýze na genetickém analyzátoru. Pomocí techniky AFLP je generováno velké množství dominantních markerů pokrývajících celý genom. Oproti předchozím technikám je ale AFLP analýza pracovně i finančně nejnáročnější a vysoké nároky klade i na zkušenosti a laboratorní dovednosti. Digitální obrazová analýza Pro vyhodnocování výsledků po elektroforéze - tj. spekter molekulárních markerů, je používáno komplexní počítačové zpracování gelů. Gely jsou digitalizovány pomocí digitálního fotoaparátu a po digitalizaci je provedena obrazová analýza. Metoda digitální obrazové analýzy pak představuje prostředek pro primární zpracování elektroforeogramů a zaznamenání pozice fragmentů (amplifikovaných produktů) na gelu. Na základě obrazové analýzy nebo po provedení fragmentační analýzy je provedena statistická analýza a je možné sestavit matice přítomnosti/nepřítomnosti fragmentu v dané zóně, výpočet frekvence alel, výpočet koeficientů genetické identity, výpočty genetických vzdáleností či podobností, clusterovou a ordinační analýzu a sestavení dendrogramů a ordinačních diagramů. Na základě matice genetické vzdálenosti jsou vybrány dvojice genetických zdrojů s největší hodnotou genetické vzdálenosti. Molekulární detekce obnovitelů fertility nesoucích geny obnovy fertility (Rf) u CMS typu Ogu-INRA a Shaan2A Pomocí molekulární analýzy (PCR analýza se specifickými primery) lze v raných fázích vyselektovat jedince nesoucí geny obnovy fertility (Rf - fertility restorer gene/s/) nebo udržovatele sterility (sterility maintainer/s/). Metodický postup spočívá v izolaci DNA z testované rostliny (embrya), PCR se specifickými primery, gelové elektroforéze, obrazové analýze a vyhodnocení pozice a přítomnosti amplifikovaných fragmentů. Analýzy je vhodné provádět v duplexu pomocí primerů pro vybraný endogen k zajištění kontroly správnosti amplifikace (podrobné metodiky analýzy a sekvence primerů viz. Havlíčková et al. 2012. 13
III. Srovnání novosti postupů Předkládaná Metodika tvorby rodičovských komponent a hybridů ozimé řepky (Brassica napus L.) na bázi CMS je aktuální a nová, protože poskytuje šlechtitelům ucelený přehled o metodách a postupech při hybridním šlechtění ozimé řepky s využitím cytoplasmatické samčí sterility. V současné době není v ČR k dispozici dostupná metodika zahrnující optimalizované postupy při šlechtění hybridů ozimé řepky. Dosud dostupné informace jak z hlediska tvorby a udržování rodičovských komponent, provádění křížení a výroby hybridního osiva, tak i z hlediska využití molekulárních technik a přístupů při výběru rodičovských komponent jsou jen dílčí a rozptýlené ve vědeckých publikacích a sbornících z konferencí, které se zabývají problematikou šlechtění a semenářství řepky a používané metody jsou většinou předmětem firemního tajemství. Nový v českém šlechtění dosud nepoužívaný přístup rovněž představuje využití molekulárních markerů pro hodnocení genetické diverzity rodičovských komponent a výběr rodičů do křížení na základě molekulárního screeningu a vyhodnocení genetické vzdálenosti rodičů. Tento přístup představují metodické postupy založené na hodnocení genetické diverzity (míry odlišnosti) rodičů po provedené molekulární analýze. IV. Popis uplatnění metodiky Metodika tvorby rodičovských komponent a hybridů ozimé řepky (Brassica napus L.) na bázi CMS v první části zahrnuje optimalizované postupy pro tvorbu mateřských komponent hybridů (tvorbu, udržování a množení mateřských CMS linií), pro tvorbu otcovských komponent hybridů obnovitelů fertility (tvorba a udržování Rf linií tradičními metodami i pomocí dihaploidů, testování obnovy fertility) a metody tvorby pylově fertilních hybridů (tvorba dvou- a tříliniových hybridů, výroba hybridního osiva v izolátorech a za použití hmyzích opylovačů). Ve druhé části jsou pak uvedeny metody pro hodnocení genetické diverzity pomocí molekulárních markerů. Metodika uvádí nejen přehled metod a technik, ale poukazuje i na přednosti jednotlivých postupů. Metodika představuje soubor optimalizovaných metod a postupů, na jejichž základě lze provádět všechny operace potřebné k získání hybridního osiva řepky tvorba, udržování a množení mateřských CMS linií, tvorba a udržování otcovských Rf linií, tvorba osiva pylově fertilních hybridů a provádění molekulárních analýz pro hodnocení genetické diverzity rodičovských komponent. Molekulární markery nejsou dosud standardně pro tyto účely používány. Stanovení genetické diverzity molekulárními metodami umožňuje šlechtitelům výběr vhodných rodičovských komponent pro získání hybridních kombinací vykazujících heterozní efekt. Uživatelé metodiky jsou výzkumná a šlechtitelská pracoviště. která mohou s výhodou využít biotechnologické metody tvorby dihaploidů a analýzy molekulárních markerů pro stanovení diversity výchozích materiálů. Metodika bude uplatněna prostřednictvím šlechtitelských firem OSEVA PRO s.r.o., odštěpný závod Výzkumný ústav olejnin, Opava a SELGEN a.s. S těmito subjekty byla uzavřena smlouva o uplatnění metodiky. 14
V. Ekonomické aspekty Přínosem pro šlechtitele je úspora nákladů v procesu šlechtění. Využitím metody dihaploidů lze zkrátit proces vyšlechtění nové odrůdy o 2 až 3 roky. Zkrácením šlechtitelského procesu o 1 rok lze při celkových nákladech na jednu odrůdu a délce šlechtění (7-10 let) uspořit 800 tis. Kč. Při vzniku nové odrůdy by finanční přínos pro šlechtitele plynul též z licenčního poplatku (nová odrůda by mohla být zaseta na 2500 ha po dobu 4 let s výnosem 3,0 t/ha, licenční poplatek je 60 Kč z 1 kg prodaného osiva, na 1 ha jsou zapotřebí asi 4 kg, takže 2500*60*4 = 600 tis Kč/rok x 4 roky= celkem finanční přínos je 2,4 mil. Kč. Zavedení metody hodnocení diverzity výchozích materiálů pomocí molekulárních markerů povede ke správnému stanovení výchozích kombinací dostatečně odlišných výchozích genotypů pro hybridní šlechtění a eliminaci potomstev neperspektivních kombinací ze šlechtitelského procesu, tím dojde k úspoře cca 48 tis. ročně. Přínosem pro pěstitele je zvýšený výnos semen hybridů o cca 10-15 % oproti liniovým odrůdám. V případě výnosu 3 t/ha u liniové odrůdy a ceně za 1 t = 10 000 Kč, by zvýšení výnosu o 10 % činilo 300 kg/ha, tj. 3000 Kč/ha. Dalšími přínosy předkládané metodiky jsou rozšíření spektra technik a metodických postupů používaných v biotechnologické laboratoři, rozšíření portfolia technik a služeb prováděných v laboratoři, metodická a vzdělávací funkce. 15
VI. Seznam použité související literatury Ash M. (2012). Oil Crops Yearbook 2012. ERS-USDA, USDA Economics, Statistics and Market Information System, Albert R. Mann Library, Cornell University, USA. Baranyk P., Fábry A. (2007) Řepka: pěstování, využití, ekonomika, 1. Vydání, Praha, Profi press, 208 s. Baranyk P. a kol. (2010): Olejniny. Profi Press, Praha 2010, ISBN 978-80-86726-38-0 Brandle J. E., McVetty P. B. E. (1989): Heterosis and combining ability in hybrids derived from oilseed rape cultivars and inbred lines. Crop Sci. 29: 1191-1194. Čurn V., Havlíčková L., Vondrášková E., Kučera V., Vyvadilová M., Klíma M. (2012): Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely popisu genetických zdrojů řepky (Brassica napus L.) a hodnocení jejich diverzity. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, Biotechnologické centrum JU ZF České Budějovice,.ISBN 978-80-7394-251-9 Fábry A. a kol. (1992) Olejniny, Ministerstvo zemědělství České republiky, 419 s. Kolektiv (2009). Situační a výhledová zpráva. Olejniny. MZe, Praha. Kučera V., Vyvadilová M., Klíma M., Vrbovský V., Plachká E., Macháčková I., Šmirous P., Poslušná J., Buzek Z. (2010): Výsledky a průběh programu Česká řepka v roce 2010. Sborník 25.-26.11.2010, Hluk, 27.vyhodnocovací seminář Systém výroby řepky, Systém výroby slunečnice. Svaz pěstitelů a zpracovatelů olejnin, SPZO s.r.o.: 105-111. Macháčková I., Ptáček V., Bučánková A.: Zkušenosti s využitím čmeláka zemního (Bombus terrestris L., Apidae) ve šlechtění ozimé řepky (Brassica napus L.). Úroda 12, 2012, vědecká příloha, s. 21 26. ISSN: 0139-6013. Paulmann W. (1999): Pokrok ve šlechtění hybridní řepky a pěstování MSL hybridních odrůd. Sborník, Seminář Svazu pěstitelů a zpracovatelů olejnin 16.-18..11.1999, Hluk, sborník s. 96-99. Prevost A., Wilkinson M.J. (1999). A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato kultivar. Theor. Appl. Genet. 98: 107-112. Röbbelen G. (1985): Züchtung von Hybridraps. Bericht der Arbeitstagung Saatzuchtleiter, Gumpenstein, 173-185.SPZO 2011) Vyvadilová M., Klíma M., Kučera V. (2008): Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha 2008, ISBN 978-80-87011-80-5. Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1992). Genetics analysis using RAPD markers. Method Enzymol. 260: 335-348. 16
VII. Seznam publikací, které předcházely metodice Čurn V., Havlíčková L., Vondrášková E., Kučera V., Vyvadilová M., Klíma M. (2012): Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely popisu genetických zdrojů řepky (Brassica napus L.) a hodnocení jejich diverzity. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, Biotechnologické centrum JU ZF České Budějovice,.ISBN 978-80-7394-251-9 Čurn V., Nováková A., Šimáčková K., Ondřichová B., Bárta J. (2008): Molecular markers as a tool for plant breeding and variety identification. Prohnes J., Badenes M.L.(eds): Modern variety breeding for present and future needs. 18th Eucarpia General Congress, Valencia, 2008, p. 699-703. Čurn V., Žaludová (2007): Fingerprinting of Oilseed Rape Cultivars. In: Gupta S. (ed.): Rapeseed Breeding. (Advances in Botanical Research, Volume 45). Elsevier Publ., pp. 155-179. Čurn V., Ovesná J., Sáková L., Sobotka R. (2002): Identification of oilseed rape cultivars using AFLP markers. [Identifikace odrůd řepky olejné použitím AFLP markerů] Journal of Central European Agriculture 3: 285-292. Hájková P., Hrubý J., Pernová E., Čurn V., Žaludová J. (2005): Monitorig pěstebních ploch, přenos a detekce transgenů geneticky modifikované řepky olejky (Brassica napus L. var. napus), Sborník vědeckých prací VÚP Troubsko 15: 93-100. Havlíčková L., Čurn V., Jozová E., Kučera V., Vyvadilová M., Klíma M. (2012): Sequence analysis of the mtdna region correlated with Shaan 2A cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassica napus L.). Czech J. Genet. Plant Breed., 2012, 48, (3), s.139-142. Havlíčková L., Jozová E., Čurn V., Kučera V., Klíma M., Vyvadilová M. (2012): Molecular markers in breeding programmes of rapeseed: Iidentification of CMS Shaan 2A restorers. Úroda 9, 2012, vědecká příloha, s. 150 153. ISSN: 0139-6013 Havlíčková L., Jozová, E., Hejna O., Čurn V. (2012): Využití molekularních markerů ve šlechtení F1 hybridních odrůd řepky (B. napus L.). Úroda 12, 2012, vědecká příloha, s. 151 154. ISSN: 0139-6013. Jozová E., Havlíčková L., Čurn V., Kučera V., Klíma M., Vyvadilová M. (2012): Hodnocení genetických zdrojů řepky olejky (Brassica napus L.): studium genetické diverzity pomocí techniky analýzy mikrosatelitů. Úroda 9, 2012, vědecká příloha, s. 164 167. ISSN: 0139-6013 17
Jozová E., Havlíčková L., Čurn V., Kučera V., Klíma M., Vyvadilová M. (2012): Využití molekulárních markerů pro hodnocení diverzity genetických zdrojů řepky (Brassica napus L.). Úroda 12, 2012, vědecká příloha, s. 159 162. ISSN: 0139-6013. Klíma M., Vyvadilová M., Kučera V.(2008): Chromosome doubling effects of selected antimitotic agents in Brassica napus microspore culture. Czech J. Genet. Plant Breed., 44, (1): 30 36. Koprna, R., Kučera, V., Macháčková, I., Horáček, J., Ehrenbergerová, J. (2009): Development of fertility restorers of winter oilseed rape with low glucosinolate content for the CMS Ogu-INRA system. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 45(3): 123 127. Kučera, V., Klíma, M., Vyvadilová, M. (2012): Využití mikrosporových kultur k tvorbě linií obnovitelů fertility pro dva systémy cytoplazmatické samčí sterility u řepky ozimé. Úroda 60 (9 věd.př.): 32 35. Kučera, V., Klíma, M., Vyvadilová, M. (2008): Využití systému cytoplasmatické samčí sterility Shaan 2A v hybridním šlechtění ozimé řepky (Brassica napus L.). Úroda, 56 (věd.příl.): 67 71 Kučera, V., Vyvadilová, M., Klíma, M. (2010): Utilization of cytoplasmic male sterility Shaan 2A in a hybrid breeding of winter oilseed rape. Agricultura Tropica et Subtropica, 43(3): 26 29. Kučera V., Vyvadilová M., Klíma M., Koprna R., Macháčková I. (2007): Využití CMS a sporofytické autoinkompatibility k produkci hybridního osiva řepky ozimé. Osivo a sadba, Sborník referátů, Česká zemědělská univerzita v Praze, 2007: 79-84. ISBN: 978-80- 213-1610-2 Sáková L., Čurn V., Sobotka R. (2000): Comparison of different DNA isolation methods for RAPD, AFLP and PCR-RFLP analyses. - Coll. Sci. Papers, Fac. Agric. České Budějovice, Ser. Crop Sci., 17: 83-91. Sáková L., Čurn V. (1998): Identifikace a klasifikace vybraných odrůd brukvovitých plodin a dihaploidních linií řepky pomocí RAPD markerů. Czech J. Genet. Plant Breed. 34: 61-67. Sobotka R,. Dolanská L., Čurn V., Ovesná J. (2004): Fluorescence-based AFLPs occur as the most suitable marker system for oilseed rape cultivar identification. - Journal of Applied Genetics 45(2): 161-173. 18
VIII. Přílohy Příklady výstupů analýzy molekulárních markerů Spektrum ISSR markerů získané na základě analýzy s primeryubc 812 (A), UBC 840 (B) a UBC 845 (C). Každý vzorek je analyzován ve dvou nezávislých opakováních; M 100 bp gene ladder. PCO analýza pro 113 genotypů Brassica napus získaná na základě analýzy ISSR markerů. Symboly: C cultivar, L landrace, BF breeding material changed content of fatty acids, B breeding material - yield of oil, BY yellow seeded breeding material, CMSO - CMS Ogu-INRA genetic resources, CMSS - CMS Shaan 2A genetic resources, SI - selfincompatible genetic resources. Red circles indicate modern germplasm, yellow circles older important cultivars. 19
Matice genetické podobnosti pro 113 genotypů Brassica napus získaná na základě analýzy ISSR markerů, barevně jsou podbarveny dvojice s nejvyšší genetickou vzdáleností (červená, zelená žlutá). 20
UPGMA clusterová analýza pro 113 genotypů Brassica napus získaná na základě analýzy ISSR markerů. Test fertility v kořenáčích o průměru 8 cm 21
Název: Autorský kolektiv: Vydal: Kučera a kol. Metodika tvorby rodičovských komponent a hybridů ozimé řepky (Brassica napus L.) na bázi CMS Ing. Vratislav Kučera, CSc. Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc. Ing. Miroslav Klíma, Ph.D. prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D. Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D. Ing. Eva Jozová Ing. Ivana Macháčková Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i, Praha - Ruzyně Drnovská 507 161 06 Praha 6-Ruzyně Vydáno bez jazykové úpravy Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR, dopisem ze dne 16.12.2013 (č.j. 82151/2013-MZE-17221), jako uplatněná metodika s doporučením pro její využití v zemědělské praxi. Kontakt na autory: kucerav@vurv.cz ISBN 978-80-7427-148-9