Bio-Rad Laboratories Munich Manufacturing Biogenníaminy pro HPLC Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012 Bio-Rad Laboratories München, Germany
Biogenníaminy Biogenníaminy Močové katecholaminy Močové metanefriny VMA/HVA/5-HIAA (Kyseliny vanilmandlové(vma), homovanilová kyselina (HVA), 5-Hydroxyindoloctová kyselina(5-hiaa)) Serotonin
Klinické souvislosti Proč měřit Biogenní Aminy: - zvýšenévylučováníbiogenních aminůje ukazatelem pro nádory chromafinní tkáně
Klinické souvislosti Biogení Aminy: Katecholaminy: - Epinefrin (Adrenalin) - Noradrenalin - Dopamin Metanefriny : - Metanefrine - Normetanefrine - 3-Methoxythyramine Kyseliny vanilmandlové (VMA) Homovanilová kyselina (HVA) Tyto látky jsou vylučovány nádory v chromafinní tkáni v ledvinách => Phaechromocytoma (Feochromocytom) Serotonin 5-Hydroxyindoloctová kyselina (5-HIAA) Tyto látky jsou vylučovány enterochromafiními buňkami v např. gastrointestinálním traktu
Biogenní aminy metabolismus Tyrosine L-Dopa Dopamine Norepinephrine Epinephrine 3-Methoythyramine Homovanillic Acid (HVA) Normetanephrine Vanilmandelic Acid (VMA) Trypthophane Serotonin 5-Hydroxyindolacetic Acid (5-HIAA) Metanephrine Metanephrines by HPLC Catecholamines by HPLC VMA/HVA/5-HIAA by HPLC Serotonin by HPLC
Biogenní aminy chemické vlastnosti Katecholaminy Metanefriny VMA/HVA/5-HIAA CH(OH) CH 2 NHCH 3 CH(OH) CH 2 NHCH 3 CH(OH) COOH Epinephrine Metanephrine Vanilmandelic acid CH(OH) CH 2 NH 2 CH(OH) CH 2 NH 2 CH 2 COOH Norepinephrine Normetanephrine Homovanillic acid CH 2 CH 2 NH 2 CH 2 CH 2 NH 2 CH 2 N COOH N NH 2 CH 2 CH 2 Dopamine 3-Methoxythyramine 5-Hydroxyindolacetic acid H Serotonin
Katecholaminy Katecholaminy: - Epinefrin (Adrenalin) - Noradrenalin -Dopamin
Chemická struktura CH(OH) CH 2 NHCH 3 CH(OH) CH 2 NH 2 Adrenalin Noradrenalin CH 2 CH 2 NH 2 Dopamin
Vzorky Druh vzorku: - moč(24h, acidofilní) žádná káva, banany, ananas, ořechy
Princip separace u katecholaminů 1. Krok: Acidifikace 4. Krok: Uvolněníz kolonky SP CH(OH) CH 2 NH 3 B OH OH OOC O CH(OH) CH 2 NH 2 B O Catechol-specific release 2. Krok: Vazba na separační kolonku (SP) 5. Krok: Acidifikace CH(OH) CH 2 NH 3 OOC CH(OH) CH 2 NH 3 Binding of positiv charged molecules 3. Krok: Promytí 6. Krok HPLC analýza
HPLC Analýza Chromatografie CH(OH) CH 2 NH 3 O S O O - chromatografie na reverznífázi za vzniku dynamického iontoměniče Detekce - Elektrochemická detekce (ELCD) O CH(OH) CH 2 NHCH 3 Oxidace na ELCD
Dopamine - 9.84 Chromatogram Stará verze Norepinephrine - 4.07 Internal Standard - 6.54 Epinephrine - 4.70 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Time (min.) Nová verze
Nová souprava pro Močové katecholaminy Nové (kat.č. 195-5370 / 195-5380) Staré (kat.č. 195-5841N / 195-5700) Další reagencie pro rozpuštění a úpravu ph Dostupné do března 2013 Automatická kontrola ph u močových vzorků Nový druh analytické kolony Nová mobilní fáze => lepší separace => méně nebezpečné(žádný methanol) => stále kompatibilníse soupravou pro Metanefriny => Mobilnífáze a kolona nejsou kompatibilníse strarou verzí kitu => Příprava vzorku neníkompatibilníse starou mobilní fází
Močové metanefriny pro HPLC Složení testu (195-5370) Souprava reagencií REAG A Acidic Reagent REAG B Basic Reagent REAG C Reconstitution Reagent REAG 1 REAG 2 REAG 3 DISP COL INT STND CAL MP Dilution Reagent Wash Reagent Elution Reagent Disposable Columns Internal Standard Calibrator Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair) HPLC kolony ANTL CRTR Analytical Cartridge (RP, 500 Inj.) Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.) Nutné vybavení laboratoře Vortex mixér
Přehled produktu Příprava vzorku Acidifikace Iontová výměnná chromatografie HPLC Analýza Chromatografie na reversní fázi Isokratická eluce Iontové párování Elektrochemická detekce => Analytickákolona a mobilnífáze je identickájako pro soupravu na Metanefriny
Metanefriny Metanefriny : - Metanefrin - Normetanefrin - 3-Methoxythyramine
Biogenní aminy metabolismus Tyrosine L-Dopa Dopamine Norepinephrine 3-Methoxythyramine Normetanephrine Homovanillic acid Epinephrine Vanillylmandelic Acid Metanephrine Catecholamines Metanephrines VMA/HVA
Chemická struktura CH(OH) CH 2 NHCH 3 CH(OH) CH 2 NH 2 Metanefrin Normetanefrin CH 2 CH 2 NH 2 3-Methoxythyramin
Vzorky Druh vzorku: - moč(24h, acidofilní) zde není dietní omezení
Separačníprincip u starésoupravy 1. Krok: Kyselá hydrolýza Dekonjugace metanefrinů 2. Krok: Komxletování katecholaminů 3. Krok: Vazba na kation-intoměničovou separační kolonku Borátový komplex v zásaditém prostředí CH(OH) CH 2 NH 3 OOC Vazba positivně nabitých molekul: - Borát-Katecholaminový-komplex není vázán - odstranění katecholaminů 5. Krok: Vazba na anion-intoměničovou separační kolonku CH 2 NR 6. Krok: Uvolnění z kolonky CH 2 NR O CH(OH) CH 2 NH 2 Odstranění nefenolických aminů CH(OH) CH 2 NH 3 4. Krok: Uvolnění z kation-intoměničové separační kolonky OOC NH 4 Změna ph 7. Krok: HPLC analýza CH(OH) CH 2 NH 2 CH(OH) CH 2 NH 3 O
Separačníprincip u novésoupravy 1. Krok: Kyselá hydrolýza Dekonjugace metanefrinů 4. Krok: Eluce Frakcionovaná eluce Boratovým roztokem 2. Krok: Vazba na kation-intoměničovou separační kolonku (borát-komplex s vyšším ph) OOC CH(OH) CH 2 NH 2 CH(OH) CH 2 NH 3 OOC Vazba kladně nabitých molekul B OH OH O Změna ph 3. Krok: Promytí Promývací krok s destilovanou vodou Odstranění slabě navázaných molekul 4. Krok: Promytí Promytí borátovým roztokem Odstranění katecholaminů
Frakcionovaná eluce 5 ml Reag3 promytí 4 ml Reag 3 eluce množstvíreag 3 / ph
Separačníprincip u novésoupravy 1. Krok: Kyselá hydrolýza Dekonjugace metanefrinů 4. Krok: Eluce Frakcionovaná eluce Boratovým roztokem 2. Krok: Vazba na kation-intoměničovou separační kolonku (borát-komplex s vyšším ph) OOC CH(OH) CH 2 NH 2 CH(OH) CH 2 NH 3 OOC Vazba kladně nabitých molekul B OH OH O Změna ph 3. Krok: Promytí Promývací krok s destilovanou vodou Odstranění slabě navázaných molekul 4. Krok: Promytí Promytí borátovým roztokem Odstranění katecholaminů 5. Krok: změna ph 6. Krok: HPLC-Analýza CH(OH) CH 2 NH 3 ph shift
HPLC Analýza Chromatografie CH(OH) CH 2 NH 3 O S O O - chromatografie na reverznífázi za vzniku dynamického iontoměniče Detekce - Electrochemická detekce (ELCD) CH(OH) CH 2 NHCH 3 O Oxidace na ELCD
Chromatogram Stará verze Nová verze
Souprava pro močové Metanefriny Nový (Kat.č. 195-5410 / 195-5420) Starý (Kat.č. 195-5935 / 195-6087) Příprava vzorku pomocí jedné separační kolonky Automatická kontrola ph vzorků moči Dvě separační kolonky Dostupné do března 2013 Nový druh analytické kolony Nová mobilní fáze => lepší separace => méně zdraví nebezpečné(žádný MeOH) => stále plněkompatibilníse soupravou pro Katecholaminy => Mobilnífáze a kolona nejsou kompatibilníse starou verzí soupravy => Příprava vzorku neníkompatibilnís starou mobilní fází
Souprava pro močové Metanefriny Přehled produktu: Příprava vzorku Kyselá hydrolýza Dekonjugace metanefrinů Katexováchromatografie Odstranění interferujících látek a katecholaminů Eluce frakční eluce HPLC Analýza Chromatografie na reversní fázi Iontové párování Elektrochemická detekce
Souprava pro močové Metanefriny Komponenty testu (195-5410) Reagencie v soupravě REAG A Acidic Reagent REAG B Basic Reagent REAG C Reconstitution Reagent REAG 1 REAG 2 REAG 3 DISP COL INT STND CAL MP Hydrolysis Reagent Dilution Reagent Wash/Elution Reagent Disposable Columns Internal Standard Calibrator Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair) HPLC kolona ANTL CRTR Analytical Cartridge (RP, 500 Inj.) Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.) Nutné vybavení laboratoře Vortex mixér, vodní lázeň
VMA/HVA/5-HIAA VMA/HVA/5-HIAA: - Kyselina vanilmandlová(vma) - Homovanilová kyselina (HVA) - 5-Hydroxyindoloctová kyselina (5-HIAA)
Chemická struktura CH(OH) COOH CH 2 COOH Kyselina vanilmandlová Homovanilová kyselina CH 2 COOH N 5-Hydroxyindoloctová kyselina
Vzorky Druh vzorku: - moč(24h, acidofilní) žádná káva, čaj, čokoláda, banány, vanilka či oříšky
Separační princip pro VMA/HVA/5-HIAA 1. Krok: Příprava vzorku pro vazbu 4. krok: Promytí CH(OH) COO Promytí s (Reag 1) + (Reag 1) a IS 2. Krok: Příprava separační kolonky 5. Krok: Uvolnění analytu ze separační kolonky Strong Anion Exchange Resin + Buffer (Reag 1) R N Hydrogensulfát sodný O S O O R N 3. Krok: Vazba na kolonku CH(OH) COO CH(OH) COO R N Binding of positiv charged molecules 6. Krok: HPLC analýza
HPLC Analýza Chromatografie CH(OH) COO R H 3 C N CH 3 R - chromatografie na reverznífázi za vzniku dynamického iontoměniče Detekce - Elektrochemický detektor (ELCD) CH(OH) COO O Oxidace na ELCD
Chromatogram
VMA/HVA/5-HIAA pro HPLC Přehled produktu Příprava vzorku Okyselení Iontoměničová chromatografie HPLC analýza Reverzní fáze Isokratická eluce Iontové párování Elektrochemická detekce
Electropherogram [%] 100 90 Detected Analyte 80 70 60 50 40 30 20 10 300 400 500 600 700 800 900 Electrochemical Cell Potential [mv] Internal Standard
VMA/HVA/5-HIAA souprava pro HPLC Komponenty testu: Reagenční spouprava REAG 1 Wash Reagent REAG 2 Elution Reagent DISP COL Disposable Columns INT STND 1 Internal Standard 1 INT STND 2 Internal Standard 2 CAL Calibrator MP Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair) TEST MIX Test mix HPLC kolona ANTL CRTR Analytical Column (RP, 500 Inj.) Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.) Vybavení laboratoře Vortex Mixér, Centrifuga
VMA rychlá metoda VMA rychlá methoda Analýza pouze VMA Snížení doby chromatografie (20 11 min) 2 vnitřní standardy (HICA + HIVA) v oddělených lahvičkách
VMA rychlá metoda triple test pouze VMA
Děkuji za pozornost!