POSTUP ELEKTROFORÉZY IZOENZYMŮ ALKALICKÉ FOSFATÁZY PRO: INTERLAB G26

POSTUP ELEKTROFORÉZY IZOENZYMŮ ALKALICKÉ FOSFATÁZY PRO: INTERLAB G26 Kit Ref.: SRE 610K - WITH REACTION SYSTEM KIT SCE610M AND EASY MASK Účel použití Souprava ALP izoenzymy SRE610K je určen pro kvalitativní a kvantitativní stanovení izoenzymů alkalické fosfatázy elektroforézou na agarózovém gelu v lidském séru. Tento kit je určen pro zpracování na plně automatizovaném přístroji Interlab G26. Shrnutí Alkalická fosfatáza je enzym, který se nachází ve všech tkáních. Tkáněmi o vysoké koncentraci ALP jsou zejména játra, žlučovody, placenta a kosti. Poškozené nebo nemocné tkáně uvolňují enzymy do krve, takže může být naměřené sérové ALP abnormální z mnoha důvodů, včetně onemocnění kostí. Sérové ALP se také zvyšuje za některých normálních okolností (např. během normálního růstu kostí) nebo při reakci na různá léčiva. Existuje mnoho variant ALP, nazývaných izoenzymy. Různé typy izoenzymů, každý rozdílné struktury a nacházející se v různých tkáních (např. jaterní a kostní ALP izoenzymy mají různé struktury) mohou být kvantifikovány v laboratoři odděleně. Na rozlišení místa poškození nebo nemocné tkáně v těle musí být provedeno testování ALP izoenzymů. Základní jsou čtyři hlavní typy ALP izoenzymů: kostní, jaterní, intestinální a placentární. Placentární izoenzymy jsou obvykle pouze u těhotných žen. Jaterní izoenzymy jsou nejčastěji zvýšené, pokud jsou zvýšené celkové hladiny ALP. Jaterní ALP se v krvi zvyšují při jaterním onemocnění ještě dříve, než většina ostatních testů na funkci jater vykáže abnormalitu. Široká skupina stavů vedoucích ke zvýšenému jaternímu ALP zahrnuje akutní hepatitidu, cirhózu, ztučnění jater, léčivy vyvolané onemocnění jater, obstrukci žlučovodů karcinomem na pankreasu, zúžení žlučovodu, primární biliární cirhózu a metastázu karcinomu v játrech. Kostní izoenzymy se zvyšují jako důsledek zvýšené aktivity osteoblastů. Tento izoenzym je normálně zvýšený u rostoucích dětí a dospělých nad padesát let. Nejvyšší hodnoty celkových ALP jsou spojeny se zvýšenou hladinou kostních izoenzymů při Pagetově chorobě nebo renální rachitidě. Abnormální vysoké hladiny kostních izoenzymů mohou také být známkou kostní rakoviny. Intestinální alkalická fosfatáza se normálně vyskytuje v séru jedinců, kteří mají krevní skupinu B nebo 0, zvláště po tučném jídle. Patologický proužek může být přítomen u perforace střev, vředové chorobě střeva a slabě při jaterní cirhóze. Princip ALP izoenzymy jsou separovány podle své mobility na agarózové destičce. Po migraci může být každá frakce detekována enzymatickou reakcí. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 1 / 12

MATERIÁL DODANÝ V KITU SRE610K 130 testů kód popis ks SFE 180M Agarózové desky 10 SCE 152M Houbičky nasycené pufrem 10 SAE 606M Jednorázové zásobníky na vzorky (10ks) 1 SCE 602A Blottery A (10ks) 2 CD Návod 1 SCE610M Reakční systém SCE 220M ALP substrát 2 SCE 223M NBT pro ALP 10 SCE 121M Neuraminidáza pro ALP 1 * Produkt SCE610M reakční systém pro ALP vyžaduje uchování při 2-8 C. Upozornění: Tento kit je určen pouze k použití jako in vitro diagnostikum! Pro správné provedení použijte všechny reagencie ze stejného kitu a dodržujte instrukce na použití. Je také nutný další materiál: mikropipety na 10 l, 25µl, 100 l, 1000-2000 l. odbarvovací roztok: 10% vodný roztok kyseliny octové Promývací roztok na aplikátory (80ml) (SRE 150M) pro Interlab G26 série 33 bez pipetování a Microgel Easy Mask (SAE910M) a Rigid Mask pro ALP (SAE820M) Odbarvovací roztok (SRE201M) Popis 1. Agarózové desky Složení: Každá deska obsahuje agarózu v Tris-barbitalovém pufru s konzervační látkou a stabilizátorem. Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava k použití: Jednotlivě zabalené desky jsou připraveny k přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Desky nezchlazujte ani nezmrazujte! DŮLEŽITÉ: desky skladujte v horizontální pozici Nepoužívejte desky po jejich datu expirace Známky znehodnocení: Přítomnost kapaliny v obalu s gelem. Nestejnoměrná tloušťka gelu znamenající dehydrataci. Kontaminace bakteriemi či houbami. 2. Houbičky nasycené pufrem Pufr: Alkalický pufr obsahující Tris barbital a stabilizátor a konzervační činidlo. Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava k použití: Určeno k přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Houbičky jsou stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Nepoužívejte po datu expirace Známky zkažení: Vyhoďte balení pokud jsou houbičky vysušené. DŮLEŽITÉ: Černé nebo hnědé skvrny na houbičkách se mohou případně objevit a nemají vliv na kvalitu výsledku. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 2 / 12

3. Roztok k promývání aplikátorů Složení: Vodný roztok surfaktantu s konzervační látkou. Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava pro použití: k přímému použití Známky zkažení: Přítomnost zákalu, sraženiny Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Roztok je stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Známky zkažení: Přítomnost vloček. 4. Jednorázové zásobníky na vzorky Složení: Jednorázové plastové destičky s mikrojamkami na vzorky. Příprava na použití: K přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). 5. Blottery A Složení: Tenké blotovací papíry na absorbci přebytku pufru z gelu. Příprava na použití: K přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). 6. Odbarvovací roztok Připravte roztok kyseliny octové 10% (obj.) v destilované vodě. 7. Odbarvovací roztok (Kód.: SRE201M; NENÍ OBSAŽEN V SOUPRAVĚ) Složení: Koncentrovaný vodný roztok kyseliny citronové. Tento produkt je klasifikován jako nebezpečný podle direktiv EC Regulation 1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Výrobek proto vyžaduje bezpečnostní list, který je v souladu s ustanoveními nařízení ES 1907/2006 a následnými změnami. Veškeré dodatečné informace týkající se rizika pro zdraví a / nebo životní prostředí jsou uvedeny v bodech 11 a 12 tohoto listu. H319: Způsobuje vážné podráždění očí. P264: Umyjte si důkladně po manipulaci ruce. P280: Používejte ochranné rukavice / ochranné brýle / obličejový štít. P305 + P351 + P338: PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: opatrně promyjte vodou po dobu několika minut. Pokud máte kontaktní čočky a lze s nimi jednoduše manipulovat, vyndejte je. Pokračujte ve vyplachování. P337 + P313: Jsou-li oči podrážděny: Vyhledejte lékařskou pomoc / ošetření. Příprava k použití: 1ml SRE201A zřeďte do 1l destilované vody. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Roztok je stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Zředěný odbarvovací roztok je stabilní 2 týdny při pokojové teplotě. Známky znehodnocení: Přítomnost zakalení a černých oxidativních skvrn. 8. Reakční systém SCE610M 8.1. ALP substrát Složení: Vodný roztok obsahující indoxylfosfát v alkalickém pufru. Tento produkt je klasifikován jako nebezpečný podle direktiv EC Regulation 1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Výrobek proto vyžaduje bezpečnostní list, který je v souladu s ustanoveními nařízení ES 1907/2006 a následnými změnami. Veškeré dodatečné informace týkající se rizika pro zdraví a / nebo životní prostředí jsou uvedeny v bodech 11 a 12 tohoto listu. H319: Způsobuje vážné podráždění očí. H315: Dráždí kůži. H411: Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. Příprava k použití: K přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte při 2 až 8 C. Substrát je stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Nepoužívejte po datu expirace na obalu. Známky znehodnocení: Barevná změna ze žluté po zelenou. Přítomnost sraženin. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 3 / 12

8.2. NBT pro ALP Složení: Produkt obsahuje Nitroblue tetrazolium. Tento produkt je klasifikován jako nebezpečný podle direktiv EC Regulation 1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Výrobek proto vyžaduje bezpečnostní list, který je v souladu s ustanoveními nařízení ES 1907/2006 a následnými změnami. Veškeré dodatečné informace týkající se rizika pro zdraví a / nebo životní prostředí jsou uvedeny v bodech 11 a 12 tohoto listu. H370: Způsobuje poškození orgánů H302: Nebezpečný při požití Příprava k použití: Otevřete lahvičku a pět minut před použitím přidejte 2 ml ALP substrátu. Lehce promíchejte na dokončení rozpouštění. Skladování a stabilita: Skladujte při 2 až 8 C. Produkt je stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Nepoužívejte po datu expirace na obalu. Známky znehodnocení: Neuvedeny. Produkt nepoužívejte, pokud není kompletně rozpuštěný po přidání substrátu. 8.3. Neuraminidáza pro ALP: Složení: neuraminidáza v pufru Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava na použití: K použití přímo. Otevřete lahvičku a přidejte 5 l neuraminidázy ke 25 l každého vzorku k přímé analýze v každé jamce. Počkejte 5 minut než začnete analýzu. Pro přístroje s integrovaným samplerem: dejte lahvičku neuraminidázy do označené jamky v přístroji. Dispenzace/ředění se provede automaticky. Hned po použití vraťte lahvičku na 2-8 C. Skladování a stabilita: Skladujte při 2 až 8 C. Substrát je stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Nepoužívejte po datu expirace na obalu. Známky znehodnocení: Neuvedeny. Způsob likvidace a zvláštní rizika K zajištění bezpečné likvidace postupujte podle místních předpisů, berte však v úvahu i všechny informace o bezpečné likvidaci použitého materiálu uvedené v Reagents Safety Sheet (bezpečnostní list), který je k dispozici u servisního technika. Další upozornění na zvláštní rizika ve vztahu k použití a likvidaci prostředku, včetně zvláštních ochranných opatření, poskytuje materiál Reagents Safety Sheet (bezpečnostní list), který je k dispozici u servisního technika. Odběr vzorků, ošetření a uchovávání Vzorky by měly být odebrány podle pravidel správné laboratorní praxe. Velmi doporučujeme používat čerstvé vzorky séra. Vzorky se separují od červených krvinek co nejdříve po odběru. Pacienti musí být nalačno přes noc. Pacienti s krevní skupinou B nebo 0, kteří jsou současně sekretoři, mohou mít zvýšené hladiny ALP asi 2 hodiny po požití tučného jídla. Séra ošetřená heparinem mohou být použita. Zchlaďte sérum na 2-8 C co nejdříve po odběru. Uchovávání vzorků: Pokud je to potřeba, uchovejte vzorky séra v dobře uzavřené zkumavce při 2-8 C až po jeden týden. Příprava vzorku: Pokud je celková aktivita ALP vyšší než 200UI/l, zřeďte vzorky séra fyziologickým roztokem, abyste dostali celkovou aktivitu ALP asi 200 UI/l. Nevhodné vzorky Vzorky, které nejsou odebrány nalačno. Vzorky ošetřené oxalátem, citrátem a EDTA proti koagulaci plazmy Hemolyzované vzorky Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 4 / 12

Jak spustit analýzu Interlab G26 provádí analýzu ALP poloautomaticky. Automatické kroky zahrnují: aplikaci vzorků na gel, elektroforetickou migraci. Následující kroky vyžadují externí ošetření agarózové destičky: enzymatickou reakci, inkubaci, denaturaci. Poslední kroky odbarvení, sušení a skenování provádí přístroj. K nastartování analýzy použijte software Elfolab/Interlab G26. Pozorně si přečtěte manuál k přístroji Interlab G26 před startem analýzy. I. Nastavení elektroforetické analýzy 1. Naplňte nádoby odpovídajícími roztoky a objemy: Nádoba Roztok Objem (l) STAIN 3 10% roztok kyseliny octové v destilované vodě 0,21 Destain Odbarvovací roztok k přímému použití 5 Distilled water Destilovaná voda 2 (kromě G26 série 33) 2. Zapněte Interlab G26. 3. Použijte program softwaru pro zvolení typu elektroforetické analýzy. 4. Zkontrolujte, že všechny čtyři aplikátory jsou ve správných pozicích. (Obr.1) 5. Interlab G26 série 33 (nelze použít pro jiné série): Dejte 6ml destilované vody do oddílu DESTILLED WATER (Obr. 2). Pak dejte 7ml promývacího roztoku z tanku WASHING SOLUTION (Obr.2) DŮLEŽITÉ: Před startem nové analýzy vždy naplňte promývací kontejnery čerstvými tekutinami! 6. Umístěte jednorázové destičky na vzorek (Ref. SAE605M) do SAMPLE (Obr. 3). 7. Dejte kovový rámeček na jednorázovou destičku (Obr. 3). 8. Interlab G26 série 33 a bez sampleru (není aplikovatelné na jiné série): Dejte 5 µl Neuraminidázy pro ALP ( SCE120M) do každé jamky 1-13. Naneste vzorky po 25 l od každého vzorku a smíchejte s neuraminidázou. Počkejte 5 minut než spustíte analýzu. 9. Interlab G26 s integrovaným samplerem (není aplikovatelné na jiné série): Pro správnou přípravu vzorků postupujte takto: 1. Vyjměte držák z přístroje (Obr. 8). 2. Vložte lahvičky vzorků počínaje pozicí 1 do prvního držáku, opatrně je přitlačte směrem dolů. 3. Vložte držák do přístroje. V případě skenování čárových kódů musí být správně otočeny, aby odpovídaly slotu (Obr. 9). Pozn.: Naplňte lahvičku na diluent neuraminidázou. DŮLEŽITÉ: před startem analýzy ověřte, že jsou víčka sejmuta. Poznámka: Je velmi doporučeno zařadit sérovou kontrolu ALP do každého testu! 10. Interlab s integrovaným samplerem (není aplikovatelné na jiné série): Naplňte kyvetu uvnitř přístroje více než 70µl neuraminidázy. Pozn.: Na konci analýzy zajistěte zbylé množství v kyvetě a dejte ho na 2-8 C. II. Příprava migrační komory (Obr. 4) 1. Vyjměte migrační komoru z přístroje. 2. Odstraňte hliníkovou folii z boxu, který obsahuje houbičky nasycené pufrem. DŮLEŽITÉ: S houbičkami manipulujte pomocí čisté pinzety či v čistých rukavicích 3. Vložte dvě houbičky nasycené pufrem do okrajových slotů. Nevkládejte houbičky do centrálních slotů. Vložte držák s houbičkami dovnitř přístroje a lehce zatlačte, zajistíte tak správné spojení komory s přístrojem DŮLEŽITÉ: Po každém běhu přístroje houbičky vždy odstraňte! Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 5 / 12

III. Příprava agarózové desky (Obr. 5) 1. Položte 1 blotovací papír A (Kód.: SCE602A) na povrch agarózové desky pro odstranění nadbytečného pufru, ujistěte se, že papír dobře přilnul k povrchu gelu a pak jej rychle odstraňte. DŮLEŽITÉ: Nenechávejte blotovací papír na gelu příliš dlouho, vyhnete se tak dehydraci (Obr.5)! 2. Umístěte gel do držáku. (Obr. 6) 3. Ujistěte se, že jsou gely správně umístěny. 4. Vložte držák gelu do startovací pozice podle čísla (Obr. 7) IV. Spuštění elektroforetické analýzy Použijte program Elfolab ke spuštění procesu, vyberte číslo a pozici držáku gelu a pozici gelu či gelů v příslušném držáku. Na konci migrace je držák gelu v parkovací pozici a gely jsou připraveny k externímu ošetření. DŮLEŽITÉ: Před startem nového běhu zkontrolujte následující: Promývací kontejnery jsou naplněny příslušnými tekutinami Hladinu tekutiny v odpadním tanku Externí ošetření na agarózovém gelu 1. Pět minut před ukončením migrace otevřete lahvičku NBT a přidejte 2 ml ALP substrátu. Opatrně zamíchejte a ujistěte se, že je prášek rozpuštěn. 2. Vložte rekonstituovaný reakční systém do malé plastové lahvičky (hnědé nebo chráněné před světlem) a centrifugujte při 5000 rpm po 2 minuty. DŮLEŽITÉ: Po použití lahvičku se substrátem pevně uzavřete a uchovejte při 2-8 C. Na konci migrace vás software požádá o vyjmutí držáku gelu. 3. Zapněte Easy Mask, vyberte program 3 (stiskněte tlačítko Program) a počkejte, až se ustálí teplota. 4. Vložte držák gelu do masky Easy Mask a přiložte rámeček bez zaklapnutí pružin. Nakonec zvedněte nožičky na zadní straně Easy Mask. 5. Stiskněte Start/Cont na Easy Mask, a pak stiskněte tlačítko Pause. 6. Umístěte Rigid Mask for ALP (SAE 820M) do černého rámečku v zařízení tak, aby se těsně přitiskly na gely. DŮLEŽITÉ: Manipulujte s Rigid Magnetic Mask opatrně, abyste zabránili poškození plastu. 7. Pipetujte do jamky v Rigid Mask pro ALP 2ml reakčního směsi. Ponechte 2 min. 8. Po inkubaci 2 minuty vydá Easy Mask zvukový signál opatrně odstraňte pipetou reakční roztok a poté i Rigid mask pro ALP. 9. Zdvihněte rámeček masky. Přiložte blotter A na gely, ujistěte se, že úplně přilnuly na povrch gelu a pak je po 10 vteřinách odstraňte. 10. Pak stiskněte na Easy Mask tlačítko Start/Cont a inkubujte 40 minut při 45 C.Na gely dejte černou plastovou destičku (SAE821M) pro ochranu gelu před světlem. DŮLEŽITÉ: Ochraňte gelovou desku před světlem během inkubace. 11. Na konci inkubace se ozve signál, stiskněte Start/Cont na Easy Mask a začne denaturace 3 min při 60 C. 12. Na konci denaturace se ozve signál, stiskněte Start/Cont na Easy Mask pro návrat do první fáze. 13. Vraťte držák gelu do parkovací pozice v Interlabu G26 a klikněte na Resume Analysis. V tomto momentu začne přístroj provádět poslední fáze ošetření gelu. Operace po analýze Po dokončení procedury doporučujeme provést tyto procesy: Odstraňte usušený gel z držáku. Odstraňte houbičky nasycené pufrem z migrační komory, vyčistěte každý slot pomocí měkkého papírového ubrousku namočeného v destilované vodě a pak sloty vysušte. Odstraňte kapaliny z pozic WASHING u aplikátorů (pouze Interlab G26 série 33) Jednorázové zásobníky na vzorky vyhoďte. Poznámka: Přečtěte si kapitolu Denní údržba v manuálu. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 6 / 12

Interpretace výsledků Elektroforéza umožňuje hodnotit podíl izoforem ALP a jejich zvýšení při určování tkáně původu (viz obr. A.) Jaterní enzymy jsou proužky nejblíže anody v tomto systému, následované kostními izoenzymy. Zvýšené hladiny kostních izoenzymů mohou mít vzhled s větší plochou. Makrohepatické (biliární) ALP migruje blíže ke katodě od kostního a intestinální varianta se může objevit jako 1,2 nebo 3 shodně umístěné proužky blíže ke katodě od makrohepatických. Placentární izoenzymy jsou velmi podobné kostním, pokud jde o migraci. Při zvýšených hladinách kostních izoenzymů nebo u dětí v růstu je možné někdy pozorovat sekundární, menší kostní variantu, pohybující se blíže ke katodě od hlavního kostního proužku. ALP-Ig komplexy mohou zůstat v bodě aplikace nebo mohou různě migrovat blíže ke katodě od intestinálních. Interpretace zvláštních případů Pro objasnění interpretace některých paternů mohou být potřeba další testy: 1. Pokud velké kostní proužky maskují možný výskyt makrohepatických, nechte znovu proběhnout test bez ošetření neuraminidázou, aby se zlepšilo rozlišení mezi kostním a makrohepatickým proužkem. U neošetřeného paternu je možné kvantifikovat makrohepatický proužek. 2. Pokud intestinální proužek maskuje možný výskyt makrohepatického proužku, nechte znovu proběhnout vzorek bez ošetření neuraminidázou. Migrace intestinálního proužku není neuraminidázou ovlivněna, zatímco makrohepatický migruje více k anodě. Na neošetřeném patternu je možné kvantifikovat makrohepatický a intestinální patern. 3. Placentární izoenzym vypadá jako kostní je nutné tepelné ošetření séra při 56 C po 10 minut, aby se inhiboval kostní a nebyl změněn placentární proužek. Ideálně s interpretací pomůže současný běh ošetřených a neošetřených vzorků. Stejně jako toto usnadní interpretaci, bude inkubace séra s 10mM L-fenylalaninu při 37 C po 10 minut inhibovat placentární a intestinální izoenzymy, čímž umožní následnou konfirmaci typu izoenzymu. Normální hodnoty Referenční hodnoty pro normální hladiny ALP izoenzymů se liší laboratoř od laboratoře, ale mohou být obecně nalezeny v následujících rozmezích. Tyto hodnoty jsou zde jako pomůcka a každá laboratoř by si měla stanovit vlastní referenční hodnoty. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 7 / 12

ALP frakce Rozmezí procent u dospělých Rozmezí procent u dětí Jaterní 40-60% 10-30% Kostní 30-70% 70-90% Makrohepatické 0% 0% Intestinální 10% 10% Denzitometrie: Kvalitativní hodnocení proužků se získá skenováním gelové desky v optickém systému (denzitometru) v přístroji. Křivky, získané s pomocí software Elfolab poskytne přístroj a zobrazí procentuální hodnoty každé frakce. Enzymatická aktivita každého proužku vyjádřená v UI/l se vypočte násobením denzitometrických procent proužku celkovou aktivitou ALP vzorku. Kontrola kvality Laboratoř by si měla pro každou šarži kontrolního materiálu stanovit hodnotící kritéria. Pokud kontroly tato kritéria nesplní, validita výsledků pacientských sér není potvrzena a analýza by měla být opakována. Vnitřní kontrola kvality Před dodáním jsou všechny šarže souprav testovány výrobcem (Interlab), je tak ověřeno, že soupravy vyhovují stanoveným požadavkům kontroly kvality - Interlab QC Procedures. Výsledky kontrolních testů jsou uvedeny v Certificate of Analysis. Řešení potíží Jestliže dodržujete návod na přípravu a skladování reagencií, pracovní postup, a přesto zjistíte změny v analytickém chování souprav, volejte servisního technika. Interference a omezení Viz kapitola Nevhodné vzorky v sekci ODBĚR VZORKU, OŠETŘENÍ A UCHOVÁVÁNÍ tohoto návodu Interferující faktory: Vysoká koncentrace fosfátů, šťavelanů, citrátů a kyanidů inhibuje aktivitu alkalické fosfatázy. Přebytek glycinu inhibuje aktivitu alkalické fosfatázy tvorbou komplexů Mg++. EDTA inhibuje všechny ALP izoenzymy kromě placentárního izoenzymu. Stejně tak léčiva mohou způsobit nerovnováhu, což může změnit hladinu a migraci různých izoenzymů. Pokud nejsou vzorky séra dobře skladovány, mohou být proteiny degradovány přítomnými enzymy. Je nezbytné dodržovat instrukce uvedené v tomto návodu v kapitole ODBĚR VZORKŮ, OŠETŘENÍ A UCHOVÁVÁNÍ Nedodržení doporučeného postupu může ovlivnit výsledky analýzy. Charakteristiky provedení Uvnitř běhu Pro tuto studii byly použity na přístroji Interlab G26 tři (3) vzorky. Každý vzorek proběhl třináctkrát na stejné gelové desce, za použití stejné šarže kitu SRE610K. Pro každou frakci byl vypočten průměr, SD a CV. Následující tabulka ukazuje získané hodnoty pro jeden vzorek: FRAKCE PRŮMĚR SD CV Jaterní 35,12 0,51 1,46 Kostní 64,88 0,51 0,79 Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 8 / 12

Mezi běhy Za použití stejné šarže reagencií kitu SRE610K byly použity tři vzorky na deseti různých gelových deskách. Pro každou frakci byl vypočten průměr, SD a CV. Následující tabulka ukazuje získané hodnoty pro jeden vzorek: FRAKCE PRŮMĚR SD CV Jaterní 49,09 1,80 3,67 Kostní 47,07 1,77 3,76 Makrohepatická 10,04 0,66 6,61 Intestinální 1 3,84 0,15 3,96 Správnost Celkem třicet sér od pacientů jak normálních tak abnormálních bylo testováno na přístroji Interlab G26 a dalším komerčním systémem na agarózovém gelu. Srovnání výsledků získaných s kitem SRE610K a s komerčním systémem ukazuje úplnou shodu dat, bez falešně negativních a falešně pozitivních výsledků. Údaje o správnosti pro každou frakci ukazuje následující tabulka: A B R Jaterní 3,2 0,98 0,98 Kostní 2,5 0,97 0,98 intestinální 4,2 0,80 0,97 Citlivost Byla připravena sériová ředění pro dva vzorky séra jednotlivě kvantifikované pro jaterní a kostní frakci. Nejnižší detekovaná aktivita jednotlivých izoenzymů pomocí denzitometrie byla 1,7 UI/l, respektive 3UI/l. Literatura 1. Fishman, W.H., Perspectives on alkaline phosphatase isoenzymes. Am J Med, 56,617-650, 1974 2. Rhone, D.P., and al Profiles of alkaline phosphatase isoenzymes in serum using cellulose acetate electrophoresis and organ-specific inhibitors. AJCP, 59, 531-541, 1973 3. Fritche, H.A, and all. Cellulose acetate electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in human serum and tissue. Clin Chem 18:5, 417-421, 1972. 4. Viot M, an al. The value of serum alkaline phosphatase and isoenzymes in the diagnosis of liver metastases. Biomedecine, 31,74.77, 1979 5. Fichman, W.H., et al. The placental isoenzymes of alkaline phosphatase in sera of normal pregnancy. AJCP, 57, 65-74, 1972 6. Garrido, J.C., and al. Comparison of three bone alkaline phosphatase quantification methods in patients with increased alkaline phosphatase activities. Clin Chem, vol.38, Nᵒ6, 1992 7. Miggiano G.A.D., and al. Placental alkaline phosphatase determination by inhibition with ethylendiaminetetracetic acid: EDTA.CCA, 145, (1985), 331-336 8. Moss, D.W., and al. Improved electrophoresis resolution of bone and liver alkaline phosphatase resulting from partial digestion with neuraminidase. CCA, 143, (1984), 177-182. 9. Wilkinson, J.H. The principles and practice of diagnostic enzymology. Edward Arnold, London 1976 10. Tietz, N.W. Ed. Enzymes in textbook of clinical chemistry. Saunders W.B. CO., 1986. 11. Wallach Jacques, M.D. Interpretation of diagnostic tests (seventh edition). 12. Schreiber W.E. et al. Agarose Gel Patterns of Alkaline Phosphatase Isoenzymes Before and After treatment with neuraminidase. AJCC Vol.90 Nᵒ2, August 1988. 13. Van Hoof, V.O. et al. Improved Agarose Electrophoretic Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem vol.34 Nᵒ9, 1988, 1857-1862 14. Chamberlain B.R. et al. A Simple Electrophoretic Method for Separating Elevated Liver and Bone Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Plasma After Neuraminidase Treatment. CCA, 208, 1992, 219-224 15. Moss D.W. Perspoctives in Alkaline Phosphatase research. Clin Chem, vol. 38, Nᵒ12.1992. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 9 / 12

KIT INTERLAB PRO ELEKTROFORÉZU ALP IZOENZYMŮ Kit Přístroj Počet testů SRE 610K Interlab G26 130 Výrobce: Interlab-srl Via Rina Monti, 26 00155 Roma Italy Vaše dotazy a požadavky na servis rádi vyřídíme na adrese distributora: BioVendor Laboratorní medicína a. s. Karásek 1767/1, 621 00 Brno Tel: 549 124 111 Fax: 549 211 465 info@biovendor.cz www.biovendor.cz Revised edition 04/2016 Revize české verze MM 22.6.2016 BEZPEČNOSTNÍ POKYNY 1. Před započetím analýzy si pečlivě přečtěte instrukce k použití. Ujistěte se, že je vše dokonale pochopeno. 2. Nepoužívejte reagencie po datu expirace. 3. Dodržujte zásady správné laboratorní praxe. Používejte laboratorní plášť, jednorázové latexové rukavice a ochranné brýle. 4. Reagencie, které mohou způsobit poškození očí či kůže mají varování. Detaily jsou obsaženy v kapitole DODÁVANÝ MATERIÁL a POPIS produktů. Bezpečnostní listy pro tyto produkty jsou k dispozici u výrobce na písemné vyžádání. 5. Se všemi chemikáliemi a reagenciemi, těmi, které vyžadují přípravu i těmi, které jsou připraveny k použití, musí být nakládáno jako s potenciálním rizikovým odpadem dle místních předpisů. ODPOVĚDNOST Reklamace budou uznány, pouze pokud budou obsahovat všechny detaily o provedení testu a výsledky. Jakékoliv úpravy postupu testu nebo změny nebo míchání složek různých kitů může mít negativní dopad na výsledky. V takovém případě nebude uznána žádost o náhradu. Bez ohledu na druh reklamace nahradí výrobce pouze náklady, které nepřesáhnou cenu soupravy. Za jakékoliv poškození kitu způsobené při přepravě nenese výrobce odpovědnost. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 10 / 12

Obr. 1: Umístění aplikátoru (všechny série) Obr. 2: Držák na promývání aplikátorů (pouze série 33) Obr. 3: Umístění držáku vzorků (všechny série) Obr. 4: Migrační komora (všechny série) Obr. 5:Odstranění přebytku pufru blotačním papírem (všechny série) Obr. 6: Zasunutí gelu (všechny série) Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 11 / 12

Obr. 7: Umístění držáku gelu (všechny série) Obr. 8: Umístění zkumavek vzorků (pouze při integrovaném sampleru) Obr. 9:Vložení držáku na vzorek (pouze s integrovaným samplerem) Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P. 00155 RomE ITALY VAT 01087511000 Tel: +39.06.22754350 Fax: +39.06.22754534 E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM 12 / 12