CAPILLARYS IMMUNOTYPING Ref. 2100 2017/05
ZAMÝŠLENÝ ÚČEL Sada CAPILLARYS IMMUNOTYPING je navržena k detekci a charakterizaci monoklonálních bílkovin (imunotypizace) v lidské moči a séru systémem CAPILLARYS, SEBIA, pro kapilární elektroforézu. SEBIA, používaná spolu se sadou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6, je určena k rozdělení bílkovin lidského séra na 6 hlavních frakcí v alkalickém tlumivém roztoku (ph 9,9). CAPILLARYS provádí automaticky všechny operační postupy a výsledkem je profil bílkovin pro kvalitativní analýzu. Každý vzorek moči nebo séra je smíchán se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A), mí (Ig M) a lehkým volným i vázaným kappa a lambda řetězcům. Bílkoviny,dělené v křemenných kapilárách, jsou přímo detekovány absorbancí při 200 nm. Detekce přítomnosti specifických reakcí s monoklonálními bílkovinami se hodnotí vizuálně na elektroforeogramu. Pro diagnostické použití In Vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "CAPILLARYS" používá pro poloautomatické přístroje CAPILLARYS, CAPILLARYS 2 a CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING. PRINCIP TESTU Elektroforéza bílkovin je zavedená technika běžně používaná v klinických laboratořích pro vyšetření vzorků séra pro zjištění proteinových abnormalit (3, 5, 7, 9, 10, 18). Systém CAPILLARYS pro kapilární elektroforézu, SEBIA, byl vyvinut ke kompletní automatizaci tohoto testování s rychlým dělením a dobrým rozlišením. Tuto techniku lze z mnoha hledisek zařadit jako spojovací článek mezi klasickou zónovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií (3, 6, 7). Systém CAPILLARYS používá princip kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Elektricky nabité molekuly jsou děleny podle elektroforetické pohyblivosti v alkalickém tlumivém roztoku o určitém ph. Dělení je rovněž závislé na ph elektrolytu a elektroosmotickém toku (4, 12, 18). Abnormální frakce v elektroforeogramech bílkovin v moči a séru, primárně v zónách beta a gamaglobulinů, vždy vyvolávají podezření na výskyt monoklonálních proteinů (M-bílkovin, paraproteinů, monoklonální imunoglobulinů) a tedy ukazatelů monoklonální gamapatie. Imunotypizace se provádí metodou CAPILLARYS IMMUNOTYPING a CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE se specifickými protilátkami pro identifikaci těchto abnormálních frakcí. Systém CAPILLARYS má 8 paralelně uspořádaných kapilár. V tomto systému se ředění vzorku připravuje a nastřikuje simultánně aspirací na anodovém konci šesti kapilár. Referenční záznam (záznam ELP) pro imunotypizaci se získá nastříknutím vzorku smíšeného s roztokem ELP do kapiláry č. 1, která poskytuje kompletní záznam elektroforézy bílkovin ve vzorku. Záznamy antisér se získají nastříknutím dříve naředěných vzorků smíchaných se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A) a mí (Ig M) do kapilár a proti volným i vázaným lehkým kappa a lambda řetězcům do kapilár č. 2 a 6. Potom následuje vysokonapěťové dělení bílkovin a jejich přímá detekce při 200 nm na katodovém konci kapiláry. Kapiláry jsou ihned promývány promývacím roztokem a promytím tlumivým roztokem připraveny k další analýze. Překryv záznamů antiséra se záznamy ELP umožňuje vizualizovat úbytek a nebo zmenšení monoklonální frakce na záznamu antiséra a pro indikaci gamapatie. POZNÁMKA : Při metodě CAPILLARYS IMMUNOTYPING a CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE se bílkoviny detekují v následujícím pořadí od katody k anodě : gama globuliny, beta-2 globuliny, beta-1 globuliny, alfa-2 globuliny, alfa-1 globuliny a albumin s tím, že každá zóna obsahuje jeden či více proteinů. Komplex antigen-protilátka (mezi imunoglobuliny vzorku moči nebo séra a specifického antiséra) má velmi anodickou mobilitu (mezi zónou alfa-1 a albuminem nebo anodičtější než albumin). Imunotypizace se provádí ve čtyřech automatizovaných krocích : 1. Ředění séra nebo dialyzovaných vzorků moči specifickým ředicím roztokem v antisérovém segmentu. Toto ředění se provádí podle koncentrace imunoglobulinů ve vzorku. 2. Smíchání ředěného vzorku séra nebo moči s jednotlivým konkrétním antisérem. V kapalném médiu se tvoří rychle komplex antigen-protilátka, aniž by byl zapotřebí inkubační krok nebo odstranění imunitních komplexů. 3. Nástřiky připravovaných vzorků simultánní aspirací do 6 kapilár na anodovém konci a dělení bílkovin elektroforézou při vysokém napětí. Rozdělené bílkoviny se detekují na katodovém konci kapiláry při 200 nm, 4. Překryv záznamů ELP se záznamy antiséra (Ig G, Ig A, Ig M, kappa a lambda) umožňuje charakterizovat podezřelé monoklonální složky. Vzorky séra a moči mohou být analyzovány verzí 5.50 programu CAPILLARYS nebo vyššími. ČINIDLA A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ CAPILLARYS IMMUNOTYPING VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. ANTISÉROVÉ SEGMENTY Příprava 60 antisérových segmentů je připraveno pro použití ; každý segment je určen pro analýzu jednoho vzorku. Mají 7 jamek, z nichž každá obsahuje : tlumivý roztok k analýze (roztok ELP, žlutý), savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci gama (růžové), savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci alfa (tmavě modré), savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci mí (žlutozelené), savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s lehkými řetězci kappa (volnými i vázanými) (světle zelené), savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s lehkými řetězci kappa (volnými i vázanými) (světle modré), specifický ředicí roztok pro ředění vzorku. Každé činidlo je obarveno bezpečným barvivem. Antisérové segmenty jsou tvarovány tak, aby odpovídaly stojanům na vzorek systému CAPILLARYS. Použití Segmenty pro jedno použití pro imunotypizaci bílkovin v systému CAPILLARYS. Po sejmutí krycího víčka musí být antisérové segmenty umístěny na stojan na vzorky. - 230 - SEBIA NÁVOD - Czech
DŮLEŽITÉ : Před sejmutím víčka z antisérového segmentu se ujistěte, že v horní části jamky není ani kapka činidel ; pokud ano, sklepněte ji do kapaliny. VAROVÁNÍ : S vloženými antisérovými segmenty musí být nakládáno jako s biologicky nebezpečným materiálem. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Segmenty antisér skladujte v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na krabici. NEMRAZIT. POZNÁMKA : Během přepravy mohou být antisérové segmenty uchovány bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda čistoty pro nástřik. - 231 -
ANALÝZA VZORkŮ SÉRA : POSTUP CAPILLARYS IMMUNOTYPING POTŘEBNÁ ČINIDLA (ale neobsažená v sadě CAPILLARYS IMMUNOTYPING) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. SADA CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (SEBIA, kat. č. 2003) Příprava, použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení Viz návod obsažený v sadě. VAROVÁNÍ : Pro postup CAPILLARYS IMMUNOTYPING nepoužívejte ředicí segmenty dodávané v sadě CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. 2. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA Použití Pro opláchnutí kapilár v systému CAPILLARYS. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect* připravený k použití (SEBIA, KAT. Č. 2061 : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací kontejner je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. * POZNÁMKA : Řešení CAPIprotect lze také použít k rozředění zásobního promývacího roztoku. Pak v takovém případě může zředěný promývací roztok vykazovat přechodnou, více či méně žlutou barvu bez jakýchkoliv negativních účinků na jeho výkon. 3. CAPICLEAN Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (SEBIA, kat. č. 2058, 25 ml) obsahuje : proteolytické enzymy, povrchově aktivní láky a přídavné látky, nezbytné pro optimální provedení, v neškodných koncentracích. Použití K čištění vzorkovací sondy v automatickém systému CAPILLARYS, SEBIA, pro kapilární elektroforézu, během čisticí sekvence CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : - Je-li během týdne analyzováno méně než 500 vzorků, spusťte alespoň jednou týdně sekvenci čištění CAPICLEAN. - Jestliže je během jednoho dne analyzováno méně než 500 vzorků, ale během týdne je analyzováno více než 500 vzorků, spusťte čistící sekvenci CAPICLEAN po každých 500 analýzách. - Je-li během dne analyzováno více než 500 vzorků, spusťte sekvenci čištění CAPICLEAN jednou denně. Viz návod k roztoku CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte opakovaně diluční segmenty po vyčištění vzorkovací sondy. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2-8 C). Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEMRAZIT. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. 4. ROZTOk CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % roztoku chloridu (koncentrovaného) do 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Použití Pro čištění vzorkovací sondy systému CAPILLARYS (každotýdenní údržba pro odstranění proteinů nasorbovaných na sondu). Viz návod k CAPILLARYS, SEBIA. Použijte stojan na vzorky určený k čištění kapilár (č. 100). Umístěte zkumavku obsahující 2 ml zředěného (2-3 %) chlorovaného roztoku na pozici č. 1 ve stojanu na vzorky. Pro údržbu systému CAPILLARYS použijte stojan č. 100. V okénku "MAINTENANCE", které se objeví na obrazovce, zvolte "Launch the probe cleaning with chlorinated sodium hypochlorite solution" a potvrďte. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při pokojové teplotě. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 5. CAPILLARYS / MINICAP - PROMÝVACÍ ROZTOk Příprava Každá lahvička zásobního promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat. č. 2052, 2 lahvičky po 75 ml) se ředí do 750 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. Použití Pro promývání kapilár CAPILLARYS. Tato činidla jsou rovněž zapotřebí, pokud je počet testů v řadě nižší než 40. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby na promývací roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Podrobné informace viz pokyny. - 232 -
Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok skladujte v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní promývací roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. 6. BETA-MERkAPTOETHANOL (BME nebo 2-MERkAPTOETHANOL) (nedodávaný SEBIA) CAPILLARYS IMMUNOTYPING - 2017/05 7. ŘEDÍCÍ ROZTOk DTT (IF / IT) Složení Lahvička ředicího roztoku DTT (IF / IT) (SEBIA, kat. č. 4589 : 1 lahvička, 13 ml) obsahuje : fosfátový tlumivý roztok s ph 7,4 ± 0,5 a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Použití Ředicí roztok DTT (IF / IT) je určen pro přípravu lahvičky dithiothreitolu (DTT) na přípravu redukčního roztoku 0,5 M DTT, který se používá pro depolymerizaci monoklonálních bílkovin. Redukční roztok dithiothreitolu může být použit jako náhrada roztoku ß-merkaptoetanolu. Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. Skladování, stabilita a známky zhoršování Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém CAPILLARYS SEBIA : CAPILLARYS kat. č. 1220, CAPILLARYS 2 kat. č. 1222 nebo CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING kat. č. 1227. 2. Stojan na vzorky dodávaný se systémem CAPILLARYS. 3. Souprava nádob dodávaná se systémem CAPILLARYS : Promytí (pro naplnění destilovanou nebo deionizovanou vodu) a nádoba na odpad. VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr séra musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky lze skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu až 10 dní. Na delší skladování by měly být vzorky zmrazeny na - 18 / - 30 C do 8 hodin po odběru. Zmražené vzorky séra jsou stabilní po dobu 3 měsíců. Bílkoviny ve vzorku skladovaném při teplotě 2 až 8 C nebo 15 až 30 C podléhají degradaci, zejména složka C3, u které je kinetika degradace při teplotách 15 30 C velmi rychlá a po třech dnech ji lze jasně pozorovat. Sérum skladované při teplotě mezi 2 a 8 C nebo mezi 15 a 30 C obsahuje frakci beta-2, jejíž obsah postupně klesá a může se objevit zkresleně (s dalšími malými frakcemi, které se objeví na straně gama nebo beta-1 následně po znehodnocení složky C3), a frakci alfa-2, jejíž tvar může být mírně změněn. Po 10 dnech skladování mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování mezi 15 a 30 C se frakce beta-1 začne deformovat rozpínáním a obsah frakce beta-2 se silně sníží. V závislosti na vzorcích může být po 10 dnech skladování při teplotě mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování při teplotě mezi 15 a 30 C potenciálně narušeno automatické vrstvení frakcí provedené softwarem pro zpracování dat. POZNÁMKA : Každá laboratoř musí zajistit, že jsou vzorky přepravovány za optimálních podmínek, aby nedošlo k porušení jejich integrity (1). (1) ISO 15189 : Zdravotnické laboratoře Požadavky na kvalitu a způsobilost. Příprava vzorků Používejte neředěné vzorky séra. Při skladování při 2 až 8 C nebo po zmrazení se některá séra (zvláště ta, jež obsahují kryoglobulin nebo kryogel) mohou stát viskózními nebo se zakalit. Tyto vzorky mohou být analyzovány přímo při pokojové teplotě. Vzorky obsahující polymerizovaný imunoglobulin mohou být použity bez další úpravy. Doporučuje se pozorovat chování séra před analýzou (např. známky hemolýzy, kryoglobuliny nebo zákal). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky sér, mohl by se změnit obsah frakce beta. Nepoužívejte vzorky plazmy. Fibrinogen migruje do pozice beta-2 (větev na beta-2). POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje. Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 233 -
POSTUP Systém CAPILLARYS je multiparametrické zařízení pro analýzu sérových bílkovin v šesti paralelních kapilárách metodou CAPILLARYS IMMUNOTYPING v následující sekvenci : načtení čárového kódu stojanu se vzorky a zkumavky sérového vzorku, naředění vzorku z primární zkumavky, smíchání ředěného vzorku séra roztokem ELP / konkrétním antisérem, promytí kapilár, nastříknutí zředěných vzorků, dělení bílkovin a jejich přímá detekce v kapilárách. Manuální kroky zahrnují : vložení zkumavky se vzorkem do stojanu, vložení jednoho otevřeného antisérového segmentu do každého stojanu na vzorky, umístění stojanů do přístroje CAPILLARYS, vyjmutí stojanů se vzorky po provedení analýzy. Elektroforetická analýza v systému CAPILLARYS s metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 se musí provést nejprve s vybranými vzorky, které pravděpodobně obsahují monoklonální bílkovinu (bílkoviny) (např. s abnormálním záznamem nebo frakcí bílkovin). PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS I. PŘÍPRAVA ELEkTROFORETICkÉ ANALÝZY 1. Vyberte vzorky s abnormální frakcí bílkovin v elektroforeogramech získaných metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. 2. Zapněte přístroj a počítač CAPILLARYS 3. Nastavte program, validujte a přístroj se automaticky spustí. Po 10 minutách je systém CAPILLARYS připraven k použití. 4. Při analyzování vzorku v případě podezření na protein v gama zóně zvolte program ředění na základě celkové koncentrace imunoglobulinu v zóně gama, jak je vysvětleno níže. Ředění se na vzorek aplikuje automaticky. "HYPERGAMMA" je-li hladina celkového imunoglobulinu > 2 g/dl (hypergamaglobulinemie), "HYPOGAMMA" je-li hladina celkového imunoglobulinu < 0,8 g/dl (hypogamaglobulinemie), "STANDARD" je-li hladina celkového imunoglobulinu mezi 0,8-2 g/dl (výchozí program ředění). 5. Sada CAPILLARYS IMMUNOTYPING je zamýšlena k provádění analýzy vzorků séra podle programu "IMMUNOTYPING 6" na zařízení CAPILLARYS a s tlumivým roztokem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Pro volbu programu analýzy "IMMUNOTYPING 6" a umístnění lahvičky s pufrem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 do zařízen si přečtěte návod k obsluze zařízení CAPILLARYS. POZNÁMKA : Není nutné měnit lahvičku s tlumivým roztokem, když přepnete z metody CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 na metodu CAPILLARYS IMMUNOTYPING (a naopak). 6. Umístěte pouze jednu zkumavku do pozice č. 1 každého stojanu na vzorky, takovým způsobem, aby byly čárové kódy viditelné v otvorech stojanů. Pokud nebyla zkumavka se vzorkem, umístěná ve stojanu na vzorky, vybraná dříve, automaticky se provede program ředění "STANDARD", 7. Pro každý vzorek k analýze použijte nový antisérový segment, odstraňte víčko a vložte jej do stejného stojanu jako je stojan se vzorkem. Stojan na vzorky bude vysunut, pokud segment chybí. POZNÁMKA : Antisérové segmenty jsou tvarovány tak, aby odpovídaly stojanům na vzorku systému CAPILLARYS. 8. Zasuňte nosič se vzorky se zkumavkou se vzorkem a antisérovým segmentem do systému CAPILLARYS otvorem ve střední části přístroje. Postupně v jednom sledu lze umístit do systému až 13 stojanů se vzorky. 9. Stojany s již analyzovanými vzorky vyjměte z prostoru na levé straně přístroje. 10. Pečlivě odstraňte použité antisérové segmenty ze stojanu se vzorky a zneškodněte je. VAROVÁNÍ : S použitými antisérovými segmenty musí být nakládáno jako s biologicky nebezpečným materiálem. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků 1. Čárové kódy se načtou ze stojanu na vzorky i ze zkumavky. 2. Vzorek je zředěn v ředicím roztoku antisérového segmentu a smíchán s roztokem ELP nebo antisérem anti-ig G, anti-ig A, anti-ig M, anti-kappa a anti-lambda. Ředící jehla je proplachována po každém vzorku. S každým vzorkem se provádí vybraný program ředění. Pokud není vybraný program ředění, použije se výchozí program "STANDARD". 3. Kapiláry jsou promyty. 4. Zředěné vzorky s činidly se nastříknou do kapilár. 5. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu asi 4 minut a teplota se ovládá Peltiérovým jevem. 6. Proteiny jsou detekovány přímo skenováním při 200 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA : Tyto kroky jsou popsány pro první stojan se vzorky. Výsledky elektroforézy se objeví po 10 minutách. První dva kroky (čtení čárového kódu a ředění vzorků následujícího stojanu) jsou prováděny vždy během analýzy předchozího stojanu se vzorky. II. VÝSLEDkY ANALÝZ Na konci analýzy se každý záznam antiséra (Ig G, Ig A, Ig M, Kappa a Lambda) automaticky převrství záznamem ELP. Pokud spolu reagovaly monoklonální složka a specifické antisérum, objeví se odpovídající frakce na záznamu antiséra. Analýza sérového vzorku rozpuštěného v ředicím roztoku antisérového segmentu se provádí během imunotypizace a poskytuje elektroforetický vzor bílkoviny čistého vzorku (referenční vzor "Ref"). Tento vzor umožňuje ověřit shodu mezi analýzou bílkovin a imunotypizací. Tato srovnání umožní identifikaci a charakterizaci monoklonálních složek. DŮLEŽITÉ : Vzor čisté bílkoviny (vzor "Ref") není a ani nemůže být při imunotypizaci překrytý žádným antisérovým vzorem. III. UkONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) systému CAPILLARYS, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. - 234 -
IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB CAPILLARYS automaticky kontroluje přítomnost reagentů. DŮLEŽITÉ : Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení jednoho z následujících úkonů bude zobrazena zpráva : Vložte novou lahvičku s tlumivým roztokem a/nebo Naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a/nebo Naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a/nebo Vyprázdněte kontejner s odpadem. CAPILLARYS IMMUNOTYPING - 2017/05 VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda čistoty pro nástřik. DŮLEŽITÉ : Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS kontrola kvality Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788). POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být roztok Normal Control Serum séra SEBIA (kat. č. 4785) nebo roztok Hypergamma Control Serum SEBIA (kat. č. 4787) použit jako negativní kontrola. VÝSLEDkY Pokyny pro analýzu záznamů 1. Referenční záznam (záznam ELP) Z důvodů abnormalit se doporučuje nejprve pečlivě vyzkoušet referenční záznam (záznam ELP). Když si všimnete nějakých abnormalit na stopě ELP, všimněte si migrační pozice píku (píků) na křivce zóna alfa-2, beta, beta-gama nebo gama. Použití záznamu ELP zejména pro vyhledávání oblastí abnormalit srovnáním záznamu ELP s každým zpracovávaným rámečkem G, A, M, kappa a lambda. Abnormality mohou představovat monoklonální, biklonální, triklonální, oligoklonální složky, těžké řetězce, volné lehké řetězce atd 2. Zkoušejte všechny rámečky zpracovávané imunoglobulinem porovnat s křivkou převrstveného referenčního záznamu (záznam ELP). Hledejte nepřítomnost nebo zmenšení abnormálního píku : Ig G : Ig G je třída nejhojnějších imunoglobulinů, která se nachází v séru a obvykle se zaznamená běžné polyklonální oddělení. Obvyklé polyklonální zmenšení tohoto píku by se nemělo mylně považovat za monoklonální složku. Polyklonální oddělení se jeví jako zmenšení frakce bez jakékoli změny její symetrie. Monoklonální Ig G se projeví oddělením píku s viditelnou změnou symetrie ve srovnání se záznamem ELP. Ig A : Obvykle je Ig A v poměrně malé koncentraci ve srovnání s Ig G. Hledejte nepatrná zmenšení v gama oblasti v blízkosti beta. Záznam ELP by měl odrážet Ig A v normálních vzorcích. Ig M : záznam je podobný Ig A kromě koncentrace, která je obvykle menší. Normální vzorky budou mít velmi malé zmenšení bez změny symetrie frakce. Záznam ELP by měl odrážet záznam Ig M v normálních vzorcích. Kappa : Jsou normálně přítomné v poměru 2 kappa na každou 1 lambdu. Normálně se zaznamená 2/3 zmenšení ve frakci gama. Polyklonální oddělení se jeví jako zmenšení frakce bez jakékoli změny její symetrie. Monoklonální složka kappa se projeví oddělením píku s viditelnou změnou symetrie ve srovnání se záznamem ELP. Lambda : V důsledku poměru kappa k lambda 2:1 musí být stopa lambda přítomná v 1/3 zbytkového zmenšení ve frakci gama v normálních vzorcích. Polyklonální oddělení se jeví jako zmenšení frakce bez jakékoli změny její symetrie. Monoklonální složka lambda se projeví oddělením píku s viditelnou změnou symetrie ve srovnání se záznamem ELP. Identifikace monoklonální složky se dosáhne oznámením přítomnosti nebo oddělením abnormálního píku (píků) v odpovídajících zpracovávaných rámečcích. Například oddělení abnormálního píku v obou zpracovávaných rámečcích G i kappa by měla ukazovat na monoklonální složku Ig G a kappa. Vyhodnocení analýzy vzorků séra Nepřítomnost monoklonální složky Normální vzorek séra nebo vzorek s hypergamaglobulinemií zobrazí zmenšení polyklonálních imunoglobulinů na záznamech antisér (viditelné jako snížení frakce gama a/nebo beta) bez jakéhokoli účinku na jiné frakce bílkovin (obr. 1). Přítomnost monoklonální složky Přítomnost monoklonální bílkoviny (monoklonální gamapatie) je charakterizována zmenšením frakce s jedním z antisér proti těžkým řetězcům (gama, alfa nebo mí) a nebo antisérem proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Detekovaný monoklonální pík, obvykle ostrého a ohraničeného výskytu, musí být lokalizován ve stejné migrační vzdálenosti jako možná monoklonální frakce spatřená v referenční stopě (stopa ELP) (obr. 3 a 4). Nepřítomnost reakce s antiséry proti těžkým řetězcům a reakce s jedním z antisér proti lehkým řetězcům může svědčit o : a) velmi vzácné gamapatii Ig D nebo Ig E : potvrďte s antiséry proti těžkým řetězcům delta nebo epsilon a metodami SEBIA HYDRAGEL IF, b) gamapatii lehkého řetězce : potvrďte s antiséry proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda a metodami SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES nebo HYDRAGEL IF. Chybí-li pozitivní reakce s antiséry proti lehkým řetězcům, zatímco některé z antisér proti těžkým řetězcům reagují, může jít o velmi vzácnou gamapatii těžkých řetězců (gama, alfa nebo mí). Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent Stejné vyhodnocení může být provedeno se vzorky se dvěma nebo více monoklonálními složkami. Ve vzácných případech může proliferovat několik klonů B-buněk imunotypizací je odhaleno několik monoklonálních proužků : biklonální gamapatie je charakterizována zmenšením dvou frakcí těžkých řetězců (identických nebo různých) a dvou frakcí lehkých řetězců (identických nebo různých) (obr. 5), - 235 -
polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány zmenšením několika frakcí téhož typu těžkých řetězců a stejným typem lehkého řetězce. k potvrzení přítomnosti jednoduché monoklonální abnormality je nutná depolymerizace beta-merkaptoethanolem a opakovaná imunotypizace. V takovém případě (i) připravte 1 % β-merkaptoethanol (BME nebo 2-merkaptoethanol, 2 ME) v roztoku Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička 5 ml), (ii) systém CAPILLARYS čeká připraven na stojan na vzorky, přidejte 100 µl tohoto redukčního roztoku k 300 µl čistého séra, (iii) promíchejte na vortexu a vyčkejte maximálně 15 minut a potom zopakujte standardní postup. DŮLEŽITÉ : Po redukční úpravě pomocí β-merkaptoethanolu musí být vzorek neprodleně analyzován. V systému CAPILLARYS nesmí žádný stojan čekat na analýzu. Po úpravě β-merkaptoethanolem představuje vzorek pouze jednu monoklonální složku, pokud je ve vzorku přítomný jeden klon. Úprava snížení vzorku včetně degradace složky C3 (s vysokou deformací zóny beta) ; může se vyskytnout široká frakce mezi zónou alfa-1 a albuminem. Oligoklonální gamapatie je charakterizována nepřítomností mnohočetných, obvykle malých píků nebo odchylek s jedním nebo více typy těžkých řetězců a dvěma typy lehkých řetězců (obr. 7). Speciální případy : Pokud monoklonální frakce nezmizí úplně na záznamech antisér, zopakujte postup s vyšším ředěním vzorku. Vyberte program ředění "STANDARD" místo programu "HYPOGAMMA" nebo program ředění "HYPERGAMMA" místo programu "STANDARD". Vzorky s monoklonálními složkami při vysoké hladině celkového imunoglobulinu (program ředění "HYPERGAMMA") V takovém případě je komplex antigen - protilátka velká a široká frakce umístěná mezi zóny albuminu a alfa-1, monoklonální frakce nemusí zcela zmizet na záznamech antisér (obr. 2). Vzorky s polymerizovanými monoklonálními složkami V takovém případě je komplex antigen - protilátka velká a široká frakce umístěná mezi zóny albuminu a beta-1. Vzorky vykazující monoklonální komponenty, které migrují v jiných zónách než gama (alfa-2, beta-1 nebo beta-2) Jestliže silná monoklonální komponenta migruje v jiné zóně než gama (alfa-2, beta-1 nebo beta-2), zvolte program ředění na základě celkové koncentrace imunoglobulinů, jak je vidět na profilu (zóna gama + suspektní monoklonální proteiny v alfa-2 nebo beta). Biklonály Biklonály mohou být důsledkem komplexní nebo biklonální gamapatie nebo křížových reakcí, které jsou velmi vzácné (viz odstavec Interference a omezení). Vymizení Ig M na antisérových typech anti-kappa a lambda : V případě úplného odečtení píku s protilátkami proti Ig M, kappa a lehkým řetězcům lambda se doporučuje ošetřit vzorek redukčním přípravkem beta-merkaptoethanol (viz předchozí odstavec) a opakovat imunotypizaci. V případě vícenásobných současných reakcí s protilátkami těžkých řetězců G, A a M se doporučuje analyzovat znovu sérový vzorek výběrem možnosti ředení "OPTIMIZED" (optimalizované). POZNÁMKA : Úprava roztoku ß-merkaptoetanolu může být nahrazena úpravou dithiothreitolu rozpuštěného v ředicím roztoku DTT (IF / IT), SEBIA, kat. č. 4589. Viz kapitola "VYŽADOVANÉ REAGENTY" a pokyny pro použití ředicího roztoku DTT (IF / IT) s dalšími informacemi. Interference a omezení V mnoha studiích bylo prokázáno, že reakce antigen - protilátka je odlišná v kapalné a agarózové fázi. Postupy imunotypizace kapilární elektroforézou se provádí zcela v kapalném médiu a některá antiséra mohou někdy křížově reagovat s monoklonálními složkami přítomnými ve vzorku. Neexistuje žádné riziko falešně negativních výsledků, jako je nezjištění přítomné gamapatie. Tato křížová reakce, ke které dochází jen vzácně, může vést k určení biklonální gamapatie místo skutečné monoklonální gamapatie. Z dostupné literatury vyplývá, že není žádný rozdíl v léčbě biklonální a monoklonální gamapatie (Kyle et al, 1981). Pokud je vzorek neurčitý, může být nutné provést další testování s použitím imunofixační soupravy HYDRAGEL. Mohou být pozorovány jemné posuny mezi záznamem ELP a překrytými záznamy antisér (zvláště v zóně beta-1). Nesmějí se považovat za výsledek zmizení monoklonální frakce v jednom nebo více záznamech antisér. Použití jiných než specifických antisér pro metodu CAPILLARYS IMMUNOTYPING může ovlivnit výsledky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány. Jako u každé elektroforetické metody může být obtížné rozeznat malé monoklonální bílkoviny, které migrují spolu s dalšími normálními bílkovinami séra. Pokud jsou podezřelé malé monoklony, je nutné provést další testování imunofixační sadou SEBIA HYDRAGEL (10). Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Když je metodou CAPILLARYS pro analýzu bílkovin detekována monoklonální složka (například jako CAPILLARYS PROTEIN(E) 6) a není charakterizována metodou CAPILLARYS IMMUNOTYPING, doporučuje se zopakovat imunotypizaci vzorku dříve ošetřeného betamerkaptoethanolem (viz předchozí odstavec) a pokud nejistota přetrvává, potvrdit výsledek imunofixační technikou na agarózový gel. Řešení problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. ÚDAJE O VÝkONU Reprodukovatelnost na gelu Reprodukovatelnost na gelu byla demonstrována na pěti patologických vzorcích séra s monoklonální složkou a jednom normálním vzorku. Byly analyzovány postupem CAPILLARYS IMMUNOTYPING a ředicím programem "STANDARD" za využití dvou šarží antisérových segmentů ; oba segmenty obsahovaly stejná činidla z různých šarží (roztok ELP pro normální vzorek, a antiséra anti-ig G, anti-ig A, anti-ig M, anti-kappa a anti-lambda pro patologické vzorky). Všechna opakovaná stanovení vedla k identickým výsledkům v rámci šarže a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. S postupem CAPILLARYS IMMUNOTYPING umožňuje imunotypizace charakterizaci pouze jedné elektroforetické frakce (monoklonální složka) pro každý patologický vzorek. - 236 -
Reprodukovatelnost mezi vzorky a mezi šaržemi Reprodukovatelnost mezi analýzami byla prokázána na devíti patologických vzorcích séra, s jednou monoklonální složkou a různými koncentracemi imunoglobulinů. Tři vzorky (s celkovou hladinou Ig < 0.8 g/dl) byly analyzovány postupem CAPILLARYS IMMUNOTYPING a ředicím programem "HYPOGAMMA", třemi vzorky (s celkovou hladinou Ig mezi 0,8 a 2 g/dl) ředicím programem "STANDARD" a třemi vzorky (s celkovou hladinou Ig > 2 g/dl) ředicím programem "HYPERGAMMA". Tyto vzorky byly analyzovány 4krát se 3 šaržemi antisérových segmentů. Všechna opakování poskytla identické výsledky mezi analýzami a mezi šaržemi a záznamy přesně identifikovaných monoklonálních složek. S postupem CAPILLARYS IMMUNOTYPING umožňuje imunotypizace charakterizaci pouze jedné elektroforetické frakce (monoklonální složka) pro každý patologický vzorek. Studie shody Studie shody byla provedena pro 135 sérových vzorků mezi sadami CAPILLARYS IMMUNOTYPING a HYDRAGEL 9 IF : oběma technikami bylo analyzováno 119 různých patologických vzorků sér a 16 normálních vzorků sér. Studie prokázala 95 % shodu mezi těmito dvěma technikami : Pro 16 patologických vzorků séra : úplná shoda. Pro 119 patologických vzorků séra : - u 112 vzorků byla prokázána úplná shoda. - u 4 vzorků s velmi malým obsahem monoklonální složky ve vysoce polyklonálním pozadí byla prokázána částečná shoda. - u 3 vzorků s oligoklonálními profily se smíšenými proužky byla prokázána částečná shoda. Ve všech případech obě techniky detekovaly a charakterizovaly monoklonální bílkoviny (imunotypizace) v lidském séru v úplné shodě. Citlivost Postupným ředěním byly připraveny vzorky sér všech obsažených monoklonálních složek v normálním séru se třemi patologickými a byly analyzovány metodou CAPILLARYS IMMUNOTYPING. Výsledky jsou shrnuty níže : CAPILLARYS IMMUNOTYPING - 2017/05 Č. VZORkU 1 Ig A, K 2 Ig G, L 3 Ig M, K MONOkLONÁLNÍ SLOŽkA koncentrace (g/dl) DETEkČNÍ LIMIT (mg/dl) TYP (v původním séru) Alfa 25 0,50 Kappa 25 Gama 25 0,20 Lambda 25 Mí 25 0,39 Kappa 25 Detekční limit monoklonální složky je přibližně 25 mg/dl. POZNÁMKA : Může se lišit v závislosti na blízkosti a hodnotě interferující bílkoviny. Citlivost se bude zvyšovat pro monoklonální migraci u katodového konce zóny gama a snižovat uprostřed zóny polyklonální hypergamaglobulinemie. Detekční limit se může lišit v závislosti na umístění monoklonální složky a polyklonálního pozadí v zónách gama a beta. - 237 -
ANALÝZA VZORkŮ MOČI : POSTUP CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE POTŘEBNÁ ČINIDLA (ale neobsažená v sadě CAPILLARYS IMMUNOTYPING) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. SADA CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (SEBIA, kat. č. 2003) Příprava, použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení Viz návod obsažený v sadě. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte ředicí segmenty dodávané v sadě CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 pro postup CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE. 2. SADA CAPILLARYS / MINICAP URINE (SEBIA, kat. č. 2013) Použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Viz návod obsažený v sadě. Použití Pro přípravu vzorků moči před rozdělením humánních bílkovin z moči kapilární elektroforézou se systémem CAPILLARYS. 3. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA Použití Pro opláchnutí kapilár v systému CAPILLARYS. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect* připravený k použití (SEBIA, KAT. Č. 2061 : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací kontejner je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. * POZNÁMKA : Řešení CAPIprotect lze také použít k rozředění zásobního promývacího roztoku. Pak v takovém případě může zředěný promývací roztok vykazovat přechodnou, více či méně žlutou barvu bez jakýchkoliv negativních účinků na jeho výkon. 4. CAPICLEAN Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (SEBIA, kat. č. 2058, 25 ml) obsahuje : proteolytické enzymy, povrchově aktivní láky a přídavné látky, nezbytné pro optimální provedení, v neškodných koncentracích. Použití K čištění vzorkovací sondy v automatickém systému CAPILLARYS, SEBIA, pro kapilární elektroforézu, během čisticí sekvence CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : - Je-li během týdne analyzováno méně než 500 vzorků, spusťte alespoň jednou týdně sekvenci čištění CAPICLEAN. - Jestliže je během jednoho dne analyzováno méně než 500 vzorků, ale během týdne je analyzováno více než 500 vzorků, spusťte čistící sekvenci CAPICLEAN po každých 500 analýzách. - Je-li během dne analyzováno více než 500 vzorků, spusťte sekvenci čištění CAPICLEAN jednou denně. Viz návod k roztoku CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte opakovaně diluční segmenty po vyčištění vzorkovací sondy. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2-8 C). Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEMRAZIT. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. 5. ROZTOk CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % roztoku chloridu (koncentrovaného) do 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Použití Pro čištění vzorkovací sondy systému CAPILLARYS (každotýdenní údržba pro odstranění proteinů nasorbovaných na sondu). Viz návod k CAPILLARYS, SEBIA. Použijte stojan na vzorky, určený k čištění kapilár (č. 100). Umístěte zkumavku obsahující 2 ml zředěného (2-3 %) chlorovaného roztoku na pozici č. 1 stojanu na vzorky. Pro údržbu systému CAPILLARYS použijte stojan č. 100. V okénku "MAINTENANCE", které se objeví na obrazovce, zvolte "Launch the probe cleaning with chlorinated sodium hypochlorite solution" a potvrďte. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při pokojové teplotě. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 6. CAPILLARYS / MINICAP - PROMÝVACÍ ROZTOk Příprava Každá lahvička zásobního promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat. č. 2052, 2 lahvičky po 75 ml) se ředí do 750 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. Použití Promývání kapilár CAPILLARYS. Tyto reagenty jsou rovněž potřebné, pokud je počet testů v řadě nižší než 40. - 238 -
DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Podrobné informace viz pokyny. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřených nádobách. Zásobní promývací roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém CAPILLARYS SEBIA : CAPILLARYS kat. č. 1220, CAPILLARYS 2 kat. č. 1222 nebo CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING kat. č. 1227. 2. Stojan na vzorky dodávaný se systémem CAPILLARYS. 3. Souprava nádob dodávaná se systémem CAPILLARYS : Promytí (pro naplnění destilovanou nebo deionizovanou vodu) a nádoba na odpad. 4. Hemolyzační zkumavky (75 mm vysoká a 13 mm průměr). VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Analýza se přednostně provádí s čerstvou močí shromážděnou během 24 hodin. Odběr moči musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky moči je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu jednoho týdne. Pro skladování na delší dobu se doporučuje skladovat moč zmraženou na - 70 / - 80 C (stabilní nejméně jeden měsíc). DŮLEŽITÉ : Neskladujte vzorky při - 20 C. Roztáté či nevhodně skladované vzorky mohou vzhledem k degradaci proteinů vykazovat modifikované a jiné další struktury. POZNÁMKA : Vzorky by neměly být skladovány při pokojové teplotě! Příprava vzorků Před analýzou připravte vzorky moči podle přípravného postupu dialýzy a koncentrování popsaného v příbalovém letáku sady CAPILLARYS / MINICAP URINE (viz odstavec "Potřebné reagenty neobsažené v balení"). Použijte přímo tyto připravené vzorky moči. DŮLEŽITÉ : Technika analýzy moči kapilární elektroforézou vyžaduje 2 kroky : dialyzační krok a koncentrační krok vzorků moči pomocí dialyzačních systémů SEBIA (zkumavky 20 ml). Použijte pouze jednu zkumavku na vzorek. Potom může být shromážděný dialyzovaný a koncentrovaný vzorek moči analyzován pomocí postupů CAPILLARYS URINE a CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE. Analýzu vzorků moči proveďte nejdéle jeden den po jejich přípravě. Z důvodu omezení adsorpce bílkovin na membráně dialyzačního a koncentračního zařízení (dialyzační systém SEBIA) se nedoporučuje uchovávat vzorky v dialyzačním systému po odstředění, ale v mikrozkumavce skladované v chladničce (mezi 2 a 8 C). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky moči, mohl by se změnit obsah frakce v důsledku denaturace. Doporučuje se pozorovat vlastnosti vzorku moči po prvním odstředění (např. známky hemolýzy nebo turbidity). Neskladujte vzorky v dialyzačních a koncentračních zařízeních, některé bílkoviny by se mohly vázat na membránu. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém CAPILLARYS je multiparametrické zařízení pro analýzu bílkovin v moči v šesti paralelních kapilárách metodou CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE v následující sekvenci : načtení čárového kódu stojanu na vzorky a zkumavky vzorku moči, na ředění vzorků, smíchání ředěného vzorku moči s roztokem ELP / konkrétním antisérem, promytí kapilár, nastříknutí zředěných vzorků, dělení bílkovin a jejich přímá detekce v kapilárách. Manuální kroky zahrnují : umístění mikrozkumavek (bez víček) obsahujících vzorky pro analýzu do hemolyzační zkumavky do stojanu na vzorky ; každá zkumavka je označena čárovým kódem identifikujícím konkrétní vzorek, který odpovídá vzorku k analýze, vložení jednoho otevřeného antisérového segmentu do každého stránku na vzorky, umístění stojanů do přístroje CAPILLARYS, vyjmutí stojanů se vzorky po provedení analýzy. - 239 -
Elektroforetická analýza v systému CAPILLARYS s metodou CAPILLARYS URINE se musí provést nejprve s vybranými vzorky, které pravděpodobně obsahují monoklonální bílkovinu(bílkoviny) (např. s abnormálním záznamem nebo frakcí bílkovin). PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS I. PŘÍPRAVA ELEkTROFORETICkÉ ANALÝZY 1. Vyberte vzorky s abnormální frakcí bílkovin v elektroforeogramech získaných metodou CAPILLARYS URINE. 2. Zapněte přístroj a počítač CAPILLARYS 3. Nastavte program, validujte a přístroj se automaticky spustí. Po 10 minutách je systém CAPILLARYS připraven k použití. 4. Pro každý analyzovaný vzorek určete hodnotu "Ratio urine" (Poměr moči) abnormální frakce k charakterizaci z elektroforetického vzoru získaného analyzačním programem "URINE" (viz odstavec "Výsledek analýzy" příbalového letáku sady CAPILLARYS / MINICAP URINE). "Poměr moči" je definován poměrem plochy abnormální frakce v poměru k celkové ploše bílkovin normálního kontrolního séra. 5. Vyberte program ředění pro automatické použití podle hodnoty "Poměru moči" : "HYPOGAMMA", pokud je "Poměr moči" < 0,55, "STANDARD", pokud je "Poměr moči" mezi 0,55 a 1,55, "HYPERGAMMA", pokud je "Poměr moči" > 1,55. POZNÁMKA : Když je "Poměr moči" ± 10 % od jedné z mezních hodnot (0,55 nebo 1,55), doporučuje se vybrat ředicí program podle abnormální frakce pro charakterizaci postupem CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE : - pro zlepšení detekce slabé frakce zřeďte vzorek méně volbou ředicího programu "HYPOGAMMA" místo "STANDARD" a "STANDARD" místo "HYPERGAMMA", - pro zlepšení imunotypizace vysoké frakce zřeďte roztok méně výběrem ředicího programu "STANDARD" místo "HYPOGAMMA" a "HYPERGAMMA" místo "STANDARD". 6. Sada CAPILLARYS IMMUNOTYPING je zamýšlena k provádění analýzy vzorků moči podle programu "IMMUNOTYPING URINE" na zařízení CAPILLARYS a s tlumivým roztokem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Pro volbu programu analýzy "IMMUNOTYPING(E) URINE" a umístnění lahvičky s pufrem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 do zařízení si přečtěte návod k obsluze zařízení CAPILLARYS. POZNÁMKA : Není nutné měnit lahvičku s tlumivým roztokem, když přepnete z metody CAPILLARYS URINE na metodu CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE (a naopak). 7. Vložte jednu prázdnou hemolyzační zkumavku (slouží jako držák) do pozice č. 1 každého stojanu na vzorky a potom vložte mikrozkumavku obsahující dialyzovaný vzorek moči. Před použitím uřízněte víčko každé mikrozkumavky. 8. Víčko každé mikrozkumavky pro další skladování vzorků uschovejte, pokud je to zapotřebí. DŮLEŽITÉ : Doporučuje se identifikovat každou hemolyzační zkumavku obsahující mikrozkumavku se vzorkem k analýze štítkem s čárovým kódem specifickým pro každý vzorek. 9. Čárové kódy musí být viditelné v otvorech stojanů. Pokud nebyla zkumavka se vzorkem moči, umístěná ve stojanu na vzorky vybraná dříve, automaticky se provede program ředění "HYPOGAMMA". 10. Pro každý vzorek k analýze použijte nový antisérový segment, odstraňte víčko a vložte jej do stejného stojanu jako hemolyzační zkumavku a mikrozkumavku obsahující vzorek. Stojan na vzorky bude vysunut, pokud segment chybí. POZNÁMKA : Antisérové segmenty jsou tvarovány tak, aby odpovídaly stojanům na vzorku systému CAPILLARYS. 11. Zasuňte nosič se vzorky se zkumavkou se vzorkem a antisérovým segmentem do systému CAPILLARYS otvorem ve střední části přístroje. Postupně v jednom sledu lze umístit do systému až 13 stojanů se vzorky. 12. Stojany s již analyzovanými vzorky vyjměte z prostoru na levé straně přístroje. 13. Pečlivě odstraňte použité antisérové segmenty ze stojanů se vzorky a zneškodněte je. VAROVÁNÍ : S použitými antisérovými segmenty musí být nakládáno jako s biologicky nebezpečným materiálem. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků 1. Čárové kódy se načtou ze stojanu na vzorky i ze zkumavky. 2. Dialyzovaný vzorek moči je zředěn v ředicím roztoku antisérového segmentu a smíchán s roztokem ELP nebo antisérem anti-ig G, anti-ig A, anti- Ig M, anti-kappa a anti-lambda. Ředící jehla je proplachována po každém vzorku. S každým vzorkem se provádí vybraný program ředění. Pokud není vybraný program ředění, použije se výchozí program "HYPOGAMMA". 3. Kapiláry jsou promyty. 4. Zředěné vzorky s činidly se nastříknou do kapilár. 5. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu asi 4 minut a teplota se ovládá Peltiérovým jevem. 6. Proteiny jsou detekovány přímo skenováním při 200 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA : Tyto kroky jsou popsány pro první stojan se vzorky. Výsledky elektroforézy se objeví po 10 minutách. První dva kroky (čtení čárového kódu a ředění vzorků moči), jsou prováděny vždy během analýzy předchozího stojanu se vzorky (krok 5). II. VÝSLEDkY ANALÝZ Na konci analýzy je každý antisérový vzor (Ig G, Ig A, Ig M, kappa a lambda) automaticky překryt vzorem ELP. Pokud spolu reagovaly monoklonální složka a specifické antisérum, objeví se odpovídající frakce na záznamu antiséra. Tato srovnání umožní identifikaci a charakterizaci monoklonálních složek. Pro analýzu vzorků moči jsou pozice různých zón (albumin, alfa 1, alfa 2, beta a gama) identifikovány na obrazovce a na zprávě o výsledcích. III. UkONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) systému CAPILLARYS, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB CAPILLARYS automaticky kontroluje přítomnost reagentů. DŮLEŽITÉ : Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. CAPILLARYS IMMUNOTYPING - 2017/05-240 -