ELISAVIDITEST antiea (D) EBV IgM OD098 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: 420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISAVIDITEST antiea (D) EBV IgM ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti difúzní složce časného antigenu (EA(D)) viru Epsteina a Barrové (EBV). 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. 3. PRINCIP TESTU: ELISAVIDITEST antiea (D) EBV IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický rekombinantní antigen, který reprezentuje imunodominantní epitopy EA antigenu. Jsouli v testovaných sérech příslušné protilátky, navážou se na imobilizované proteiny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. Ředicí roztok plus obsahuje antilidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Lze jej připravit vhodným smícháním ředicího roztoku r.t.u. a RF sorbentu dle návodu. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. 1) CAL 1 lahvička 1,3 ml pozitivního kontrolního séra r.t.u. CONTROL 1 lahvička 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. CONTROL 1 lahvička 1,0 ml RF sorbentu 51x konc. RF SORBENT 51x 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgM značených peroxidázou (konjugát antiigm Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISAVIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISAVIDITEST TMBO, TMBBF. 1
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kalibrátor a kontrolní séra. Připravte si ředicí roztok plus DIL PLUS pro ředění sér následujícím způsobem: Přidejte 1 díl RF sorbentu RF SORBENT k 50 dílům ředicího roztoku r.t.u. DIL ředění 51x (např. 1 ml RF sorbentu 50 ml ředicího roztoku r.t.u.). Řeďte jen takové množství, které spotřebujete pro ředění sér v testu. Testovaná séra řeďte připraveným ředicím roztokem plus 101x (např. 5μL séra 500 μl ředicího roztoku plus). Ředicí roztok plus obsahuje antilidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10 o C. d. Konjugát antiigm Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl kontrolních sér a ředěných testovaných sér následujícím zbůsobem): První jamku naplňte ředicím roztokem plus (DIL PLUS) pro stanovení pozadí reakce. Další dvě jamky naplňte Kalibrátorem CAL a jednu jamku naplňte negativním kontrolním sérem CONTROL. Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, ) viz Schéma aplikace vzorků. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum CONTROL. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor CAL na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 60 minut (/5 min) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Napipetujte do jamek po 100 μl konjugátu antiigm Px r.t.u. CONJ. Inkubujte 60 minut (/ 5 min) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (/ 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620690 nm. 2
Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL PLUS S5 b CAL S c d e f g h CAL CONTROL S1 S2 S3 S4 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky s ředicím roztokem plus (DIL PLUS = pozadí reakce) od hodnot kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD kalibrátoru CAL. Pokud aplikujete kalibrátor na tři jamky a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cutoff hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru je uvedena v certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cutoff jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cutoff jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér : 1. Nejdříve stanovte cutoff hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cutoff hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ : Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90 1,10 / 1,11 3,00 3,01 5,00 5,01 8,00 > 8,00 Příklad: Získaná OD Kalibrátoru = 1,015; 1,081 Průměrná hodnota OD Kalibrátoru = 1,048 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor Kalibrátoru = 0,37 Cutoff hodnota = 1,048 x 0,37 = 0,388 Hodnota indexu = 0,800 / 0,388 = 2,06 Pozn.: Hodnocení / znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Ležíli sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 12 týdny později. 3
9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: VCA VCA VCA EA (D) EA (D) EBNA EBNA Stadium EBV infekce IgG IgM IgA IgG IgM 1 IgG 1 IgM EBV negativní Primární EBV infekce (časná fáze) / Primární EBV infekce ( transientní fáze) Primární EBV infekce (fáze rekonvalescence) Seropozitivní bez známek aktivní EBV infekce Reaktivovaná EBV infekce Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům nabízí VIDIA tyto soupravy: ELISAVIDITEST antiebna1 EBV IgG a IgM; ELISAVIDITEST antivca EBV IgG, IgM a IgA; ELISAVIDITEST antiea (D) EBV IgG; IFVIDITEST antivca EBV IgG a IgM; IFVIDITEST antiea EBV (DR nebo D) IgG 10. PLATNOST, SPECIFITA A CITLIVOST TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota OD Kalibrátoru CAL by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Hodnoty absorbance kontrolních sér by měly být: CONTROL < CAL (< CONTROL ). Hodnota absorbance ředicího roztoku plus (DIL PLUS = pozadí reakce) by měla být < 0,100. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy (interassay) a během testu (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±σ VK opak 16 0,395 0,016 4,1% 16 1,013 0,044 4,3% 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku): n A ±σ min max CVrepro 12 1,704 0,131 1,516 2,058 7,7% 10 1,002 0,090 0,919 1,188 9,0% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 100mg/mL pro triglyceridy. 4
11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek antihiv1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Staneli se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u., ředicí roztok r.t.u. pro séra a RF sorbent r.t.u., jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISAVIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. c. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. d. Kalibrátor, kontrolní séra, ředicí roztok, chromogensubstrát. roztok a Px konjugát jsou konzervovány ProClinem 300. e. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. f. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě 2 až 10 C v originálních obalech. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě 18 až 28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě 2 až 10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 5
14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Krok 2. Aplikujte 100 μl / jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Krok 3. Aplikujte 100 μl / jamku Px konjugátu r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Krok 4. Aplikujte 100 μl / jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Aplikujte 100 μl/ jamku stop roztoku Krok 6. Změřte absorbanci při 450 nm / 620690 nm do 20 minut Doporučená literatura Dolken G., Weitzmann U., Boldt C., Bitzer M., Brugger, Lohr W.: Enzymelinked Assay for IgG Antibodies to Epstein Barr Virus Associated Early Antigens and Viral Capsid Antigen. J.Immunol.Meth.67:225233 (1984) Henle W. & Henle G.: Seroepidemiology of the virus. In: The EpsteinBarr virus, pp. 6173, eds. Epstein M. A. & Achong B.G., Springer, Berlin, 1979. Roubalová K., Roubal J., Staňková M., Vrbová K., Jandová M. & Kouba K.: Protilátková odpověď proti EB viru u pacientů s infekční mononukleosou, Čas. lék. čes. 125: 337 341, 1986. GorgievskiHrisoho M., Hinderer W., NebelSchickel H., Horn J.,Vornhagen R., Sonneborn H., Wolf H., Siegl G.: Serodiagnosis of Infectious Mononucleosis by Using Recombinant EpsteinBarr Antigens and EnzymeLinked Immunosorbent Assay Technology. J.of Clinical Microbiology 28: 23052311, 1990 Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2014 6