STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEK
1nm 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 (the wave) X-ray UV/VIS Infrared Microwave Radio Frequency (the transition) electronic Vibration Rotation Nuclear (spectrometer) X-ray UV/VIS Infrared/Raman NMR Fluorescence
Možnosti RTG souřadnice atomů, mezimolekulové interakce, 80 % struktur v databázi Elektronový mikroskop velké komplexy, elektronový obal, nízké rozlišení NMR torzní úhly, nepřímé stavení meziatomové vzdálenosti H-H pomocí rezonance, dynamická informace FRET meziatomové vzdálenosti
RTG strukturní analýza proč??? Elektromag. záření interaguje s objekty jejichž velikost je srovnatelní s vlnovou délkou λ Limit rozlišení RTG analýzy je λ/2 Používaná vlnová délka 0.1 10 nm Vzdálenost atomů v krystalu 0.1 0.3 nm Vzdálenosti mezi atomy: C C 1.54 Å C=C 1.23 Å C N 1.45 Å
RTG strukturní analýza Max von Laue, Walter Friedrich a Paul Knipping (1912) ozářili krystal modré skalice svazkem RTG a zjistili, že rozptýlená energie se od krystalu šíří pouze v určitých směrech, zatímco v jiných vyhasíná.
RTG strukturní analýza Nedestruktivní interakce RTG záření s krystalickými materiály. Jedna z nejdůležitějších metod pro určení struktury. V RTG difrakčním obrazci je zakódována informace o vnitřní struktuře (William L. Bragg)
RTG strukturní analýza NC za chemii (1962) výzkum struktury globulárních proteinů J.C. Kendrew a M.F. Perutz
RTG strukturní analýza NC za lékařství (1962) za určení molekulární struktury nukleových kyselin F.H.C. Crick, J.D. Watson a M.H.F. Wilkins Za sto let vývoje metody 12 NC Rosalind E. Franklin
RTG strukturní analýza - princip Až na defekty uvnitř krystalové mříže je krystal upořádán trojrozměrně periodicky (větší podjednotka ribozomu 64 tisíc atomů!) krystalová struktura (nepřesně krystalová mřížka) aproximace prostorová mřížka elementární buňka Elementární buňky jsou identické co do rozměrů tak hmotné náplně a jejich orientace v prostoru. Stanovení krystalové struktury znamená určení a upřesnění souřadnic a parametrů teplotních pohybů všech atomů v elementární buňce.
RTG strukturní analýza - princip 230 prostorových grup Základní buňka Záření se rozptyluje na elektronech tato interakce je příliš slabá pro detekci rozptylu na jedné molekule použití krystalů s triliony molekul v identické orientaci.
RTG strukturní analýza - princip Krystal ozářen monochromatickým RTG zářením Difrakční obraz Dopadající primární záření se pružně rozptyluje na elektronech měřeného krystalu (vznik sekundárního difraktovaného záření).
RTG strukturní analýza - princip Difrakce (reflexe) a interference Braggův zákon 2dsinθ = nλ Známe úhel a vlnovou délku určíme vzdálenost d mezi rovinami, které lze prokládat krystalovou strukturou
RTG strukturní analýza - princip Reflektující roviny v krystalu se rozlišují hodnotami Millerových indexů hkl Každý bod obsahuje informaci o všech atomech! Difrakční vzor obsahuje informace o velikosti buňky a symetrii. Ze systematického vyhasínání určíme prostorovou grupu. Strukturní informace je určena z intenzity bodů (přesná poloha atomů a teplotně-vibrační faktory). Pro obdržení dostatečného množství informací je pořízeno více snímků z rozdílných úhlů.
RTG strukturní analýza - princip Pozice atomů je určena výpočtem mapy distribuce elektronové hustoty. Maxima mapy (těžiště elektronových obalů těžkých atomů) dobře souhlasí s pozicemi jader izolovaných atomů. Pozice se upřesňují pomocí více měření.
RTG strukturní analýza - nevýhody Výchozí materiál monokrystal nebo polykrystalický materiál (práškový - u malých molekul) RTG podává statickou informaci Krystalová struktura je prostorově zprůměrovaná do jedné elementární buňky a časově do délky trvání difrakčního experimentu přicházíme o informace o defektech reálné kryst. struktury (lze řešit pomocí metody difrakčního kontrastu). Lze, ale sledovat měnící se strukturu látky během chemické reakce in situ (časově rozlišená RTG krystalografie)
RTG strukturní analýza Dosažený stupeň rozlišení závisí na kvalitě monokrystalu. Počet difrakcí nutných k řešení souvisí se složitostí měřeného krystalu (od několika desítek u krystalu kovů až po několik milionů u krystalu virů). Doba sběru dat od hodin po několik dnů. Měření se provádí za chlazení (většinou dusíkem) 100-150 K (potlačení teplotně-vibračních pohybů a ochrana před radiačním poškozením)
RTG strukturní analýza elektronová hustota K výpočtu jsou potřeba i údaje o fázových úhlech difraktovaných paprsků (nejsou dostupné z experimentu) Úvodní neznalost fází fázový problém Hodnoty fází lze extrahovat ze souboru naměřených intenzit tzv. přímými metodami - aplikací vztahů založených na nerovnostech, statistice a počtu pravděpodobnosti na základě vztahů se vybere nejvíce pravděpodobné fázování reflexí a to se použije pro výpočet mapy elektronové hustoty a určení pozic atomů
Amplitudy a fáze jsou zakódované přímo v paprscích záření rozptýlených atomy krystalu Amplituda s rovná druhé odmocnině intenzity rozptýleného záření (změřeno difrakčním experimentem) Fáze rozptýlené vlny nemůže být změřena přímo (fázový problém)
Fázový problém Přímá metoda pro malé systémy, založeny na systematických souvislostech mezi určitými reflexemi Metoda molekulárního nahrazení - na základě podobnosti s již určenou strukturou, vzrůstající popularita se vzrůstajícím počtem struktur Metoda těžkých atomů - experimentálně pomocí anomálního rozptylu těžkých atomů (Hg, Fe, Pb, I, Se ) obsažených ve zkoumané molekule (například MAD multiple wavelength anomalous dispersion použitím vícečetné nebo jednoduché anomální difrakce MIR Multiple isomorphous replacement použitím vícečetného isomorfního nahrazení ) Upřesnění proteinové struktury se provádí výpočetně a manuálně s využitím speciálních programů (SOLVE, SHELL-X, Phaser)
Proteinová krystalografie Nutnost vysoké koncentrace Údaje o primární struktuře z nukleotidových sekvencí kódujících nukleových kyselin Kvartérní struktura elektronová mikroskopie Sekundární a kvarterní struktura RTG analýza až s rozlišením 1 Å
Vstupní struktura
Vstupní struktura Původní organismus přirozená forma včetně všech modifikací malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy, složitá izolace Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení možné problémy s modifikacemi postranních řetězců Chemická syntéza velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným sbalením proteinu In-vitro translace vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení drahé, posttranslační modifikace
Proteinová krystalografie - krystalizace Hledání vhodných podmínek (koncentrace proteinu a srážedla, teplota, ph, čistota vzorku proteinu, použitá metodika ) Zavádění robotizace a automatizace Difrakční kvalita je často nedostatečná a proměnlivá Nutnost velkého množství krystalů
Difrakční experiment Velikost základní buňky desítky až stovky Å Nízká úroveň uspořádanosti Nutnost použít silný zdroj záření (rotační anoda nebo zdroj synchrotronového záření) omezení radiačního poškození proteinových monokrystalů použitím nízké teploty (80-120 K)
RTG strukturní analýza - rozlišení 5Å 3Å 2Å - helixy jsou obtížně viditelné (jen obecné vlastnosti molekuly) - peptidový řetezec, postranní řetězce pouze jeli známa sekvence - konformace postranních řetězců
Krystalové kontakty Mezi atomy jsou velké kanály naplněné rozpouštědlem Kontakty molekul v rámci krystalu mohou a nemusí mít vliv na strukturu záleží na pozici kontaktu
Teplotní B-faktor Popisuje lokání nepřesnost v elektronové hustotě Vysoký B-faktor více nepřesná pozice atomu Ideální B < 20-30 Ų Důvody vysokých hodnot B-faktoru: 1. Termální pohyb atomů 2. Rozdílná konformace postranních řetězců 3. Neuspořádanost proteinu
Kontrola struktury Free R value (Brünger 1992) Test set of reflection is omitted in the modelling and refinement process (5-10 %). Ramachandranův graf WHATIF MOLPROBITY
Nukleární magnetická rezonance Nukleární nukleární spin a nukleární magnetický moment Magnetická jádro v magnetické poli precesní pohyb jader a Larmorova frekvence, Zeemanův jev a Boltzmanova distribuce Rezonance rezonance jader v magnetickém poli
Vlastnosti jader Nukleární spin vlastní moment hybnosti jádra daného izotopu (orbitální + spinový moment nukleonu) pouze jádra s nenulovým spin mohou absorbovat/emitovat elektromagnetické záření (1) hmotnostní číslo M liché poločíselný spin (2) hmotn. číslo M sudé + počet protonů A sudý nulový spin 16 nulový magn. moment - nepoužitelné v NMR (např. O ) (3) hmot.číslo M sudé + počet protonů A lichý celočíselný spin Skoro každý prvek má nějaký stabilní isotop s nenulovým spinem. (Výjimky: Ar, Tc, Ce, Pm) W 0 (MHz) 0 30 75 121 280 300 320 8 Nucleus 15 N 13 C 31 P 19 F 1 H 3 H
Nukleární magnetická rezonance 1 H 13 C vysoké přirozené zastoupení vysoká citlivost (1.00) malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm) velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) nízké přirozené zastoupení (1.11 %) nízká citlivost (1.76 10 4 ); po 100% isotopovém obohacení 1.59 10 2 15 N střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) nízké přirozené zastoupení (0.37 %) nízká citlivost (3.85 10 6 ); po 100% isotopovém obohacení 1.04 10 3 2 H speciální účely
Nukleární magnetická rezonance měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálněchemických vlastností prostředí sledování průběhu biochemických dějů vysoce selektivní odezva na úrovni atomů Omezení: velikost molekuly: do 10 kda ( 10 kg mol 1 ) [< 70 AA] lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů do 20 kda [< 180 AA] nutné 100% isotopové obohacení 13 C a 15 N do ~100 kda 100% isotopové obohacení 13 C, 15 N a částečné nebo úplné obohacení 2 H (odstranění 1 H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13 C) větší proteiny přístupný pouze hrubý náhled na celkovou strukturu, sekundární struktura koncentrace vzorku alespoň 0,2 mm dlouhodobá stabilita vzorku několik týdnů
Nukleární magnetická rezonance - vzorek koncentrace proteinu alespoň 0,2 0,5 mmol l 1 (obecně více = lépe) filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění úprava ph pufrem (ph typicky 4 8) vyšší ph by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu signálů přidání redukčních činidel (R SH) zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení vzorku přidání 5 10 % D 2 O referenční jádro pro spektrometr (lock)
Potlačení signálu vody jako rozpouštědlo se používá H 2 O, ne D 2 O fyziologické prostředí při použití D 2 O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H 2 O její signál je 104 105x intensivnější než signály měřené látky
Jednodimensionální 1 H NMR spektrum proteinu obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1 H, 13 C a 15 N
Vícedimenzionální spektra rozlišení informací obsažených v 1D spektrech korelace chemických posunů 1H 13C 15N propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít izotopové obohacení
NMR ověření kvality proteinu Nesbalený protein Sbalený protein
NMR - přiřazení přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule (nutnost znát sekvenci) 1. přiřazení hlavního řetězce (H N, N, H α, C α, CO) 2. přiřazení postranních řetězců (především 1 H a 13 C) Páteř pro přiřazení 1 H, 13 C a 15 N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů přenos magnetizace pomocí skalárních interakcí ( 1 J, 2 J)
NMR - Páteř
Postranní řetězce
Strukturní parametry NOE - meziatomová vzdálenost skalární interakční konstanta - dihedrální úhel chemický posun - chemické okolí residuální dipolární interakce - vzájemná orientace vazeb vodíkové vazby - detailní lokální struktura
Nukleární Overhauserův efekt (NOE) přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy A a B vlivem křížové relaxace hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů. Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity. Např. (1,8 2,5) Å; (1,8 3,5) Å; (1,8 5) Å.
Skalární interakce dihedrální úhly
Chemický posun
Vodíkové vazby
NMR shrnutí určení struktury Postranní řetězce COSY, NOESY, 3D-NMR Sekundární struktura chemické posuny (páteř) dipolární interakce J-interakce (torze) Terciální struktura NOE intenzity
Elektronový mikroskop Optický přístroj, kde fotony jsou nahrazeny elektrony a skleněné čočky elektromagnetickými čočkami Elektromagnetická čočka cívka co vytváří tvarované magnetické pole TEM (transmisní elektronový mikroskop) SEM (rastrovací elektronový mikroskop)
TEM (NC 1986, objev 1932 Ruska) Zobrazuje pomocí prošlých elektronů (transmisní elektrony projdou skrz vzorek a až pak jsou detekovány) Vysoké urychlovací napětí elektronů (100-400 kv) Pro tenké vzorky (do 100 nm)
SEM Zobrazuje povrch vzorku pomocí sekundárních elektronů nebo zpětně odražených elektronů Urychlovací napětí elektronů (0.1-30 kv) Rastrovací - elektronový svazek se pohybuje po vzorku řádek po řádku v jakémsi neviditelném rastru a výsledný obraz se vytváří postupným skenováním Snadná příprava vzorku Snadná interpretace
Kryo-elektronová tomografie 200kDa 400 MDa umožňuje zobrazení velkých struktur, jako jsou buňky a organely v téměř nativním stavu Zahrnuje šokové zmrazení Rozlišení 15 30 Å
Kryo-elektronová mikroskopie používá pro jednotlivé částice především na bázi makromolekulárních komplexů, které byly izolovány a purifikovány (vyčištěny) biochemickou cestou.
FRET Fluorescence (Förster) resonance energy transfer rezonanční přenos energie z donoru v excitovaném stavu na akceptor (mezi dvěma chromofory) hybridizace DNA, konformační změny, interakce biomolekul, senzory.
Chemický posun
NOE
Skalární interakce