DEMEDITEC Calprotectin ELISA

DEMEDITEC Calprotectin ELISA Kat. č. DE849 Návod k použití soupravy VÝROBCE: Demeditec Diagnostics GmbH Lise-Meitner-Straße 2 D-24145 Kiel (Germany), tel: +49 (0)431/71922-0, fax. +49 (0)431/71922-55, email: info@demeditec.de, www.demeditec.com DISTRIBUTOR: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, Česká republika, tel.: 261 090 565, www.vidia.cz NÁZEV SOUPRAVY: DEMEDITEC Calprotectin ELISA je ELISA souprava pro kvantitativní detekci hladiny lidského kalprotektinu ve vzorcích stolice. POUŽITÍ: DEMEDITEC Calprotectin ELISA je souprava určena pro kvantitativní detekci hladiny lidského kalprotektinu (neutrofilního cytoplazmatického proteinu S100A8/A9) ve vzorcích stolice. Test se uplatní také při diagnostice idiopatických střevních zánětů (IBD = inflammatory bowel disease) jako je ulcerózní kolitida a Crohnova nemoc. Kvantifikace fekálního kalprotektinu je indikátorem závažnosti střevních zánětů. Zvýšené hladiny kalprotektinu ve stolici jsou spojovány s nárůstem rizika relapsu u pacientů s IBD 1. Nízké hladiny kalprotektinu ve stolici dobře korelují s nízkým rizikem pro odvržení alogenního intestinálního transplantátu. V tomto testu jsou použity monoklonální protilátky, aby se zabezpečilo, že bude detekován jen kalprotektin. PRINCIP TESTU: DEMEDITEC Calprotectin ELISA je ELISA souprava navržena, vyvinuta a vyrobena pro kvantitativní detekci lidského kalprotektinu ve vzorcích stolice. Tento test používá sendvičovou metodu se dvěma vybranými protilátkami, které se vážou na různé epitopy lidského kalprotektinu. Kalibrátory, kontroly a pacientské vzorky jsou přidány přímo do jamek mikrotitrační destičky, která je potažená protilátkami proti kalprotektinu. Po krátké inkubační době se destička promyje a do každé jamky se přidá konjugát monoklonální protilátky proti lidskému klaprotektinu s křenovou peroxidázou (HRP). Po druhé inkubaci se tak vytvoří sendvič, v uspořádání: protilátka na pevné fázi lidský kalprotektin konjugát monoklonální protilátky s HRP. Nenavázané monoklonální protilátky a pufr jsou odstraněny v následném promývacím kroku. Pro detekci těchto imunokomplexů se jamky inkubují se substrátem v určitém časovém intervalu a poté změřeny na spektrofotometru. Enzymatická aktivita imunokomplexu navázaného na stěnu každé jamky je přímo úměrná množství lidského kalprotektinu ve vzorku. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením absorbance versus příslušná koncentrace lidského kalprotektinu pro každý kalibrátor s použitím point-to-point nebo 4-parametrovým proložením. Koncentrace lidského fekálního kalprotektinu ve vzorku je určena přímo z této kalibrační křivky. OBSAH SOUPRAVY: Tuto soupravu skladujte při 2 8 C. Expiraci této soupravy najdete na obalu soupravy. Všechny komponenty soupravy jsou stabilní do tohoto data expirace. 1

Před použitím vytemperujte všechny reagencie na laboratorní teplotu. Nekombinujte ani nezaměňujte reagencie ze souprav různých šarží. SORB MT 12x8 stripů Ab HRP CONC 0,6 ml WASH SOLN 30x 30 ml TMB SUB 12 ml STOP SOLN 12 ml CAL 7 lahviček lyofilizátu CONTROL 3 lahvičky lyofilizátu CONJ BUF 12 ml BUF 12 ml EXTR SOLN 20x 30 ml Mikrotitrační destička potažená protilátkou proti kalprotektinu Jedna mikrotitrační destička 12x8 stripů (96 jamek) potažená protilátkou proti kalprotektinu. Destička je v rámečku a uzavřená v sáčku se zipem s desikantem uvnitř. Destičku skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Detekční protilátka Jedna lahvička obsahující 0,6 ml protilátky proti lidkému kalprotektinu v proteinové matrici. Tato reagencie musí být před použitím ředěna Ředícím pufrem pro konjugát. Tuto reagencii skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Promývací pufr koncentrovaný Jedna lahvička obsahuje 30 ml 30x koncentrovaného pufru. Před použitím zřeďte obsah s 870 ml demineralizované vody a dobře promýchejte. Po naředění tímto získáme pracovní roztok promývacího roztoku obsahujícího surfaktant ve fosfátovém pufru s neazidovými a nertuťovými konzervanty. Naředěný promývací pufr může být skladován při laboratorní teplotě a je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Substrát Jedna lahvička obsahuje 12 ml roztoku tetramethylbenzidinu (TMB) s peroxidem vodíku. Tuto reagencii skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Stop roztok Jedna lahvička obsahuje 12 ml 2N kyseliny chlorovodíkové (HCl). Tuto reagencii skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Kalibrátory 7 lahviček obsahujících lidský kalprotektin v matrici obsahující bovinní sérum a neazidové a nertuťové konzervanty. Přesnou koncentraci kalibrátorů naleznete v Certifikátu kontroly kvality. Tyto reagencie skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Kontroly 3 lahvičky obsahující lidský kalprotektin v matrici obsahující bovinní sérum a neazidové a nertuťové konzervanty. Přesnou koncentraci kalibrátorů naleznete v Certifikátu kontroly kvality. Tyto reagencie skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Ředící pufr pro konjugát Jedna lahvička obsahující 12 ml pufru v pracovní koncentraci. Tento pufr používejte jen pro ředění detekční protilátky v souladu s pracovním postupem. Tuto reagencii skladujte při 2 8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Testovací pufr Jedna lahvička obsahující 12 ml pufru v pracovní koncentraci. Tento pufr používejte v souladu s pracovním postupem. Tuto reagencii skladujte při 2-8 C, je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. Extrakční pufr koncentrovaný Jedna lahvička obsahuje 30 ml 20x koncentrovaného pufru. Před použitím obsahu nařeďte s 570 ml demineralizované vody a dobře promíchejte. Po naředění tímto získáme pracovní roztok Extrakčního pufru pro vzorky stolice a pro ředění. Naředěný Extrakční pufr může být skladován při laboratorní teplotě a je stabilní do doby expirace uvedené na obalu soupravy. 2

BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, UPOZORNĚNÍ: Všechny zvířecí produkty a deriváty byly odebrány ze zdravých zvířat. Bovinní komponenty pochází ze zemí, kde nebyl zaznamenán výskyt BSE. Nicméně, komponenty obsahující zvířecí složky by měly být považovány za potencionálně infekční. V průběhu testu používejte ochranné rukavice a s reagenciemi nakládejte jako s potencionálně infekčním materiálem. Vyhněte se kontaktu s reagenciemi obsahujícími TMB, peroxid vodíku nebo chlorovodíkovou. TMB může způsobit podráždění kůže, sliznic a také alergické reakce kůže. TMB je pravděpodobný karcinogen. Kyselina chlorovodíková může způsobit závažné podráždění při kontaktu s kůží. Zabraňte kontaktu s očima, kůží nebo oblečením. Nepožívejte nebo neinhalujte výpary. Při kontaktu omyjte vydatným množstvím vody, alespoň 15 minut. Postupujte podle správné laboratorní praxe. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: 1. Odběrové zkumavky pro vzorky stolice (např. Odběrová souprava, 50 zkumavek DE843) 2. Přesné jednokanálové pipety pro pipetování 50 μl, 100 μl and 500 μl atd. 3. Jednorázové špičky vhodné pro pipety zmíněné v předchozím bodě. 4. Jednorázová plastová láhev 100 ml nebo 1000 ml s víčkem. 5. Hliníková fólie (alobal). 6. Deionizovaná nebo destilovaná voda. 7. Plastový kryt na mikrotitrační destičku nebo polyethylenový film. 8. ELISA multikanálová promývačka nebo automatický (semi-automatický) promývací systém. 9. Spektrofotometr (reader) pro čtení absorbance při 450 nm a 650 nm nebo 630 nm. 10. Míchačka na ELISA mikrotitrační destičky (malý poloměr otáčení) 400 ± 50 rpm. PŘÍPRAVA VZORKŮ: 1. Čerstvé vzorky stolice je možné odebrat pomocí Odběrových zkumavek pro vzorky stolice od firmy Demeditec (DE843). Tyto zkumavky jsou speciálně navrženy pro jednoduchý odběr poměrně malého množství vzorky stolice do zkumavky obsahující extrakční pufr pro vzorky. Odebrané vzorky stolice je možné přepravovat při teplotě prostředí, skladovat při 2 8 C a musí být otestovány do 3 dnů. Pro delší skladování můžou být vzorky stolice skladovány při teplotě nižší než -20 C. Vyvarujte se zmrazení-rozmrazení více než 3x na každý vzorek. Data ověřující platnost testu byla získána s použitím Odběrové zkumavky pro vzorky stolice. Tyto zkumavky můžete objednat jako soupravu Odběrové zkumavky pro vzorky stolice (DE843). Každá souprava obsahuje 50 zkumavek. Použitím jiné odběrové zkumavky může být dosažen odlišný výsledek testu. 2. Alternativou pro odběr vzorků stolice k odběrovým zkumavkám od firmy Demeditec jsou dostupná komerční zařízení pro odběr stolice: Odebraný vzorek může být uskladněn při 2 8 C po dobu 6 dnů. Odebraný vzorek řeďte před testem ve dvou krocích 1:40 a 1:9. Detainí postup extrakce vzorku: a) Označte a zvažte prázdnou polypropylenovou zkumavku s inokulační kličkou (nastavte nulu tare). b) Navažte 50 100 mg stolice s použitím inokulační kličky tak, že ji umístíte do předvážené zkumavky. c) Zaznamenejte čistou váhu vzorky a ulomte inokulační kličku. Nechte spodní část kličky ve zkumavce. 3

d) Přidejte Extrakční pufr (40 dílů objemu stolice, 1 g stolice = 1 ml) do zkumavky: Hmotnost vzorku stolice (mg) Objem Extrakčního pufru (ml) 50 2,0 55 2,2 60 2,4 65 2,6 70 2,8 75 3,0 80 3,2 85 3,4 90 3,6 95 3,8 100 4,0 e) Dobře promíchejte (vortexujte) pro rozpuštění vzorků. Postavte vzorky vertikálně po dobu 30 minut při laboratorní teplotě kvůli sedimentaci nebo vzorky centrifugujte 5 minut při 3000 x g. f) Odeberte 0,15 ml čirého supernatantu (bez částic) do čisté zkumavky s 1,2 ml Extrakčního pufru. Vzorek jemně promýchejte (jemně vortexujte). Takto extrahované vzorky jsou připraveny pro měření kalprotektinu ve stolici. PRACOVNÍ POSTUP: 1. Příprava reagencí: (1) Před použitím vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. Nekombinujte ani nezaměňujte reagencie ze souprav různých šarží. (2) Před použitím nařeďte Promývací roztok koncentrovaný podle postupu v odstavci OBSAH SOUPRAVY (3) Rekonstituujte kalibrátory 1 až 7 (CAL 1 až CAL 7) a kontroly (C 1 až C 3) přidáním 0,5 ml demineralizované vody do každé lahvičky. Nechejte kalibrátory a kontroly 5 minut stát a poté dobře promýchejte převrácením zkumavky nebo jemným vortexováním. Ujistěte se, že před použitím byly všechny pevné částice kompletně rozpuštěny. Takto rekonstituované kalibrátory a kontroly neskladujte více než 3 dny při teplotě 2 8 C nebo pro delší skladování uchovejte při teplotě nižší než -10 C. Cyklus zmrazení-rozmrazení neopakujte více než 3x. (4) Testovací schéma STRIP 1 STRIP 2 STRIP 3 STRIP 4 A CAL 1 CAL 5 C 2 VZOREK 5 B CAL 1 CAL 5 C 2 VZOREK 6 C CAL 2 CAL 6 C 3 VZOREK 7 D CAL 2 CAL 6 C 3 VZOREK 8 E CAL 3 CAL 7 VZOREK 1 VZOREK 9 F CAL 3 CAL 7 VZOREK 2 VZOREK 10 G CAL 4 C 1 VZOREK 3 VZOREK 11 H CAL 4 C 1 VZOREK 4 Atd. (5) Umístěte dostatečné množství stripů do rámečku pro testování kalibrátorů, kontrol a neznámých vzorků v duplikátu. (6) Připravte si pracovní roztok Detekční protilátky ředěním 1:21 tak, že přidáte Detekční protilátku do Ředícího pufru pro konjugát. Následující tabulka ukazuje množství potřebná pro použitý počet stripů. 4

Počet stripů Ředící pufr pro konjugát Detekční protilátka 1 1 ml 50 µl 2 2 ml 100 µl 3 3 ml 150 µl 4 4 ml 200 µl 5 5 ml 250 µl 6 6 ml 300 µl 7 7 ml 350 µl 8 8 ml 400 µl 9 9 ml 450 µl 10 10 ml 500 µl 11 11 ml 550 µl 12 12 ml 600 µl Poznámka: pracovní roztok detekční protilátky musí být připraven vždy čerstvý před pipetováním do promytých jamek. 2. Příprava pacientského vzorku Pokud jste použili Odběrové zkumavky pro vzorky stolice od firmy Demeditec další zpracování vzorku není nutné. 3. Pracovní postup: (1) Do připravených jamek mikrotitrační destičky předejte 50 µl Testovacího pufru. Jemně poklepte destičku, aby se jamky rovnoměrně pokryly. (2) Do vyznačených jamek přidejte 50 µl Kalibrátorů, Kontrol a extrahovaných pacientských vzorků. (3) Dobře utěsněte destičku, zakryjte ji fólií nebo jiným materiálem pro ochranu před světlem a míchejte 1 hodinu ± 5 minut na ELISA míchačce (s malým poloměrem otáčení) při 400 až 450 rpm. (4) Těsně před koncem inkubační doby nařeďte dostatečné množství Detekční protilátky pro test. (5) Promyjte všechny jamky 5 krát 350 µl/jamku naředěným promývacím pufrem a poté kompletně odsajte obsah. Můžete také použít automatickou promývačku. (6) Přidejte 100 µl připravené Detekční protilátky do každé jamky. (7) Dobře utěsněte destičku, překryjte ji fólií nebo jiným materiálem pro ochranu před světlem a míchejte 45 minut ± 5 minut na ELISA míchačce (s malým poloměrem otáčení) při 400 až 450 rpm. (8) Promyjte všechny jamky 5 krát 350 µl/jamku naředěným promývacím pufrem a poté kompletně odsajte obsah. Můžete také použít automatickou promývačku. (9) Přidejte 100 µl Substrátu do každé jamky. (10) Zakryjte destičku hliníkovou fólií (alobalem) nebo jiným materiálem, abyste zabránili přístupu světla. Inkubujte destičku 12 minut (volitelně 8 15 minut) bez míchání při laboratorní teplotě. (11) Odstraňte hliníkovou fólii. Ihned změřte absorbanci při 620 nm (nebo při vlnových délkách od 595 nm do 650 nm podle dostupných filtrů) (12) Ihned přidejte 100 µl Stop roztoku do každé jamky. Jemně promíchejte. (13) Změřte absorbanci při 450 nm s referenčním filtrem 620 nm nebo 650 nm. POZNÁMKY K POSTUPU: 1. Doporučujeme testovat všechny kalibrátory, kontroly a neznámé vzorky v dubletech. Pro snížení množství dat a výpočet výsledků se používá průměr absorbancí těchto dubletů. 2. Uchovávejte všechny reagencie citlivé na světlo v originálních lahvičkách. 3. Uchovávejte všechny nepoužité stripy v sáčku se zipem a s desikantem uvnitř. Desikant slouží jako ochrana před vlhkostí. 4. Pečlivá technika a používání náležitě kalibrovaných pipetovacích zařízení je nezbytná pro zajištění reprodukovatelnosti testu. 5

5. Použití jiných inkubačních časů nebo teplot, než jsou stanoveny v tomto návodu, můžou ovlivnit výsledky testu. 6. Při použití orbitální míchačky (orbital mixer) s větším poloměrem (např. > 1 cm) může být použita rychlost 150 až 200 rpm. 7. Vyvarujte se tvoření bublin v destičce. Toto může mít za následek nižší vazební efektivitu a vyšší CV% při měření dubletů. 8. Všechny reagencie míchejte jemně a důkladně před použitím. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Pro proložení kalibrační křivky doporučujeme používat point-to-point nebo 4-parametrickou funkci. 1. Spočtěte průměrnou absorbanci každého dubletu. 2. Odečtěte průměrnou absorbanci Kalibrátoru 1 (0 ng/ml) od průměrně absorbance všech ostatních průměrných absorbancí. Tím získáme korigovanou absorbanci. 3. Vytvořte kalibrační křivku vynesením korigovaných absorbancí Kalibrátorů na ose Y a standardních koncentrací na ose X při použití point-to-point metody nebo log-log papíru. Pro výpočet výsledků můžou být také použity vhodné počítačové programy pro redukci dat. Koncentrace lidského kalprotektinu ve stolici pro kontroly a v pacientských vzorcích se přímo odečítají z kalibrační křivky použitím jejich příslušných korigovaných absorbancí. Měření na dvou vlnových délkách při A 620 nm a A 450/620nm umožňuje dvě možnosti výpočtu výsledku. Pro hodnoty nižší než úroveň standardu 5 doporučujeme vzít výsledky z primární kalibrační křivky při A 450/620 nm. Zatímco pro vzorky s hodnotami nad hladinou standardu 5 doporučujeme použít druhou kalibrační křivku při A 620 nm. PŘÍKLAD VÝSLEDKŮ A KALIBRAČNÍ KŘIVKY (NÍZKÉ KONCENTRACE) V tabulce jsou uvedena typická data a výsledná kalibrační křivka pro tuto Calprotectin ELISA soupravu. Nepoužívejte tuto křivku místo kalibrační křivky získané z testu. ID jamky Cal-0: 0 µg/g (0 ng/ml) Cal-1: 25 µg/g (69,5 ng/ml) Cal-2: 56,2 µg/g (156 ng/ml) Cal-3: 145 µg/g (403 ng/ml) Cal-4: 321 µg/g (892 ng/ml) Control 1 Control 2 Reader Absorbance 0,026 0,027 0,061 0,058 0,305 0,279 1,388 1,156 2,760 2,802 0,148 0,121 2,601 2,614 Absorbance 450 nm Průměr Korigovaná absorbance 0,027 0,000 0,059 0,032 0,292 0,265 1,272 1,245 2,781 2,754 0,134 0,107 2,607 2,580 Výsledky 36,1 µg/g (100 ng/ml) 291,4 µg/g (810 ng/ml) 6

Calprotectin ELISA Kalibrační křivka Calprotectin Kalibrátory g/g stolice PŘÍKLAD VÝSLEDKŮ A KALIBRAČNÍ KŘIVKY (VYSOKÉ KONCENTRACE) V tabulce jsou uvedeny typická data a výsledná kalibrační křivka pro tuto Calprotectin ELISA soupravu. Nepoužívejte tuto křivku místo kalibrační křivky získané z testu. ID jamky Cal-0: 0 µg/g (0 ng/ml) Cal-2: 56,2 µg/g (156 ng/ml) Cal-3: 145 µg/g (403 ng/ml) Cal-4: 321 µg/g (892 ng/ml) Cal-5: 669 µg/g (1860 ng/ml) Cal-6: 2000 µg/g (5560 ng/ml) Control 2 Control 3 Reader Absorbance 0,043 0,041 0,132 0,120 0,494 0,420 1,368 1,380 1,945 1,950 2,415 2,448 1,145 1,149 1,778 1,779 Absorbance 620 nm Průměr Korigovaná absorbance 0,042 0,000 0,126 0,084 0,457 0,415 1,374 1,332 1,948 1,906 2,432 2,390 1,147 1,105 1,779 1,737 Výsledky 266,3 µg/g (740 ng/ml) 423,1 µg/g (1176 ng/ml) 7

Calprotectin ELISA Kalibrační křivka Absorbance 620 nm Calprotectin Kalibrátory g/g stolice OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY: Vzorky stolic byly odebrány od zdravých dospělých osob věku 24 58 let a byly změřeny tímto ELISA testem. Doporučená hodnota cut-off pro koncentraci kalprotektinu ve stolici při použití této ELISA soupravy a odběrového systému na vzorky je 120 ng/ml nebo 43,2 µg/g odečtená z kalibrační křivky. Velmi doporučujeme, aby si každá klinická laboratoř ustanovila vlastní hodnotu cut-off měřením normálních vzorků stolic s touto ELISOU a odběrovým systémem pro vzorky. Berte na vědomí, že pacienti s probíhajícím průjmem můžou mít mnohem vyšší hladiny kalprotektinu ve stolici. Konzumace kořeněného jídla nebo alkoholu může také způsobit podráždění střev, což má za následek abnormální hladiny kalprotektinu ve stolici. Poznámka: Kalprotektin ng/ml x 0,36 = Kalprotektin µg/g Kalprotektin µg/g x 2,78 = Kalprotektin ng/ml Naprogramujte ELISA reader výběrem jednotek kalibrátorů buď v µg/g nebo ng/ml, abyste se vyhnuli manuálnímu přepočítávání. OMEZENÍ TESTU: 1. Vysoká pozitivita na kalprotektin ve stolici je pravděpodobně indikátorem závažnějšího klinicko-patologického stavu pacienta. Nicméně, nízké hladiny kalprotektinu ve stolici neindikují menší pravděpodobnost zánětu. 2. Normální hladiny kalprotektinu ve stolici nevylučují přítomnost gastrointestinálního onemocnění jako je IBD. 3. Pro vzorky s vyšší absorbancí než je nejvyšší kalibrátor doporučujeme změřit vzorky v jiném ředění (např. 1:10 nebo 1:100 v Extrakčním pufru) 4. Deionizovaná voda polyesterovou pryskyřicí může inaktivovat křenovou peroxidázu. 8

KONTROLA KVALITY: Aby byla zajištěna platnost výsledků, do každého testu je nutné zahrnout adekvátní kontroly. CHARAKTERISTIKY TESTU: Citlivost Analytická citlivost (LLOD) testu Calprotectin ELISA určena s limitem spolehlivosti 95% na 12 duplikátech nulového kalibrátoru a je přibližně 2,5 ng/ml. LLOQ byla určena vyředěním kalibrátorů a je přibližně 5 ng/ml. Efekt vysoké dávky hook efekt Výsledky z této soupravy ukázaly, že test nevykazuje efekt vysoké dávky ( hook efekt) pro kalprotektin do hladiny 40 000 ng/ml v extrakčním pufru. Přesnost Přesnost intra-assay byla ověřena měřením 3 extraktů vzorků pro 12 opakování v jednom testu. Průměrná hodnota kalprotektinu (µg/g) CV (%) 5,74 2,9 26,59 3,5 54,70 2,5 Přesnost inter-assay byla ověřena měřením 2 vzorků v duplikátech pro 4 různé testy. Průměrná hodnota kalprotektinu (µg/g) CV (%) 21,64 8,6 70,31 2,0 Přesnost mezi odběry (inter-sample collection) byla určena odběrem pěti vzorků z jednoho vyprázdnění. Tyto sdružené vzorky byly změřeny v souladu s postupem. Výsledky koncentrací kalprotektinu v ng/ml ukazují velmi uspokojivou schodu těchto vzorků. Dárce Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 CV% A 57,0 65,0 59,2 56,2 49,8 9,5 B 60,4 55,3 58,8 71,7 81,1 16,3 C 72,3 69,3 51,5 65,7 65,6 12,3 Linearita Jeden vzorek byl naředěn Testovacím pufrem a otestován. Výsledky koncentrací kalprotektinu jsou v ng/ml a jsou následující: Ředění Naměřená hodnota Očekávaná hodnota 9 Recovery % Neředěný 195,84 - - 1:2 87,88 97,92 89,7 1:4 46,58 48,96 95,1 1:8 24,53 24,48 100,2 1:16 13,77 12,24 112,5

Spike recovery Tři extrakty stolice a tři kalibrátory ze soupravy byly spikovány do různých kombinací objemů a poté otestovány. Výsledky koncentrací kalprotektinu jsou v ng/ml a jsou následující: # Původní hodnota Spikované množství Pozorovaná hodnota Očekávaná hodnota Recovery % 1 30,0 37,1 61,9 67,1 92,2 2 73,0 12,7 85,7 89,3 104,2 3 217,7 30,3 248,0 256,9 96,5 ZÁRUKA: Funkčnost tohoto produktu je garantována tak, jak je popsána na označení a v literatuře, jen když je použit v souladu se všemi instrukcemi. Firma Demeditec Diagnostics GmbH odmítá jakékoliv záruky prodejnosti nebo vhodnosti pro určitý účel a v žádném případě nenese zodpovědnost za následné škody. Výměna produktu nebo náhrada prodejní ceny je výhradním opravným prostředkem pro kupujícího. Tato záruka Vám dává specifická práva a také další práva, která se liší stát od státu. LITERATURA: 1. Tibble et al. A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn's disease. Gut.2000;47:506-513 2. Costa F et al. Calprotectin is a stronger predictive marker of relapse in ulcerative colitis than in Crohn's disease. Gut. 2005;54:364-8. 10

CALPROTECTIN ELISA: TESTOVACÍ SCHÉMA Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Krok 5. Krok 6. Krok 6. 50 l Testovacího pufru/jamku 50 l/ jamku kalibrátorů, kontrol a extrahovaných vzorků Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě na ELISA míchačce 5x promyjte 100 l/ jamku Detekční protilátky Inkubujte 45 minut při laboratorní teplotě na ELISA míchačce 5x promyjte 100 l/ jamku TMB Substrátu Inkubujte 12 minut při laboratorní teplotě bez třepání Ihned změřte absorbanci při 620 nm Ihned přidejte 100 l/ jamku Stop roztoku Změřte absorbanci při 450/650 nm Datum poslední revize: 04-2014 11