ANALÝZA LÁTEK POMOCÍ HPLC

r Univerzita J. E. Purkyně v Ústí nad Labem Přírodovědecká fakulta ANALÝZA LÁTEK POMOCÍ HPLC KCH/P422 (úloha je součástí předmětu Instrumentální analýza) Vlastimil Dohnal Ivana Kadlečková Ústí nad Labem 2013 1

Obor: Klíčová slova: Anotace: Toxikologie a analýza škodlivin, Chemie (dvouoborové), Aplikované nanotechnologie Kapalinová chromatografie, hmotnostní detekce, kofein Studijní opora je zaměřena na pochopení teoretických znalostí metody kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie a jejich praktickou aplikaci při stanovení a identifikaci kofeinu v nápojích. Projekt Mezioborové vazby a podpora praxe v přírodovědných a technických studijních programech UJEP Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.2.00/28.0296 Tento projekt byl podpořen z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky. UJEP v Ústí nad Labem, 2013 Autor: doc. RNDr. Vlastimil Dohnal, Ph.D. et Ph.D. Ing. Ivana Kadlečková 2

Obsah Pokyny pro účastníky laboratorního cvičení... 4 Teoretická část... 5 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, HPLC... 5 Princip separace... 5 Stacionární fáze... 5 Mobilní fáze... 7 Schéma kapalinového chromatografu... 7 Hmotnostní spektrometrie... 8 Převedení vzorku do plynné fáze... 8 Ionizace elektrosprejem... 8 Analyzátor... 9 Detekce iontů... 10 Kvantita a kvalita... 10 Charakteristika testovaných látek... 11 Náhradní sladidla... 11 Aspartam... 11 Acesulfam K... 12 Použití náhradních sladidel v potravinách... 13 Experimentální část... 17 1) Přístrojové vybavení a software... 17 2) Materiál... 17 3) Vlastní stanovení metodou HPLC... 18 4) Návod na spuštění a vypnutí kapalinového chromatografu... 19 Zpracování výsledků... 28 Metoda kalibrační křivky... 28 3

Pokyny pro účastníky laboratorního cvičení Každý student je povinen se seznámit s laboratorním řádem a se zásadami bezpečnosti práce v laboratoři a první pomoci při případných úrazech. Před zahájením laboratorních cvičení si musí student: zopakovat metodiku kapalinové chromatografie po stránce schematické a částečně fyzikálněchemické a znalosti základních principů hmotnostní spektrometrie. Zopakovat si metodu kalibrační křivky a přípravu kalibračních roztoků. Zopakovat si zásady statistického vyhodnocení naměřených výsledků. 4

Teoretická část Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, HPLC (angl. high-performance liquid chromatography) Princip separace Vysokoúčinná kapalinová chromatografie se řadí mezi analytické separační metody a využívá k separaci široké škály analytů. Během analýzy dochází k distribuci analytu mezi mobilní a stacionární fázi. Čas strávený v jedné nebo druhé fázi závisí na afinitě analytu k dané fázi 1. Čím delší čas stráví analyt ve stacionární (tedy nepohyblivé) fázi, tím později je eluován. Látky s nulovou afinitou ke stacionární fázi nejsou v chromatografické koloně zadržovány a jsou eluovány v tzv. mrtvém objemu. Naopak látky s vysokou afinitou vůči stacionární fázi jsou v koloně zadržovány dlouho a v některých případech nejsou z kolony eluovány. Hlavním hnacím mechanismem separačního procesu je opakovaná adsorpce analytu na rozhraní obou fází 23. Jsou využitelné všechny možné mechanismy separace- adsorpce, rozdělování na základě různé rozpustnosti, iontová výměna, molekulově sítový efekt nebo specifické interakce v afinitní chromatografii. Stacionární fáze Stacionární fáze bývá velice často zakotvena na pevném nosiči, který se nachází uvnitř chromatografické kolony. Nosičem bývají křemenné kuličky o průměru řádově v mikrometrech. Obrázek: Různé velikosti částic stacionární fáze 1 Klouda P., Moderní analytické metody, Pavel Klouda, Ostrava, 2003. 2 Churáček J. a kol., Analytická separace látek, SNTL, Praha, 1990. 3 http://is.muni.cz/th/77837/prif_m/diplomova_prace_2007.pdf 5

Obrázek: Částice stacionární fáze kolon Kinetex. Jádro nosiče je tvořeno pevným jádrem, které je pokryto tenkou vrstvičkou porézního křemene, modifikovaného stacionární fází 4. Na povrchu nosiče je na volné silanolové skupiny chemicky navázána stacionární fáze. Nejpoužívanější stacionární fází je oktadecylový zbytek (C18) a částečně i oktylový zbytek (C8). Na rozdíl od polárního povrchu křemenného nosiče (mohou zde disociovat silanolové skupiny), získává povrch nosiče modifikací C18 nebo C8 hydrofobní vlastnosti. Proto je také stacionární fáze C18 (i C8) nazývána reverzní a polární fáze zase normální. Kromě fází C18 a C8 se uplatňují i další druhy stacionárních fází jako jsou například s aminoskupinou (pro separaci sacharidů), fenylem (pro separaci aromatických látek), pentafluorfenylem (PFP) apod. Obrázek: Chemicky rozdílné stacionární fáze V některých případech je využito pevné neporézní jádro nosiče. Tím se zamezí k difúzi analytu do nosiče a sníží se rozmývání zóny analytu v průběhu separace. 4 http://chromservis.cz/item/core-shell-technology?lang=cz 6

K vysoké separační účinnosti přispívá i homogenní distribuce velikosti částic stacionární fáze a jejich pravidelné uspořádání v chromatografické koloně. Dráha, kterou musí urazit jednotlivé molekuly analytu, je pro všechny molekuly téměř shodná. Mobilní fáze Mobilní fází je zde kapalina, která je kolonou protlačována pomocí vysokotlaké pumpy za vysokého tlaku. Mobilní fází může být voda, vodný roztok anorganické či organické soli, kyseliny, pufr či směs vody/vodného roztoku a/nebo organických rozpouštědel. Ve speciálních případech se přidávají do mobilní fáze modifikátory, například pro chirální separace či micelární chromatografii. Schéma kapalinového chromatografu Kapalinový chromatogram se skládá z těchto částí: - zařízení pro uchování a transport mobilní fáze (vysokotlaké čerpadlo) - zařízení pro dávkování vzorku - zařízení pro separaci látek (chromatografická kolona, termostat kolony) - zařízení pro detekci látek popř. sběrač frakcí 7

Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie je separační technika, která převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi a vzniklé ionty separuje podle hodnoty podílu jejich hmotnosti a náboje (m/z). Základními kroky v hmotnostní spektrometrii jsou: (převedení vzorku do plynné fáze) ionizace akcelerace iontů do hmotnostního analyzátoru separace iontů hmotnostním filtrem detekce iontů Schéma hmotnostního spektrometru: Převedení vzorku do plynné fáze Hmotnostní detektory umožňují separaci iontů v elektrickém a magnetickém poli. Separace iontů probíhá ve vakuu, proto je nutné, aby před vlastní separací byl analyzovaný vzorek převeden do plynné fáze. V případě spojení hmotnostního detektoru s kapalinovou chromatografií je analyt eluován velkým množstvím kapalné mobilní fáze. Ke spojení mezi kapalinovým chromatografem a hmotnostním detektorem bývá použit nejčastěji elektrosprej či chemická ionizace za atmosférického tlaku. Obě rozhraní kromě převedení vzorku do plynné fáze provádějí i ionizaci. Ionizace elektrosprejem 8

Obrázek: Ionizace elektrosprejem 5. Mobilní fáze nebo roztok analytu vstupuje do elektrospreje tenkou vyhřívanou kapilárou. Kolem kapiláry proudí předehřátý dusík, který slouží k odpaření kapaliny. Zároveň probíhá i ionizace. Na kapiláru je vloženo vysoké elektrické napětí. Druhý pól tvoří vstup do analyzátoru hmotnostního detektoru. Vložené napětí přitahuje nabitou kapalinu, která tvoří na konci kapiláry tzv. Taylorův konus. Z něj se postupně utrhávaní nabité kapičky a vzniká nabitý aerosol. Náboj je u kapiček soustředěn na povrchu. Odpařováním rozpouštědla se zmenšuje poloměr kapek, vzrůstá povrchový náboj. Při určité velikosti kapek jsou odpudivé síly nábojů již tak velké, že dochází k roztržení kapek. Od původní kapky se oddělí malá kapička o velikosti asi 5 % původní velikosti. Tomuto procesu říkáme coulombická exploze. Postupně se kapičky zmenšují, až nakonec vzniknou suché ionty. Ty potom vstupují do analyzátoru. Při ionizaci je nutné nastavit teplotu vyhřívání kapiláry a sušícího plynu tak, aby byla dostatečná pro odpaření kapaliny a zároveň nedocházelo k degradaci termolabilních analytů. Zpravidla vznikají jednou nabité ionty, není však vyloučena i tvorba vícenabitých iontů. Analyzátor Ionty vstupují do analyzátoru, kde dochází k jejich rozdělení podle poměru hmotnost/náboj. Jako analyzátor se nejčastěji používá kvadrupólový analyzátor a nebo kvadrupólová iontová past. V našem případě budeme pracovat s kvadrupólovou iontovou pastí. 5 http://www.lamondlab.com/msresource/images/lcms/esi.jpg 9

Kvadrupólová iontová past Má tři elektrody, z nichž jedna je kruhová a dvě vyklenuté do prostoru kruhu. Tento prostor je místem, ve kterém se shromažďuje oblak iontů. Ionty mohou být v iontové pasti zachovány milisekundy i podstatně déle. Je používán kolizní plyn helium o nízkém tlaku desetin Pa. Helium třením brzdí pohyb iontů a napomáhá jejich semknutí do oblaku v iontové pasti. Změnou nastavení frekvence a amplitudy střídavého napětí jsou ionty odváděny k detektoru. Tento hmotnostní analyzátor je malý, citlivý, snadno automatizovatelný. Má nižší rozlišení, v prostoru pasti hrozí více rušivých reakcí a jeho dynamický rozsah je omezený. Obrázek: Iontová past 6. Detekce iontů Ionty, které se v iontové pasti rozseparují podle poměru m/z, jsou z pasti vypuzeny směrem k detektoru. Detektorem může být například elektronový násobič či Faradayova klec. Při dopadu záporně nabité částice do elektronového násobiče dochází k produkci velkého množství elektronů, které je úměrné počtu dopadlých elektronů. Veličina, která je měřena, je proud elektronů, tj. elektrický proud. Princip Faradayovy klece je založen na zachycení elektrického náboje a jeho následné vybití (změření). Pracuje tedy jako elektrický kondenzátor. Velikost náboje je úměrná počtu zachycených iontů. Kvantita a kvalita Intenzita výstupního signálu odpovídá počtu detekovaných iontů o daném m/z. Jedná se o kvantitativní údaj. Poměr m/z je kvalitativním údajem a je charakteristický pro atomární složení konkrétního iontu a jeho náboj. 6 http://www.chm.bris.ac.uk/ms/images/iontrap-schematic.gif 10

Charakteristika testovaných látek Laboratorní úloha, která je předmětem této opory umožňuje analyzovat syntetická sladidla (Aspartam, Acesulfam-K, Sacharin), ale i další látky, jako jsou například kofein, kyselina sorbová aj. Náhradní sladidla V souvislosti s rozšířeným použitím náhradních sladidel je důležité mít možnost tyto látky analyzovat. Náhradní sladidla, včetně sacharinu, aspartamu a cyklamátu, jsou předmětem sporů o svou zdravotní nezávadnost. Dosavadní výsledky dokazují, že povolené dávkování náhradních sladidel není pro lidský organismus škodlivé. Je však důležité mít na paměti některé negativní účinky těchto látek. Aspartam Racionální název: N-L-α-aspartyl-L-fenylalanin 1-methyl ester Compound Name (CAS): (3S)-3-amino-4-[[(1S)-1-benzyl-2-methoxy-2-oxoethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Sumární vzorec: C14H18N2O5 CAS Number: 22839-47-0 CID: 134601 Aspartam je dipeptidem, obsahuje fenylalanin, kyselinu asparagovou a methanol. Fenylalanin a kyselina asparagová mají přímý dopad na mozek a centrální nervový systém. Methanol je metabolizován na formaldehyd. V současné době je zdravotní nezávadnost aspartamu hodnocena úřadem EFSA (European Food Safety Authority) a výsledky budou známy pravděpodobně v listopadu 2013. Vzhledem k počtu posuzovaných studií je vydání závěrečné zprávy již více jak 1 rok odkládáno. Patří mezi nejznámější umělá náhradní sladidla. Je asi 200 sladší než sacharosa, bez chuťově výrazných vedlejších pachutí. Jeho dopady na zdraví jsou předmětem sporů a spekulací. Na potravinách bývá označován jako Aspartam, APM nebo E951. Aspartam byl objeven ve společnosti Searle v roce 1965 při výzkumu léku proti vředům. 78 Od přelomu 60. a 70. let firma Searle prováděla testy s perspektivou pro komerční využití. Poprvé byl schválen v roce 1983 americkým Úřadem pro kontrolu léčiv (FDA, Food and Drugs Administration). 7 http://www.wnho.net/history_of_aspartame.htm 8 http://leda.law.harvard.edu/leda/data/244/nill,_ashley_-_the_history_of_aspartame.htm 11

Aspartam se v současné době používá ve většině light nápojů (např. Coca-Cola Zero, Kofola BEZ cukru), potravin, stolních sladidel, nealkoholických nápojů, zubních past a farmaceutických výrobků. Aspartam je dipeptid, který je složen ze dvou aminokyselin (L-asparagové a L-fenylalaninu) jako metylester, které se běžně vyskytují v bílkovinách v přírodě. Je to bílý krystalický prášek, málo termostabilní, a proto se doporučují jeho kombinace s acesulfamem K. Aspartam se totiž při teplotách nad 196 C 9 rozpadne na výchozí složky, a tím ztratí svou sladkou chuť. Z tohoto důvodu se aspartam sype na moučníky až po upečení. Aspartam obsahuje fenylalanin, nesmějí ho tedy požívat lidé trpící fenylketonurií. Při dlouhém skladování se aspartam postupně rozkládá a ztrácí svou sladivost. Tyto látky můžou být i toxické oddělí se methanolová složka, ovšem ta zcela vytěká. 10 Při teplotě 30 C se rozkládá jen pomalu, při vyšších teplotách rychleji. Například cola uchovávaná při teplotě 40 C obsahuje po 8 10 týdnech jen 40 % původního množství aspartamu. Při zpracování je v těle metabolizován jako bílkovina, přičemž vzniká malé množství toxického metanolu. Aspartam byl předmětem polemik a nepravdivých zpráv již od dob svého schválení americkým úřadem pro potraviny a léčiva (FDA) v roce 1974. Kumulativní účinky z přijmu vícero potravin, obsahujících Aspartam, nejsou prozkoumány Acesulfam K Compound Name (CAS): potassium 3-methyl-5,5-dioxo-4-oxa-5$l^{6}-thia-6-azanidacyclohex-2-en-1-one Registrační číslo CAS 33665-90-6 Sumární vzorec: C 4 H 4 KNO 4 S Vzhled: bílý krystalický prášek (Acesulfam K nebo AceK) je syntetické sladidlo. V členských zemích EU je tato látka označována kódem E950. Acesulfam byl přitom původně objeven náhodně v roce 1967 ve firmě Hoechst AG (nyní Nutrinova). Acesulfam K je přibližně asi 200krát sladší než sacharóza a má mírně nahořklou 9 http://www.bezlepkovadieta.cz/?url=vykricnik&clanek=1804 10 Perry R. H., Green D. W.: Perry s chemical engineers handbook, 1998. 12

pachuť 11. Využívá se hlavně jako náhradní sladidlo v potravinářství (výroba např. minerálních ochucených vod). Akceptovatelný denní příjem (ADI) acesulfamu K je 0 15 mg/kg tělesné hmotnosti 12. Při pokojové teplotě je acesulfam draselný bílá krystalická látka. Acesulfam draselný patří mezi tzv. heterocyklické sloučeniny. Chemicky se jedná o draselnou sůl. Acesulfam K je draselná sůl, možnosti vzniku 5-chlor-acesulfamu, pro které nejsou k dispozici žádné toxikologické údaje. Sacharin Compound Name (CAS): 1,1-dioxo-1,2-benzothiazol-3-one CAS Number: 81-07-2 V členských zemích EU je tato látka označována kódem E954. Jedná se o neenergetické náhradní sladidlo, které nalezl roku 1878 chemik Constantin Fahlberg 13, vyráběné z kamenouhelného dehtu. Chutí je asi pětsetkrát sladší než cukr, má však nepříjemný hořký chuťový dojezd. Je vhodným sladidlem pro diabetiky V 19. století byl sacharin pro svou cenu a postavení nedostatkového zboží pašován obyvateli horských oblastí českého pohraničí zejména na hranici s Německem. Sacharin je sladidlo na bázi sulfanilamidu, jeho primární složkou je sulfimid kyseliny benzoové. U pacientů s alergií může sacharin způsobit nevolnost, průjem, kožní problémy, alergie nebo jiné související příznaky. Použití náhradních sladidel v potravinách Požívání sladidel v potravinách je v České republice legislativně ošetřeno Předpisem č. 4/2008 Sb. v platném znění - vyhláškou, která stanoví druhy a podmínky použití přídatných látek a extrakčních rozpouštědel při výrobě potravin. Sladidla povolená při výrobě potravin, potraviny a skupiny potravin, v nichž se mohou vyskytovat, a další podmínky použití sladidel stanoví příloha č. 5 k této vyhlášce. Nejvyšší povolené množství upravené v příloze č. 5 k této vyhlášce je vztaženo na potraviny připravené ke spotřebě podle návodu výrobce. Důležitou součástí této vyhlášky jsou také informace týkající se potravin pro počáteční a pokračovací kojeneckou výživu a výživu malých dětí. Sladidla zmíněná v příloze č. 5 nelze pro tuto věkovou skupinu použít. V roce 2009 byl přidán do výčtu sladidel neotam. Toto nově schválené sladidlo je legislativně ošetřeno ve směrnici komise 2009/163/EU ze dne 22. prosince 2009, kterou se mění směrnice Evropského parlamentu a Rady 94/35/ES o náhradních sladidlech pro použití v potravinách, pokud jde o neotam. V roce 2011 byly jako náhradní sladidlo povoleny stevioglykosidy, sladké glykosidy získávané ze stévie. 11 http://www.internimedicina.cz/pdfs/int/2012/09/09.pdf 12 http://www.emulgatory.cz/seznam-ecek/e950 13 http://aktualne.centrum.cz/veda/clanek.phtml?id=748648 - Přehmaty vědy: Diabetiky zachránily nemyté ruce 13

KOFEIN Compound Name (CAS): 1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione CAS Number: 58-08-2, CID: 2519 Sumární vzorec: C 8 H 10 N 4 O 2 Vzhled: bílý krystalický prášek Kofein se vyskytuje v semenech kávovníku arabského (Coffea arabica). Tyto keře jsou pěstovány v Africe, Jiţní Americe a v Arábii. Nachází se také v čaji (Camellia sinensis) a kolových ořeších (Cola acuminata), tyto ořechy se využívají při výrobě nápojů kola. V čisté formě se jedná o bílý krystalický prášek. Hlavní účinky kofeinu spočívají v blokádě receptorů pro přirozenou látku adenosin. Adenosin je součástí mechanismů, kterými tělo řídí aktivitu tkání. Kofein působí inhibicí enzymu fosfodiesterázy, která rozkládá cyklický adenosinmonofosfát, druhého posla mnoha buněčných aktivačních reakcí 14. Ve většině tkání působí adenosin na uvolnění cév, kofein pak tím, ţe blokuje adenosinové receptory vyvolává kontrakce cév a zvyšuje krevní tlak. Kofein v ledvinách uvolňuje cévy a adenosin cévy stahuje. Při relaxaci se zvyšuje průtok krve ledvinami a zvyšuje se tak tvorba moči. Můžeme tedy říci, že kofein působí jako diuretikum a zpomaluje resorpci sodíku v ledvinových tubulech. Kombinací obou těchto účinků dochází ke zvýšené produkci moči, která obvykle následuje po vypití kávy nebo čaje. Do nealkoholických nápojů se přidává hlavně pro své povzbuzující účinky. Stimuluje mozek, zvyšuje bdělost a snižuje únavu. Je součástí i řady potravních doplňků a volně prodejných léků. Kofein se velmi dobře vstřebává ze zažívacího traktu a maximální koncentrace dosahuje za 1hodinu. Na metabolizmu kofeinu se podílí celá řada enzymů. KONZERVAČNÍ PROSTŘEDKY Seznam konzervantů povolených při výrobě potravin je definován přílohou 6 Vyhlášky č. 4/2008 Sb., kterou se stanoví druhy a podmínky použití přídatných látek a extrakčních rozpouštědel při výrobě potravin 14 Stone T., Darlingtonová G., Léky, drogy, jedy, ACADEMIA, Praha, 2003. 14

Kyselina benzoová Funkční vzorec C 6 H 5 COOH CAS Number: 65-85-0 Vzhled: bezbarvá až bílá krystalická látka ( za normálních podmínek) V členských zemích EU je tato kyselina označována kódem E210, její sodné soli E211, draselné E212 a vápenaté E213). Jedná se o nejjednodušší aromatickou jednosytná karboxylovou kyselinu. Využívá se jako konzervační prostředek, léčivo proti kožním infekcím a je velice důležitým prekurzorem v organické syntéze. Jako konzervační prostředky se přidávají do nápojů, ovocných výrobků, hořčice, chemicky vykynutého těsta a koření s ph pod 4,5. V přírodě se vyskytuje jak volně tak i ve sloučeninách, hlavně v pryskyřici benzoe a v esterech (tzv. balzámech). Kyselina benzoová se v těle odbourává na kyselinu hippurovou, která je koncovou sloučeninou metabolismu některých xenobiotik a je vylučována močí z těla. Lidské tělo vyloučí denně přibližně 0,44 g/l kyseliny hippurové, avšak pokud je organismus vystaven toluenu nebo benzoové kyselině, může tato hodnota být vyšší. WHO (Světová zdravotnická organizace) stanovila maximální tolerovatelný příjem na 5 mg/kg hmotnosti těla na den. Nežádoucí účinky kyseliny benzoové při nadměrné expozici na tělo mohou vyvolat kopřivku, astma, rinitidu nebo anafylaktický šok. Dle bezpečnostního listu kyseliny benzoové je smrtná dávka LD 50 1.700 mg/kg (orálně, potkan), smrtná koncentrace LD 50 >10.000 mg/kg (dermálně, králík), LD50 nebo LD 50 je v toxikologii označení pro dávku látky podané testovaným jedincům, která způsobí úhyn 50 % testovaných živočichů do 24 hodin od expozice. Udává se v mg/kg živé hmotnosti 15 Kyselina sorbová Compound Name (CAS): (2E,4E)-hexa-2,4-dienoic acid Sumárníí vzorec: C 6 H 8 O 2 CAS Number: 110-44-1 15 Jan Šimůnek. Mykotoxiny: Slovník výrazů [online] 15

Kyselina sorbová v lidském těle snadno metabolizuje a považuje se za nejméně škodlivé konzervační aditivum, neboť během pokusů na zvířatech nebyl prokázán žádný negativní účinek této látky na organismy. Totéž platí i pro její soli sorbany. V dávkách 5 % v potravě dokonce kyselina sorbová způsobovala zrychlený růst a prodloužení doby života krysích samců. To se vysvětlovalo především zvýšeným přísunem kalorií, neboť kyselina sorbová dodává tělu energii a aktivně posiluje tělo před infekcemi. Kyselina sorbová a její soli se rovněž používají jako konzervační látky v kosmetice a farmacii. Díky tomu byly testovány účinky těchto látek na pokožku a ukázalo se, že v koncentraci okolo 1 % způsobují podráždění sliznic, u citlivých lidí vyvolávají kopřivku. V potravinách se tyto látky objevují nejčastěji v koncentraci mezi 0,1 %-0,3 %. V roce 1998 našla ČZPI kyselinu sorbovou i v salátech (vlašský, pařížský, a další), v jemném pečivu a chlebech a to i přesto, že její použití je v těchto výrobcích zakázáno. Mimoto se kyselina sorbová nesmí do salátů přidávat, neboť by mohla maskovat přítomnost bakterií, které způsobují otravy jídla. V České republice je použití kyseliny sorbové povoleno jen pro vybrané druhy potravin. Stejně tak je tomu v USA, kde je kyselina sorbová označována jako GRAS látka (Generally recognized as safe, tj. bezpečná látka nepodléhající regulaci). Dle bezpečnostního listu kyseliny sorbové je smrtná dávka LD 50 7.360 mg/kg (orálně, potkan), smrtná koncentrace LD 50 >1.000 mg/kg (dermálně, králík), 16

Experimentální část 1) Přístrojové vybavení a software Kapalinový chromatograf Thermo Surveyor automatický dávkovač vzorků Surveyor Autosampler Plus kvartérní pumpy s odplyňovací jednotkou Surveryor MS Pump Plus UV-VIS spektrofotometrický detektor s diodovým polem Surveyor PDA Plus a hmotnostním detektorem LCQ FLEET vybaveného iontovou pastí chromatografická kolona Kinetex 2.6 µm C18 100 Å, LC Column 150 x 4.6 mm, Ea minishaker mikropipety + špičky odměrné baňky stříkačky + stříkačkové filtry vialky 1,8 ml K vyhodnocování výsledků je použit program Xcalibur v 2.5.0 (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) 2) Materiál Chemikálie: Deionizovaná voda (H2O) Mr= 18, 0153 g/mol Kyselina sorbová Kyselina benzoová Kyselina fosforečná Chinin Kyselina askorbová Kofein (C8H10N4O2) Mr= 194,1933 g/mol Methanol (CH3OH) Mr= 32,042 g/mol Vzorky syntetických sladidel zakoupených v maloobchodní síti 17

3) Vlastní stanovení metodou HPLC 16 16 Na základě dostupných zdrojů byly definovány podmínky stanovení: http://www.phenomenex.com/application/detail/18528 18

4) Návod na spuštění a vypnutí kapalinového chromatografu 1. Zapnout hlavní vypínač detektoru, čerpadla a autosampleru 2. Připravit mobilní fáze pro chromatografické stanovení: mobilní fáze A 0,1% vodný roztok kyseliny fosforečné a mobilní fáze B: 0,1% kyselina fosforečná v acetonitrilu. (Profil gradientové eluce je uveden v kapitole "Vlastní stanovení metodou HPLC") 3. Spustit PC, program Xcalibur. Instrument setup 4. Zvolit: Surveyor LC Pump > Direct >Control > Operation - spustit čerpadlo (pumpu) 5. Zkontrolovat mobilní fázi, nastavit průtok mobilní fáze k čištění pístů čerpadla 1 ml/min. Otevřít vypouštěcí ventil na pumpě a spustit PURGE. Sledujte, zda pumpa skutečně nasává mobilní fázi. Pokud tomu tak není, na vypouštěcí ventil připojte stříkačku a v počátku nasávání vytvořte podtlak. Čas se volí 0,1 až 9,9 minut. Po dokončení čištění, zkontrolovat odplynění fází (zda-li do pumpy vstupuje mobilní fáze bez bublinek plynu). Uzavřít vypouštěcí ventil. 19

6. Zkontrolovat, zda je v chromatografu použita kolona Kinetex 2.6 µm C18 100 Å, LC Column 150 x 4.6 mm, Ea a zda je správně zapojena (šipky a nápis Flow odpovídá předepsanému směru průtoku), detekce: UV-Vis Absorpční spektrum (PDA) a detekce při 215 nm (22 C). 7. K odplynění dopravní cesty a autosampleru vybrat příkaz v nastavení Autosampleru FLUSH SYRINGE, zvolit FLUSH BOTLE, nastavit objem a rychlost průtoku, spustit (apply). Po ověření odplynění, zavřít dialogové okno. 8. Připravit sérii vialek se zkoumaným vzorkem, vložit do zásobníku a zásobník vložit do přístroje. Pozice v zásobníku jsou číslovány 1-40, zásobník je možné vložit do pozice A-E. Pozice vialek využijete při tvorbě sekvence. 9. S pomocí vedoucího cvičení naprogramovat sekvenci analýz a spustit sekvenci. Dávkovaný objem vzorku bude 0,001 ml. Pro gradientovou eluci je nutné přesné definování gradientového programu v záložce nastavení čerpadla. Případně využijete program, vytvořený vedoucím cvičení. 10. Pumpa pracuje v pracovním režimu 0-5800 PSI, vzrůstající tlak je doprovázen zvukovou signalizací (v případě ucpání se nejprve vymění předkolony a teprve následně se musí vyměnit i kolona). V případě činnosti čerpadla bez mobilní fáze může dojít poškození těsnění pístu. 11. Po proběhnutí analýz identifikovat píky (retenční čas vzorku) a zjistit množství analyzovaného vzorku odečtením plochy píků. Ty budou použity ke konstrukci kalibrační křivky. 12. Na závěr propláchnout vodou, poté acetonitrilem. Při používání pufrů jako mobilní fáze VŽDY propláchněte systém nejprve vodou. Při použití organického rozpouštědla by došlo k vysrážení solí a k poškození kolony a chromatografu. 13. Vypnout hlavní vypínače detektoru, autosampleru a čerpadla, vyjmout zásobník s vialkami k likvidaci vzorků.. Pozor: Před každým měřením je potřeba zkontrolovat množství odpadu v láhvi a mobilní fázi! 20

Obrázek: Chromatogram reálného vzorku Coca-cola Zero RT: 0.00-15.73 1300000 1250000 1200000 1150000 4.78 NL: 1.30E6 Channel A UV softdrinks0 2 1100000 1050000 12.95 1000000 950000 3.07 900000 850000 800000 750000 700000 uau 650000 600000 550000 1.31 5.09 500000 450000 1.37 12.59 12.22 400000 350000 300000 250000 200000 1.71 8.03 9.79 6.12 7.85 8.30 6.74 9.33 10.95 10.36 150000 100000 50000 0 1.17 2.30 3.50 4.43 13.17 13.98 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 21

Obrázek: Absorpční spektra vybraných píků (včetně retenčních časů) softdrinks02 #1329 RT: 4.43 AV: 1 NL: 1.43E5 microau softdrinks02 #920 RT: 3.06 AV: 1 NL: 1.25E6 microau 228.00 uau 140000 135000 130000 211.00 125000 120000 115000 110000 105000 100000 95000 90000 85000 80000 75000 70000 65000 60000 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 265.00 281.00 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) uau 1200000 1150000 1100000 1050000 1000000 950000 900000 850000 800000 750000 700000 650000 600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 299.00 317.00 337.00 372.00 384.00 409.00 420.00 438.00 464.00 498.00 510.00 533.00 563.00 580.00 597.00 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) softdrinks02 #2410 RT: 8.03 AV: 1 NL: 2.51E5 microau softdrinks02 #2022 RT: 6.74 AV: 1 NL: 2.02E5 microau 250000 240000 230000 210.00 220000 210000 200000 211.00 190000 180000 170000 200000 190000 180000 170000 160000 160000 150000 140000 130000 uau 150000 140000 130000 120000 110000 uau 120000 110000 100000 90000 100000 90000 80000 70000 60000 288.00 80000 70000 60000 50000 50000 40000 40000 30000 20000 10000 30000 20000 10000 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) softdrinks02 #1835 RT: 6.11 AV: 1 NL: 2.21E5 microau softdrinks02 #1525 RT: 5.08 AV: 1 NL: 5.88E5 microau 220000 210000 211.00 200000 190000 180000 170000 160000 150000 140000 130000 120000 580000 560000 540000 520000 500000 480000 460000 440000 420000 400000 380000 360000 340000 320000 216.00 uau 110000 uau 300000 280000 100000 260000 90000 240000 80000 220000 200000 70000 180000 60000 160000 50000 140000 120000 40000 100000 30000 80000 20000 10000 60000 40000 20000 258.00 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) softdrinks02 #1437 RT: 4.79 AV: 1 NL: 1.40E6 microau softdrinks02 #1378 RT: 4.59 AV: 1 NL: 6.06E4 microau 1400000 267.00 60000 uau 1350000 1300000 1250000 1200000 1150000 1100000 1050000 1000000 950000 900000 850000 800000 750000 700000 650000 600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 219.00 uau 58000 211.00 56000 54000 52000 50000 48000 46000 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 wavelength (nm) 22

Obrázek: 3D chromatogram reálného vzorku Coca-Cola Zero. Chromatogram obsahuje UV/VIS absorpční spektra všech píků. softdrinks02 RT: 0.00-15.75 wavelength: 200.00-600.00 NL: 1.51E6 microau 600 1500000 550 1400000 1300000 500 1200000 1100000 450 1000000 400 800000 700000 nm uau 900000 350 600000 500000 400000 300 300000 200000 250 100000 0 0 2 4 6 8 Time (min) 10 12 14 200 23

Obrázek: Hmotnostní spektrum kofeinu KOFEIN-APCI #2690-4047 RT: 4.81-7.25 AV: 1358 NL: 2.05E4 T: ITMS + p APCI corona Full ms [50.00-200.00] 100 195.08 95 90 KOFEIN-APCI #2690-4047 RT: 4.81-7.25 AV: 1358 NL: 2.05E4 T: ITMS + p APCI corona Full ms [50.00-200.00] 100 95 195.08 90 85 85 80 80 75 70 75 65 60 70 65 Relative Abundance 55 50 45 40 35 60 30 25 Relative Abundance 55 50 45 20 15 10 5 0 194.17 197.08 193.17 199.08 191.17 192.17 198.08 191 192 193 194 195 196 197 198 199 m/z 196.08 40 35 30 25 20 15 10 196.08 5 0 57.08 61.08 71.08 75.08 83.08 91.00 97.08 109.08 113.08 123.08 130.08 138.08 149.08 157.17 167.08 171.17 181.08 185.17 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 24

Obrázek: Fragmentace molekuly kofeinu m/z 195 přechází na m/z 138 KOFEIN-APCI #5391-5484 RT: 10.76-11.04 AV: 94 NL: 3.54E2 T: ITMS + p APCI corona Full ms2 195.00@cid21.00 [50.00-200.00] 100 138.08 95 90 85 80 75 70 65 60 Relative Abundance 55 50 45 40 35 30 195.08 25 20 15 10 5 0 110.08 57.17 60.08 69.08 72.08 82.92 93.08 97.08 100.67 111.92 122.17 134.83 140.50 151.08 162.92 166.92 177.75 182.17 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 25

Obrázek: Fragmentace molekulového iontu kofeinu MS3 (m/z 195 na m/z 138 a jeho štěpení) KOFEIN-APCI #5594 RT: 13.31 AV: 1 NL: 1.28E1 T: ITMS + p APCI corona Full ms3 195.00@cid21.00 138.00@cid25.00 [50.00-200.00] 83.08 100 95 90 85 80 109.92 75 70 65 60 Relative Abundance 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 83.75 111.58 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 26

Obrázek: Fragmentační schéma kofeinu při ionizaci elektronovým zásahem 17. V našem případě jsou m/z o jednotku vyšší. Zatímco u pozitivní ionizace elektronovým zásahem dochází ke vzniku iontu vyražením elektronu, u elektrospreje či chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI) vznikají adukty neutrálních částic s protonem [M+H + ]. 17 http://svmsl.chem.cmu.edu/vmsl/caffeine/caffeine_fragment.htm 27

Zpracování výsledků Metoda kalibrační křivky Připraví se série standardních vzorků, které obsahují postupně rostoucí koncentraci stanovované složky. Standardy se proměří a sestrojí se závislost sledované veličiny na obsahu složky, kdy na svislou osu (y) se vynesou hodnoty signálu S a na osu vodorovnou (x) se vynesou koncentrace c, tj. vynášíme závislost signálu na koncentraci. Nalezené body se proloží regresí. Následně se proměří vzorek a z velikosti naměřené veličiny se určí obsah složky ve vzorku. Směrnice kalibrační křivky udává citlivost metody. Výhodný je i lineární tvar závislosti. Je-li kalibrační křivka nelineární, bývá stanovení zatíženo větší chybou. Dbáme na to, aby bod na kalibrační křivce, který patří vzorku, ležel mezi standardy. Rovnice kalibrační přímky y = k x x konstanta k, směrnice přímky Kvantitativní vyhodnocení chromatogramu Vyhodnocuje se pomocí plochy nebo výšky píku: Plocha a výška píku roste s obsahem složky ve vzorku. Výšku můžeme snadněji změřit, ale je mnohem více ovlivnitelná malými změnami podmínek při průběhu stanovení (vyhodnocení tak není přesné). Hmotnostní detekce Úkolem je ověřit tvorbu molekulového iontu m/z 195 a následně jeho fragmentaci. Připravený roztok bude přímo zaváděn do iontového zdroje ze stříkačky a vzniklé ionty budou detekovány v oblasti kladně nabitých iontů. Po detekci iontu o m/z 195 bude vybrán tento ion a za pomoci dodané energie rozštěpen na fragmenty. Ty budou detekovány a při dostatečné intenzitě jejich signálu štěpeny na další fragmenty. 28

Vzor protokolu: Jméno a příjmení: ročník: obor: Datum: Protokol z laboratorní úlohy: Využití kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí pro identifikaci a kvantifikaci látek. Laboratorní teplota: Atmosférický tlak: Navážka testované látky: Vzorek: Množství vzorku: Ředění: Do protokolu se popíše použitý vzorek obsahující zkoumanou látku, jeho množství a ředění. Dále se uvede navážka na kalibrační křivku a jednotlivé kalibrační body včetně hodnot ploch píků. Je nutné zpracovat kalibrační křivku, určit regresní rovnici, hodnotu spolehlivosti R a vypočítat obsah analyzované látky v analyzovaném vzorku. Všechny pokusně zjištěné a vypočítané hodnoty se statisticky zpracují (předpokladem je soubor dat s normálním rozdělením a hladinou významnosti α = 0,05). 29

Tento výukový materiál vznikl v rámci projektu CZ.1.07/2.2.00/28.0296 Mezioborové vazby a podpora praxe v přírodovědných a technických studijních programech UJEP, spolufinancovaného Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. 30