Vybrané aspekty toxikologické a forenzní analytiky Analýza toxikologicky relevantních alkoholů a markerů jejich požití Radomír Čabala, Miroslava Bursová, Tomáš Hložek Všeobecná fakultní nemocnice a 1.LF UK v Praze Ústav soudního lékařství a toxikologie, ddělení toxikologie Ke Karlovu 2, Praha 2, 1288
Analýza toxikologicky relevantních alkoholů a markerů jejich požití Alkoholy relevantní z pohledu potenciálních intoxikací Stanovení methanolu, ethanolu a kyseliny mravenčí metodou headspace-gc-fid Pozdní markery konzumace ethanolu Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID Stanovení dalších acidózu vyvolávajících alkoholů metodou GC-MS
Alkoholy relevantní z pohledu potenciálních intoxikací Alkohol Metabolity Methanol Formaldehyd, kyselina mravenčí Ethanol Acetaldehyd, acetát (Isopropanol) Aceton Ethylenglykol Glykolová a šťavelová kyselina (1,3- a 1,2-propandiol) 2--propionová a mléčná k. Diethylenglykol 2-hydroxyethoxyoctová kyselina Ethylenglykol monomethyl éter Methoxyoctová kyselina (2-methoxyethanol, methyl cellosolve) Ethylenglykol ethyl éter Ethoxyoctová kyselina (2-ethoxyethanol, ethyl cellosolve) Akutní acidóza, selhání metabolismu
Signal [a.u. 1-3 ] Signal [a.u. 1-3 ] 1. Stanovení methanolu, ethanolu a kyseliny mravenčí metodou headspace-gc-fid Kolona A: RTX-BAC 1 Kolona B: RTX-BAC 2 Plus 9 6 C Pacient 12 8 C Pacient 3 4 9 6 3 B Me Et ipr Formic acid isopropyl ester 3-methyl- 2-pentanone (IS) 12 8 4 B Me Et ipr Formic acid isopropyl ester 3-methyl- 2-pentanone (IS) 9 6 A Blank 12 8 A Blank 3 4 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8 Retention time [min] Retention time [min]
c (mg/l) 1. Stanovení methanolu, ethanolu a kyseliny mravenčí metodou headspace-gc-fid 45 4 35 3 25 2 15 1 5 Krev Methanol Kyselina mravenčí Ethanol 2 4 6 8 1 Průběh léčby (hod)
2. Pozdní markery konzumace ethanolu Adiktologie: kontrola dodržování podmínek odvykacího procesu; Policie: důkazní řízení; IKEM: kontrola předtransplantačního režimu Marker Zkratka Typ pití Falešná pozitivita Detekční okno Ethanol Et - Potraviny 6 hod Ethylglukuronid Ethylsulfát EtG EtS Nedávné Hygienické prostředky, kosmetika, potraviny 5 dní 5-Hydroxytryptolol 5HTL Nedávné Neprozkoumány 3 týdny Karbohydrate- Deficitní Transferin CDT Nárazové Fe-deficience, hormonální stav žen, karbohydrát-deficientní glykoproteinový syndrom, fulminantní žloutenka C 3 týdny Fosfatidylethanol PEth Nárazové Neprozkoumány 3 týdny Gama-Glutamyl transferáza GGT Chronické / poškození orgánů Nemoci jater a žlučníku, kouření, obezita, léky na bázi mikrozomálních enzymů 4 týdny Aspartát & Alanin Aminotransferáza AST & ALT Chronické / poškození orgánů Jako u GGT, přílišné pití kávy snižuje hodnoty 4 týdny
2. Pozdní markery konzumace ethanolu - Ethylglukuronid & Ethylsulfát Dech, moč, pot Ethylglukuronid (EtG),1 % 5 %,1 % UDPglukuronosyltransferáza Ethanol 95 % Alkoholdehydrogenáza Sulfotransferáza Ethylsulfát (EtS) Acetaldehyd Matrice: moč, krev, vlasy, sliny
2. Pozdní markery konzumace ethanolu - Ethylglukuronid & Ethylsulfát Dvoustupňový postup pro důkaz: 1. Screening moče imunochemický na laboratorním analyzátoru 2. Konfirmace UPLC-MS/MS nebo GC-MS(/MS) po derivatizaci (jen EtG) (nutnost užití D5 standardů)
3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID Ethylenglykol toxické příznaky: od 2 mg/l v séru hemodialýza: od 3 mg/l v séru smrtelná dávka: od 85 mg/l v séru (1 ml pro 7 kg člověka) t 1/2 = 3 hod Glykolová kyselina (GK) hlavní toxický metabolit v séru způsobuje metabolickou acidózu lepší indikátor otravy EG selhávání ledvin: od 7 mg/l v séru t 1/2 = 1 hod Šťavelová kyselina kumulace šťavelanu v tubulech ledvin po saturaci AGT
3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID Dvojstupňová derivatizace A. Derivatizace kyselinou fenylboritou B. Derivatizace izobutylchlormravenčanem obě reakce ve vodné fázi (není nutná extrakce analytů pro derivatizaci) kvantitativní reakce v řádu desítek sekund
Signal [1-6 counts] 1,2-PG 1,3-PG EG GA 3-(4-chlorophenyl) propionic acid 3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID.8 Krev.6 C.4 B Pacient.2 A Standard Blank. 5 6 7 8 Retention time [min]
3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID Počet analýz EG 214-215 na ÚSLTX GK; 1 EG pozitivní; 41 EG; 17 EG negativní; 116 EG+GK; 23
3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID
c (mg/l) 3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID Chlapec (15 let), požil asi 3 ml nemrznoucí směsi a jehličí tisu, pokus o sebevraždu 8 7 6 EG GA 5 4 3 2 1 5 15 25 35 45 55 Doba od požití (hod)
c (mg/l) 3. Stanovení ethylenglykolu a kyseliny glykolové metodou GC-FID Žena (48 let), alkoholička, bezvědomí neznámé etiologie 25 EG 2 GA 15 1 5 2 4 6 8 1 12 14 16 18 Doba odběru (hod)
Signal [1-3 counts] 4. Stanovení dalších acidózu vyvolávajících alkoholů metodou GC-MS Kvalitativní a kvantitativní analýza kyselin po derivatizaci isobutylchlormravenčanem C H 3 H H H 3 C Methanol (M) Ethylene glycol (EG) Diethylene glycol (DEG) H Formic acid (FA) H Glycolic acid (GA) H (2-hydroxyethoxy) acetic acid (HEAA) H 3 C.4.2 FA 2 1 MAA EAA 1 5 GA IS HEAA 2-methoxyethanol (MEE) H 3 C 2-ethoxyethanol (EE) Methoxyacetic acid (MAA) H 3 C Ethoxyacetic acid (EAA) B B A A 2.8 3.2 3.6 6.5 7. 7.5 8. B A 9 1 11 Retention time [min]
Použitá literatura Hložek, T.; Bursová, M.; Čabala, R. Simultaneous and cost-effective determination of ethylene glycol and glycolic acid in human serum and urine for emergency toxicology by GC-MS. Clinical Biochemistry 48, 189-191 (215). Hložek, T.; Bursová, M.; Čabala, R. Fast determination of ethyleneglycol, 1,2-propylene glycol and glycolic acid in blood serum and urine for emergency and clinical toxicology by GC-FID. Talanta 13, 47-474 (214). Hložek, T.; Bursová, M.; Čabala, R. Identification and quantification of acidosis inducing metabolites in cases of alcohols intoxication by GC-MS for emergency toxicology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 114, 16-21 (215)
Poděkování Autoři děkují za finanční podporu peračnímu programu Praha Konkurenceschopnost č. CZ.2.16/3.1./2412, Univerzitě Karlově v Praze (projekt SVV 2625) a Vám za pozornost.
Nashledanou a nepijte (příliš)!