Devyser AZF. Návod k použití

Devyser AZF Kat.č. 8-A019 Pro in vitro diagnostiku Návod k použití Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 1 z 20

Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 2 z 20

Obsah Strana 1. Seznámení se systémem Devyser AZF 4 2. Upozornění 5 3. Symboly použité na štítcích 6 4. Požadovaný materiál 7 4.1 Obsaženo v soupravě 7 4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě 8 5. Skladování a nakládání se soupravou 9 6. Požadavky na vzorek 9 7. Návod k použití 10 7.1 Postup zpracování Devyser AZF kit (Art # 8-A019) 10 7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR 11 7.3 Detekce 13 8. Výsledky a analýza 15 9. Limitace požití 19 10. Reference 20 11. Upozornění zákazníkům 20 12. Kontaktní informace 20 Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 3 z 20

1. Seznámení se systémem Devyser AZF Použití Obsah soupravy Postup Souprava Devyser AZF je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu mikrodelecí v oblastech AZFa, AZFb a AZFc chromozomu Y. Souprava Devyser AZF obsahuje reagencie připravené k použití pro PCR amplifikace genetických markerů. DNA extrakce - Souprava Devyser AZF byla validována s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51104) pro extrakci DNA z lidské plné krve. Amplifikace - Souprava Devyser AZF byl validován s použitím přístrojů ABI GeneAmp Systém 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler a MJ Research/Bio-Rad PTC200 s alpha termoblokem pro 96 jamek. Detekce Genetické analyzátory Applied Biosystems (ABI PRISM 310, 3100, 3130, 3500, 3730) podporující detekci 6-FAM. MegaBACE systémy podporující detekci 6-FAM. Princip metody Diagnostické testování pomocí soupravy Devyser AZF je založeno na PCR amplifikaci STS (sekvenčně specifická místa) oblastí chromozomu Y AZFa, AZFb a AZFc. Úspěšná amplifikace STS markerů indikuje jejich přítomnost, zatímco absence PCR amplikonů znamená jejich deleci. Primery pro celkem 14 markerů jsou namíchány do jediné multiplex PCR reakce. V soupravě jsou přítomny všechny lokusy doporučené EAA (Evropská andrologická akademie) a EMQN (Evropská skupina pro monitoring kvality). Geny ZFX/ZFY jsou použity jako interní kontroly pro PCR amplifikaci, jelikož tyto primery amplifikují specifické fragmeny jak na chromozomu Y (ZFY), tak na chromozomu X (ZFX). Gen SRY je přítomen v testu jako kontrola testis determinujícího faktoru na krátkém raménku chromozomu Y a přítomnosti Y- specifických sekvencí, pokud chybí gen ZFY. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 4 z 20

2. Upozornění A. B. C. D. E. F. G. H. Devyser AZF byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µl. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních zkumavek. Doporučujeme používat špičky s filtry. Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné šarže. Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou. Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky. Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou reagencií, postupující do prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro detekci. Příprava reagencií a extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i spotřební materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se přenášet mezi těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru používejte rukavice a při jeho opouštění je vyměňte za nové. Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory. Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace musí splňovat požadavky ČSN pro nakládání s biohazardním materiálem. Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a reagenciemi si řádně omyjte ruce. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 5 z 20

3. Symboly použité na štítcích Šarže Exspirace Výrobce Počet testů In vitro diagnostický medicínský prostředek Skladujte při teplotě nižší nebo rovné Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 6 z 20

4. Požadovaný materiál 4.1 Obsaženo v soupravě Konfigurace Devyser AZF obsahuje reagencie pro analýzu maximálně 25 vzorků. Složky Barva víčka Barva Zkumavky Štítek Katal.č. Obsah soupravy Oranžová Čirá PCR Activator 4-A018 1x25 testů Bílá Hnědavá Devyser AZF Mix 4-A020 1x25 testů Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 7 z 20

4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě Příprava reagencií Extrakce DNA Plast pro termocykler Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 500 µl. Nepudrované chirurgické rukavice Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční soupravy. Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry. Amplifikace Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 5 μl*. Termocykler: ABI GeneAmp PCR System 9600/9700/2720 nebo Eppendorf Mastercycler nebo MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha blokem. Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry. Detekce Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI PRISM 310, 3100, 3130, 3500, 3730). Metodika je validovaná na polymerech: POP-4, POP-6 a POP-7 Devyser, Size Standard Devyser Dye-Set DEV-5: 560 SIZER ORANGE (Devyser cat.# 8-A402). ABI Prism Size Standard Gene-Scan-500: Dye Set D: Gene-Scan-500 ROX Size Standard (ABI cat.#401734/#4310366). Dye Set G5: Gene-Scan-500 LIZ Size Standard (ABI cat.#4322682). MegaBACE Size Standard: MegaBACE ET 550-R Size standard Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu (ABI kat.č.4311320). 1x Genetic Analyzer Buffer Pipeta nebo dispenzor a špičkami s filtry pro 1,5 μl, 15 μl. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 8 z 20

Detekce Souprava pro barevnou kalibraci: ABI 3100, 3730: Pro kalibraci použijte kit DEV-5 Dye Set MultiCap (Devyser cat# 8-A401) v nastavení Any5Dye. ABI 3500: Použijte DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) Tvorba matrice u ABI 310: Použijte kit DEV-5 Dye Set SingleCap (Devyser cat# 8-A400). Nastavte modul file na GS STR POP4 (1 ml) G5.md5 ABI 310/3100/3130/3500/3730: Dye Set D: DS-30 or DS-31 Dye Set G5: DS-33 MegaBACE: 6-FAM značka pro detekci AZF ROX pro detekci velikostního standardu 5. Skladování a nakládání se soupravou A. B. C. D. Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 o C. Reakční Master Mix (připravený přídavkem Devyser AZF Mix do PCR Activator) můžete uchovat při +2 až +8ºC minimálně 7 dná a při 18ºC minimálně 90 dní. Vyvarujte se opakovaného zmražování a rozmražování. Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR. Nemíchejte reagencie z různých šarží. 6. Požadavky na vzorek Klinické vzorky Souprava Devyser AZF je určena pro analýzu lidské genomické DNA. Postup a skladování Dle pokynů výrobce. Kontroly Doporučuje se použít v pro každou analýzu vhodné kontroly, jako DNA zdravého muže, DNA zdravé ženy a negativní kontrolu (bez DNA), (viz část 8). Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 9 z 20

7. Návod k použití Počet vzorků v běhu Souprava Devyser AZF obsahuje reagencie pro analýzu maximálně 25 vzorků. Doporučuje se aktivovaný reakční mix ihned po namíchání rozdělit do alikvotů. Před rozplněním do zkumavek mix řádně promíchejte (viz sekce 7.1). Rozplňte po 20 μl a uložte při teplotě nižší, než 18ºC. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování. 7.1 Postup zpracování Devyser AZF kit (Art # 8-A019) Reakční master mixy připravte ještě před přípravou vzorků, pokud provedete celou metodu v jediném dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den, připravte master mixy den následující. Reakční Master Mix se připraví přidáním příslušného Devyser AZF PCR Mixu k PCR Activator Devyser AZF byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µl. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Ze soupravy potřebujete PCR Activator, Devyser AZF Mix. Prostor pro přípravu reagencií: 1. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte!. 2. Opatrně přidejte do zkumavky s PCR Activatorem 500 μl Devyser AZF Mixu. POZNÁMKA!> 3. Opatrně manuálně promíchejte pipetováním 300 500 μl několikrát ode dna zkumavky. 4. Zvortexujte zkumavky s reakčním Master Mixem a krátce stočte. Samotné vortexování nestačí. 5. Napipetujte po 20 µl reakčního master mixu do PCR zkumavek, příp. PCR stripu nebo destičky. 6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte. Reakční Master Mix může být uchováván při +2 až +8 C nejméně 7 dní a při méně než 18 C nejméně 90 dní. Vyvarujte se opakovanému zmražování a rozmražování. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 10 z 20

7.2. Příprava vzorků a amplifikace PCR Extrakce DNA Dle návodu výrobce. DNA koncentrace a její čistota jsou důležité faktory pro úspěšné testování pomocí soupravy Devyser AZF. DNA musí být zbavena kontaminujících proteinů a solí. Špatná kvalita DNA může způsobit zvýšené pozadí, nebo chybu amplifikace. Přidání příliš mnoho nebo příliš málo DNA do PCR reakce může způsobit chybu amplifikace. Pokud chcete použít jinou izolační soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser AZF. Pro doporučené podmínky PCR a nastavení analýzy je vhodné používat koncentraci DNA mezi 100 a 200 ng / PCR reakci. Přidání vzorku V prostoru odděleném od prostor pro přípravu reagencií a amplifikaci a detekci. 1. 1. Přidejte 5 μl klinického vzorku (20 40 ng genomické DNA/ μl) do příslušné PCR zkumavky s reakčním master mixem (z kroku 7.1) 2. Zavřete zkumavky a krátce je stočte. Amplifikace Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler.» Pro Eppendorf Mastercycler použijte mód CNTRL TUBE» Pro GeneAmp System 9700 nastavte ramp speed na 9600 mode.» Pro MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha blokem použijte funkci Calculated vial temperature a ramping mode (rychlost vyhřívání) MAX. Amplifikační prostor: Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího teplotního profilu (přečtěte si manuál pro podrobné informace o programování termocykleru): 95 C 15 min 94 C 30 sec; 62 C 90 sec; 72 C 90 sec for 21 cycles 72 C 30 min 4 C FOREVER Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 11 z 20

7.2. Příprava vzorků a amplifikace PCR (pokrač.) Amplifikace (pokrač.) Prvotní denaturace 95 C 94 C 15 min 30 sec Cyklování Finální extenze 72 C 72 C 90 sec 30 min Teplota prostředí 1. Nastavte reakční objem 25 µl. 62 C 90 sec 21 Cykly 4 C 2. Spusťte amplifikaci (délka cca 2 hodiny). 3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z termocykleru, vložte je do stojánku a stočte. Opatrně sejměte víčka, abyste zabránili kontaminaci aerosolem. Amplifikovaný materiál nepřenášejte do před amplifikačních prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a detekčním prostoru. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 12 z 20

7.3. Detekce Příprava vzorků Pro obsluhu genetického analyzátoru postupujte podle příslušného manuálu ABI. Před použitím soupravy Devyser AZF musí mít analyzátor spektrální kalibraci pro detekci FAM s použitím příslušného polymeru. Příprava vzorků pro ABI 310/ 3100/ 3130/ 3500/ 3730 1. Připravte zaváděcí směs smícháním 3 μl velikostního standardu a 100 μl Hi-Di Formamid. Mix vystačí pro 6 zkumavek (resp. jamek). 2. Vortexujte 15 s. 3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých zkukmavek v případě ABI310) napipetujte po 15 μl nanášecí směsi před vložením do analyzátoru. 4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/ zkumavky s ELFO nanášecí směsí. 5. Uzavřete destičku/zkumavky. Příprava přístroje Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru s následujícím nastavením:» Sample ID.» Size standard» Dye Set: DEV-5/Any5, D nebo G5.» Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a přístroje. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 13 z 20

Run Modules ABI 310 Run Parameters Capillary length POP-4 (ABI310) 47 cm Run temperature 60 Injection voltage 8 Injection time 2 Run voltage 15 Run time 30 min ABI 3100/3130 Run Parameters POP-4 POP-7 Capillary length 36 cm 36 cm Run temperature 60 60 Injection voltage 1,5 1,5 Injection time 10 10 Run voltage 15 15 Run time 1800 s 1800 s ABI 3500 Run Parameters Capillary length Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage Run time POP-7 50 cm 60 C 1,6 kv 8 s 19,5 kv 1500 s Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou injekčního napětí a injekční doby. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 14 z 20

8. Výsledky a analýza Princip detekce Chromozom specifické markery známé, jako STS jsou amplifikovány pomocí PCR. Použitím fluorescenčně značených primerů se za pomocí genetického analyzátoru a příslušného software provede vizualizace a identifikace PCR produktů. Analýza dat Píky v elektroforetogramu se identifikují dle velikostí specifických markerů, jak jsou znázorněny v přehledu markerů (str. 16). Přítomnost STS fragmentu závisí na přítomnosti nedeletovaného STS markeru ve vzorku. Absence STS markeru souvisí s deletovaným STS markerem. Kritéria fluorescence Přijatelný rozsah pro výšku píku marker je 200 rel. fluorescenčních jednotek a vice. Pokud jsou píky příliš vysoké (označené off scale), je vhodné vzorek analyzovat znovu s nižším injekčním časem (injection time) a nebo napětím (injection voltage). Než začnete analyzovat klinické vzorky, přesvědčete se, že vyhovují parametry kontrolních vzorků. Negativní kontrola V rozsahu 100 500 bp se nesmějí objevit žádné specifické píky. Kontrolní DNA zdravého muže Počet a velikost píků je obsažena v přehledu markerů (str. 16). Všechny píky uvedené v přehledu musí být přítomny (viz obr. 1). Kontrolní DNA zdravé ženy Má se objevit pouze jediný pík markeru ZFX (viz obr. 2). Klinické vzorky Určete přítomnost nebo nepřítomnost jednotlivých specifických píků. Všechny delece by měly navazovat. Pokud chybí jednotlivé píky bez vzájemné návaznosti, nejedná se o deleci, pouze o chybějící píky. Markery sy254 a sy255 STS markery sy254 a sy255 jsou přítomny na chromozomu Y vždy nejméně po 4 kopiích. V mužské DNA s intaktním lokusem STS mají oba markery píky, jejichž výška přesahuje všechny ostatní píky. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 15 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Přehled markerů Devyser AZF STS marker Lokus Pozice v mapě (str. 17) Velikost markeru * (±2,5 bp) sy255** DAZ1-4 13 123 bp sy131 DYS222 10 169 bp sy90 DYS278 8 175 bp sy81 DYS271 3 208 bp sy625 G65849 5 254 bp sy127** DYS218 9 273 bp sy157 DYS240 14 290 bp sy134** DYS224 11 304 bp sy86** DYS148 4 318 bp sy84** DYS273 6 329 bp sy254** DAZ1-4 12 376 bp M259 DDX3Y 7 396 bp ZFY/ZFX ZFY / ZFX 2 432/433 bp sy14 (SRY) SRY 1 464 bp *Na základě pozorovaných velikostí markerů pomocí ABI3130 a POP7. **Základní sada STS primerů dle předpisů EAA/EMQN (Ref 1). Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 16 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Schematický přehled pozic markerů na chromozomu Y. Mapa STS Lokus Oblast 1 sy14 SRY 2 ZFY ZFY Yp11.3 3 sy81 DYS271 Yq11.21 4 sy86 DYS148 5 sy625 G65849 6 sy84 DYS273 AZFa 7 M259 DDX3Y 8 sy90 DYS278 Yq11.221 9 sy127 DYS218 10 sy131 DYS222 AZFb 11 sy134 DYS224 12 sy254 DAZ1-4 13 sy255 DAZ1-4 AZFc 14 sy157 DYS240 Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 17 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Obr. 1. Typický výsledek z DNA zdravého muže. Jsou přítomny všechny STS markery. Obr. 2. Typický výsledek z DNA zdravé ženy. Všechny STS markery chromozomu Y chybějí, jediný lokus ZFX je přítomen. Obr. 3. Typický výsledek z DNA muže postiženého delecemi Y. Markery sy255, sy157 a sy254 chybějí, což odpovídá deleci oblasti AZFc Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 18 z 20

8. Výsledky a analýza (pokrač.) Pokud chybí jediný STS marker, doporučuje se doplnit výsledek dodatečným testováním. Pokud má elektroforetogram špatnou kvalitu (abnormální velikosti píků, elfo spiky a rozmazané píky), měl by být vzorek nanesen znovu s použitím čerstvých reagencií pro elektroforézu (polymer, pufr atd) Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není detekován, může to mít řadu příčin:» Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony» Polymorfismus v oblasti nasedání primeru» DNA concentration used is too high or too low» DNA použitá v PCR je degradovaná» Elektroforetické spiky 9. Limitace použití A. B. C. D. Použití soupravy je omezeno pro osoby vyškolené v PCR metodách. Souprava Devyser AZF byla validována na cyklerech ABI GeneAmp 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler a MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovou alpha blokem. Pokud chcete pro klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je nutná validace soupravy Devyser AZF pro tento cykler. Souprava Devyser AZF byla validována spolu s extrakcí z lidské plné krve pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini. Analýza s dalšími matricemi a izolačními soupravami nebyla validována a může způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky. Devyser AZF používejte pouze pro detekci delecí specifických STS markerů chromozomu Y dle návodu k použití. Test nebyl validován pro detekci strukturálních přeskupení a abnormalit v žádném dalším chromozomu. Výsledky získané pomocí Devyser AZF můžou být použity pouze pro konkrétní testovanou tkáň nebo vzorek. Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 19 z 20

10. Reference 1. Simoni M, Bakker E, Krausz C. International Journal of Andrology, 27:240-249 (2004). EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y- chromosomal microdeletions. State of the art 2004. 11. Upozornění zákazníkům Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser AZF musí být interpretovány s přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta. Devyser AB nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí. Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům vlastněným třetí stranou. 12. Kontaktní informace Devyser AB Instrumentvägen 19 SE-126 53 Hägersten SWEDEN Phone: +46-8-562 15 850 Homepage: www.devyser.com Technická podpora Phone: +46-8-562 15 850 E-mail: techsupport@devyser.com Devyser AZF, Návod k použití, 7-A012-CZ, May-2012 Strana 20 z 20