ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgA OD-139

ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgA OD-139 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgA ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgA proti antigenu M. pneumoniae. 2. POUŽITÍ: Souprava je určená pro laboratorní diagnostiku chorob vyvolaných baktérií Mycoplasma pneumoniae. Test se využívá zejména pro diagnostiku všech druhů zánětů dýchacích cest od lehkých katarů až po těžké pneumonie, včetně komplikací jako perikarditis, meningoencefalitis, otitis, erytema nodosum. Pro kvalitní laboratorní stanovení diagnózy pomocí ELISA je ideální sledovat dynamiku tvorby protilátek, kde předpokladem je vyšetření dvou vzorků sér jednoho pacienta, tzv. párových sér první vzorek je odebrán v akutní fázi onemocnění, druhý v době, kdy se předpokládá vytvoření detekovatelné hladiny protilátek, tj. cca za 10-15 dnů od odběru prvního vzorku. Vzhledem k odlišné dynamice tvorby protilátek jednotlivých imunoglobulinových tříd doporučuje se v každém vzorku paralelní vyšetření specifických protilátek třídy IgG, IgA a IgM. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-m. pneumoniae IgA je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen M. pneumoniae. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgA značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml Negativního kontrolního séra r.t.u. 1) CONTROL - 1 lahvička 1,3 ml Pozitivního kontrolního séra r.t.u. CONTROL + 1 lahvička 1,3 ml Kalibrátoru r.t.u. CAL 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgA značených peroxidázou (Konjugát anti-iga Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml Promývacího roztoku anti-mycoplasma pneum. 10 x konc. WASH 10x 1 lahvička 125 ml Ředicího roztoku anti-mycoplasma pneum. r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB (TMB roztok) r.t.u. TMB-O 1 lahvička 13 ml Stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. a Ředicí roztok r.t.u. jsou určeny pouze pro soupravu ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgG, IgM, IgA a NEJSOU VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÉ mezi ostatními soupravami ELISA-VIDITEST vyráběných firmou VIDIA spol. s r.o.. 1

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Důkladně zamíchejte ředicí roztok r.t.u., konjugát anti-iga Px r.t.u. a chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. c. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kalibrátor a kontrolní séra. Testovaná séra řeďte 101x (např. 5 μl séra + 500 μl ředicího roztoku). Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). d. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni +32 C až +37 C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 měsíc při laboratorní teplotě. e. Konjugát anti-iga Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem důkladně uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl kalibrátorem, kontrolními séry a ředěnými testovanými séry následujícím způsobem (viz Obr. 1 Schéma aplikace vzorků): První jamku naplňte samotným ředicím roztokem (DIL) pro stanovení pozadí reakce. Další dvě jamky naplňte Kalibrátorem (CAL) a jednu jamku negativním kontrolním sérem (CONTROL -). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2 ). Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum (CONTROL +). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 30 minut (+/- 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY). Jamky poté 4 x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-iga Px r.t.u. (CONJ) a napipetujte do jamek po 100 μl konjugátu anti-iga Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4 x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 15 minut (+/- 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μl Stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut od zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. 2

Obr. 1: Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a b c d e f g h DIL CAL CAL CONTROL - S1 S2 S3 S4 S5 S 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kalibrátoru, kontrolních sér a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru (CAL). Pokud aplikujete tři jamky kalibrátoru a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru je uvedena v Certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3. Séra s hodnotou OD < 90 % cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110 % cut-off jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pozitivity pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl.8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cutoff hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-3,00 + 3,01-5,00 ++ 5,01-8,00 +++ > 8,00 ++++ 3

Příklad: Získaná OD Kalibrátoru = 1,096; 1,106; 1,242 Průměrná hodnota OD Kalibrátoru = 1,148 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor Kalibrátoru = 0,18 Cut-off hodnota = 1,148 x 0,18 = 0,207 Hodnota indexu = 0,800 / 0,207 = 3,86 Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Při hodnocení serologických nálezů je optimální vyšetření sér ve všech 3 třídách protilátek (IgG, IgM i IgA), nejlépe vyšetření párových vzorků sér. IgG IgM IgA Interpretace výsledků - + (+) časná akutní infekce - - + časná akutní infekce bez tvorby protilátek IgM (nebo solitárně perzistující IgA) + + - akutní infekce + + + pozdní akutní infekce + - (+) primoinfekce nebo reinfekce + - - infekce prodělaná v dřívější době - - - seronegativita (bez kontaktu s Mycoplasma pneumoniae ) 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1 Platnost testu Hodnota absorbance OD samotného ředicího roztoku r.t.u. (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,050. Průměrná hodnota OD Kalibrátoru (CAL) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Hodnota indexu Negativního kontrolního séra (CONTROL -) by měla být < 0,90. Hodnoty absorbancí kontrolních sér by měly být: CONTROL - < CAL (< CONTROL + ). 4

10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1 Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±δ CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±δ min max CVrepro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 5

12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. a Ředicí roztok r.t.u pro séra jsou vzájemně zaměnitelné pouze mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST anti- Mycoplasma pneumoniae IgG, IgM a c. IgA. d. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. e. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. f. Kontrolní séra, kalibrátor, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a Konjugát anti-iga Px jsou konzervovány ProClinem 300. g. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. h. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v kapitole 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 C až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. c. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 C až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 C až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 6

Doporučená literatura: M Karppelin, K Hakkarainen, M Kleemola, and A Miettinen: Comparison of three serological methods for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection. Clin Pathol.; 46(12): 1120 1123, December 1993. M. Granstrom, T. Holme, A. M. Sjogren, A. Ortqvist and M. Kalin: The role of IgA determination by ELISA in the early serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection, in relation to IgG and mucapture IgM methods. The Journal of Medical Microbiology, Vol 40, Issue 4 288-292, 1994. Ken B. Waites and Deborah F. Talkington: Mycoplasma pneumoniae and Its Role as Human Pathogen. Clinical Microbiology Reviews, p. 697-728, Vol. 17, No. 4, October 2004. 7

14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte 100 μl / jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl / jamku konjugátu anti-iga Px Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl / jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl / jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 15 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 μl / jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450/ (620-690) nm do 20 minut Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2013 8