Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave IMUNOLOGICKÉ MINIMUM pre študentov odboru Verejné zdravotníctvo

Transkript

1 Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave IMUNOLOGICKÉ MINIMUM pre študentov odboru Verejné zdravotníctvo RNDr. Mira Horváthová, PhD. Oddelenie imunológie a imunotoxikológie, Ústav klinickej imunológie a alergológie LF SZU v Bratislave Bratislava 2014

2 OBSAH IMUNOLÓGIA, IMUNITA A IMUNITNÝ SYSTÉM...3 HLAVNÉ ZLOŽKY IMUNITNÉHO SYSTÉMU...6 DRUHY IMUNITNÝCH MECHANIZMOV...7 FAGOCYTÓZA...9 KOMPLEMENTOVÝ SYSTÉM...10 ANTIGÉNY A PROTILÁTKY...11 ZÁPAL...14 OBRANA PROTI PATOGÉNOM...16 IMUNOTERAPIA...17 NÁVŠTEVA V IMUNOLOGICKOM LABORATÓRIU...17 LITERATÚRA...26

3 IMUNOLÓGIA, IMUNITA A IMUNITNÝ SYSTÉM IMUNOLÓGIA je vedný odbor o skladbe, funkciách a reakciách imunitného systému uskutočňujúcich sa pri jeho odpovediach na antigény a iné faktory životného prostredia ako aj na zmeny vo vnútornom prostredí organizmu. Obsahovo a predmetom štúdia patrí do biologických a lekárskych vied. Niektoré míľniky vývoja imunológie sú na obrázkoch 1a a 1b. IMUNITA je odolnosť organizmu proti infekčným zárodkom (vírusy, baktérie, huby, prvoky), cudzím a odcudzeným bunkám (bunky transplantované od geneticky odlišného jedinca a vlastné, ale nádorovo pozmenené alebo vírusmi napadnuté bunky) a ich produktom. Je to schopnosť organizmu reagovať na antigén imunitnou odpoveďou. Názov imunita je odvodený z latinského slova immunis, čo znamená slobodný, v zmysle oslobodený od niečoho, voľný, nedotknutý. IMUNITNÝ SYSTÉM je zložitá sieť špecializovaných buniek, tkanív, molekúl a ich vzájomných interakcií, ktoré vznikli počas fylogenetického vývoja organizmov. Imunitný systém vznikol u takmer všetkých organizmov ako odpoveď či reakcia na vonkajšie prostredie v snahe prežiť. Tak ako sa organizmy vyvíjali, vyvíjal sa aj ich imunitný systém, od jednoduchého u baktérií až po veľmi zložitý u stavovcov. Evolúcia imunitného systému je vždy koevolúciou s patogénmi. Imunitný systém je difúzny orgán, od ostatných systémov organizmu sa odlišuje v tom, že ho netvorí presne ohraničená anatomická štruktúra. Spolu s endokrínnym a nervovým systémom patrí k základným regulačným mechanizmom organizmu, ktoré zabezpečujú jeho celistvosť a udržiavanie stálosti vnútorného prostredia, homeostázy. 3

4 1798 prvá vakcinácia variola (Edward Jenner) dojičky kráv, ktoré prekonali neškodné kravské kiahne, neochoreli na pravé smrteľné kiahne Teória o oslabení virulentnosti mikróbov kultiváciou in vitro a ich využitie ako vakcín; vakcína proti besnote (Louis Pasteur); zaviedol pre očkovanie pojem vakcinácia; z lat. slova vacca = krava Edward Jenner Objav fagocytov a bunková teória imunity pomocou fagocytózy (Elie Metchnikoff) 1890 dôkaz protilátkovej aktivity proti difterickému toxínu a toxínu tetanu. Začiatok humorálnej teórie imunity (Emil von Behring a Shibasaburo Kitasato) Louis Pasteur 1896 objav komplementu, súbor termolabilných faktorov krvného séra, ako súčasť imunitného systému (Jules Bordet), 1919 Nobelova cena 1900 teória tvorby protilátok (Paul Ehrlich), 1908 Nobelova cena Paul Ehrlich Obr. 1a. Časový prehľad niektorých objavov v imunológii ( storočie) objav interferónu (Alick Isaacs a Jean Lindenmann) ľudské leukocytárne antigény, HLA (Jean Dausset a iní), 1980 Nobelova cena 1975 hybridómová technológia prípravy monoklonových protilátok (Georges Köhler a César Milstein), 1984 Nobelova cena Georges Kohler 1983 izolácia vírusu HIV (Luc Montagnier, Barréé-Sinoussiová), 2008 Nobelova cena 1986 rekombinantná vakcína proti Hepatitíde B získána technológiou génového inžinierstva 1995 prvá vakcína z dendritových buniek 2005 vývoj vakcíny proti ľudskému papilomavírusu (Ian Frazer) César Milstein WHO zahájila stratégiu Stop TB," z dôvodu nárastu MDR-TB (multi-drug resistant tuberculosis) v rozvojových ale i rozvinutých krajinách objavy týkajúce sa aktivácie vrodenej imunity (Bruce A. Beutler a Jules A. Hoffmann) a objav dendritické bunky a ich úloha v rámci získanej imunity (Ralph M. Steinman), Nobelova cena Ian Frazer Obr. 1b. Časový prehľad niektorých objavov v imunológii ( storočie). 4

5 Medzi najzákladnejšie funkcie imunitného systému patrí: obranyschopnosť rozpoznávanie vonkajších škodlivín a ochrana organizmu proti patogénnym mikroorganizmom a ich toxickým produktom (obr. 2). autotolerancia rozpoznávanie vlastných tkanív organizmu a udržovanie tolerancie voči nim imunitný dohľad rozpoznávanie vnútorných škodlivín, priebežné odstraňovanie starých, poškodených a niektorých zmenených (zmutovaných) buniek BAKTÉRIE VÍRUSY PARAZITY IMUNITNÝ SYSTÉM PLESNE POLUTANTY TOXÍNY Obr. 2. Imunitný systém obranca proti patogénnym mikróbom a vonkajším škodlivinám. Poruchy funkcie imunitného systému sa môžu prejaviť: ako znížená rezistencia k infekciám (imunodeficity) ako patologická reaktivita na vonkajšie podnety (alergie) ako patologická reaktivita na vnútorné činitele (autoimunitné ochorenia) ako porucha imunitného dohľadu (nádorové choroby) kombinácia uvedených prejavov 5

6 HLAVNÉ ZLOŽKY IMUNITNÉHO SYSTÉMU Imunitné reakcie sú zabezpečované mnohými rôznymi druhmi buniek a molekúl a ich vzájomnými interakciami. Bunky imunitného systému spolu so spojivovými bunkami a ďalšími štruktúrami tvoria funkčné a anatomické celky lymfoidné tkanivo a lymfoidné orgány. LYMFOIDNÉ TKANIVO imunitného systému sa organizuje do primárnych a sekundárnych lymfoidných orgánov. Medzi primárne lymfoidné orgány človeka patrí kostná dreň a týmus. Sú miestom vzniku, diferenciácie a dozrievania imunokompetentných buniek. Sekundárne lymfoidné orgány sú slezina, lymfatické uzliny, tonzily, apendix, Peyerove plaky v črevách (GALT, gut-associated lymphoid tissue), slizničné lymfoidné tkanivo (MALT, mucosal-associated lymphoid tissue), lymfoidné tkanivo spojené s prieduškami (BALT, bronchial-associated lymphoid tissue). BUNKY imunitného systému možno rozdeliť na bunky priamo patriace imunitnému systému (leukocyty) a pomocné bunky, ktoré sa zaraďujú aj do iných systémov. Leukocyty vznikajú z pluripotentnej hematopoetickej kmeňovej bunky a vyvíjajú sa v dvoch líniách myeloidnej a lymfoidnej. Z myeloidnej línie vznikajú monocyty, ktoré cirkulujú v krvi a v tkanivách sa diferencujú na makrofágy, a granulocyty, ktoré sa delia na neutrofily, eosinofily a bazofily. Do tejto vývojovej rady patria aj žírne bunky (mastocyty) a dendritické bunky. Lymfoidná línia sa delí na prirodzené zabíjačské bunky (NK-bunky), B-lymfocyty, T- lymfocyty a NKT bunky (majú vlastnosti NK-buniek aj T-buniek). Existujú subpopulácie lymfocytov, pomocné, cytotoxické alebo pamäťové lymfocyty. B-lymfocyty sa po kontakte s antigénom menia na bunky syntetizujúce protilátky, tzv. plazmatické bunky. Zodpovedajú za protilátkový typ špecifickej imunity. T-lymfocyty sú základnými bunkami špecifickej imunity, niektoré ich subpopulácie majú typické výkonné funkcie, môžu usmrtiť terčové bunky, iné uvoľňujú rôzne cytokíny a mediátory, a tak regulujú priebeh imunitnej odpovede. 6

7 Medzi pomocné bunky imunitného systému patria krvné doštičky, červené krvinky, endotelové, epitelové a ďalšie bunky, ktoré sa podieľajú na niektorých osobitých funkciách imunitnej odpovede alebo produkujú rôzne mediátory, svojimi aktivitami uľahčujú plniť funkciu buniek imunitného systému. MOLEKULY pôsobiace v imunitnom systéme majú dve základné funkcie výkonnú alebo regulačnú. Výkonná funkcia sa prejavuje v bezprostrednej obrane proti patogénnym baktériám (toxické peptidy alebo voľné kyslíkové radikály). Regulačnými molekulami sú napríklad imunohormóny alebo cytokíny, ktoré regulujú priebeh imunitných odpovedí, ale aj spoluprácu imunitného systému s ostatnými fyziologickými systémami organizmu. Molekuly imunitného systému sa dajú rozdeliť do niekoľkých skupín: protilátky, cytokíny, imunohormóny, komplementový systém, HLA antigény a receptory. DRUHY IMUNITNÝCH MECHANIZMOV Existujú dve kategórie imunitných mechanizmov, nešpecifické a špecifické (obr. 3). Nešpecifické mechanizmy sú evolučne staršie, sú reperezentované fagocytujúcimi bunkami a prirodzene cytotoxickými bunkami (NK-bunky). Humorálne zložky nešpecifickej imunity tvorí komplementový systém, interferóny, lektíny, a iné sérové proteíny. Nešpecifické zložky imunity reagujú na prítomnosť škodliviny rýchle, rádovo v minútach. Zapájajú sa do obranných reakcií ako prvé. Špecifické mechanizmy reagujú na každú cudzorodú štruktúru vysoko špecifickými molekulami (protilátky, antigénové receptory T-lymfocytov) a aktivujú sa až po stretnutí s daným antigénom. Špecifická imunitná odpoveď sa plne rozvinie za niekoľko dní až týždňov. Charakteristickou vlastnosťou je pre ňu imunologická pamäť. Fyziologická imunitná odpoveď je výsledkom súhry nešpecifických a antigénovo špecifických mechanizmov. Vírusy, plesne a vnútrobunkové parazity vyvolávajú prevažne bunkami sprostredkované reakcie, zatiaľ čo proti extracelulárnym baktériám 7

8 a mnohobunkovým parazitom sa uplatňujú skôr humorálne reakcie v spolupráci s výkonnými zložkami nešpecifickej imunity, ako sú napríklad neutrofily, eozinofily, komplement, NKbunky. Z hľadiska efektorového rozdeľujeme imunitu na humorálnu a celulárnu (obr. 4). Základné formy imunity nešpecifická imunita, vrodená, prirodzená špecifická imunita, získaná, adaptívna aktívna pasívna prirodzená postinfekčná umelá postvakcinačná prirodzená transplacentárny a kolostrálny prenos umelá injikovanie antitoxických sér a gamaglobulínov Obr. 3. Základné formy imunity z hľadiska mechanizmov. 8

9 Typy imunity humorálna imunita sprostredkovaná protilátkami komplement C-reaktívny proteín celulárna imunita bunková fagocyty, NK-bunky, lymfocyty Obr. 4. Typy imunity z hľadiska efektorového. FAGOCYTÓZA Fagocytóza je evolučne veľmi starý dej podobný pohlcovaniu potravinových častíc amébami. U človeka a iných mnohobunkových živočíchov patrí medzi základné zariadenia prirodzenej imunity. Má nezastupiteľnú úlohu pri odstraňovaní nielen patogénnych mikroorganizmov, ale aj inertných častíc, ako sú napríklad vdýchnuté prachové častice. Jej prostredníctvom sa odstraňujú aj poškodené vlastné bunky a opotrebované súčasti tkanív. Populácia buniek, ktoré zabezpečujú obranyschopnosť organizmu mechanizmom fagocytózy, sa nazýva profesionálne fagocyty. Sú to najmä neutrofily a tkanivové makrofágy, v menšej miere monocyty a eozinofily. Fagocytóza má dve základné funkcie, zabezpečuje obranu proti patogénnym mikroorganizmom v rámci mechanizmov prirodzenej imunity a upravuje antigény do formy, ktorá aktivuje mechanizmy špecifickej imunity, tým vytvára most medzi prirodzenou a získanou imunitou. Fagocytóza je zložitý dej, ktorý sa skladá z viacerých na seba 9

10 nadväzujúcich medzistupňov (obr. 5). Aby bola úspešná, musia všetky medzistupne prebehnúť koordinovane a bez porúch. Proces fagocytózy 1. Rozpoznanie a adhézia 2. Ingescia a tvorba fagozómu 3. Fúzia lyzozómu a fagozómu degranulácia lyzozómu 4. Usmrtenie, inaktivácia a degradácia 5. Exocytóza - vylúčenie Obr. 5. Viacstupňový proces fagocytózy od rozpoznania patogénu až po jeho degradáciu a vylúčenie (Zdroj: KOMPLEMENTOVÝ SYSTÉM Komplement bol objavený koncom 19. storočia a predstavoval určitú súčasť krvného séra. V súčasnosti je komplement charakterizovaný ako súbor asi 40 výkonných a regulačných glykoproteínov, ktoré sa nachádzajú v krvnom sére alebo na povrchu buniek, kde utvárajú rôzne receptory. Hlavnými zložkami komplementového systému sú sérové proteíny C1 až C9, niekoľko jeho faktorov a regulátorov aktivity. Po rôznych podnetoch dochádza ku kaskádovitej aktivácii jednotlivých zložiek. Medziprodukty tejto kaskádovitej reakcie majú výrazné biologické funkcie (opsonizácia, chemotaxia). Terminálny produkt 10

11 komplementovej kaskády perforuje membrány niektorých mikroorganizmov, spôsobuje ich lýzu a tým ich usmrcuje. Terčovými bunkami pre aktivovaný komplement môžu byť baktérie, veľké vírusy s fosfolipidovým obalom, nádorové bunky a pod. Existujú tri cesty aktivácie komplementu: klasická, alternatívna a lektínová. Účinok komplementu môže byť pre hostiteľa prospešný alebo škodlivý. Prospešná funkcia komplementu spočíva v jeho účasti na obrane proti patogénnym mikroorganizmom a cudzorodým bunkám, účasti na zápalových reakciách, uľahčení fagocytózy a účasti na regulácii imunitných odpovedí. Škodlivé pôsobenie komplementu (poškodzovanie vlastných buniek a tkanív) sa prejavuje pri niektorých imunopatologických reakciách, osobitne pri tých, ktoré vyvolávajú cirkulujúce imunokomplexy a cytotoxické autoprotilátky. ANTIGÉNY A PROTILÁTKY ANTIGÉN je látka, ktorá má schopnosť navodiť špecifickú imunitnú odpoveď, t.j. tvorbu protilátok, výkonných a regulačných buniek bunkovej imunity a špecificky reagovať s produktmi tejto odpovede. Najčastejšími antigénmi sú cudzorodé látky z vonkajšieho prostredia (exoantigény), väčšinou infekčné mikroorganizmy a ich produkty. Antigény, pochádzajúce z organizmu samotného sú autoantigény a môžu navodiť autoimunitné reakcie. Antigénmi môžu byť akékoľvek chemické látky. Najvýznamnejšími antigénmi sú proteíny a rôzne polysacharidy, ale taktiež lipidy a lipoproteíny. Predtým ako antigén vyvolá v určitom jedincovi tvorbu protilátok, musí sa prezentovať, čiže upraviť do takej formy, ktorú sú schopné rozpoznať lymfocyty. Kompletný antigén sa označuje ako imunogén a skladá sa z makromolekulového nosiča a determinantných skupín (determinantov alebo epitopov). Izolovaný antigénový determinant, haptén, má schopnosť špecificky reagovať s produktmi imunitnej odpovede, ale ich tvorbu nedokáže indukovať. Nazýva sa nekompletným antigénom (obr. 6). 11

12 Obr. 6. Schéma molekuly kompletného antigénu imunogénu (Zdroj: Ferenčík a kol.: Imunitný systém: Informace pro každého. Grada publishing, 2005). PROTILÁTKY sa tvoria a sekretujú z plazmatických buniek, ktoré vznikli po diferencovaní a rozmnožení tých B-lymfocytov, ktoré rozpoznali antigén. V prírode sa nachádza veľké množstvo rôznych antigénov. Protilátky, ktoré proti nim vznikajú majú rovnakú základnú štruktúru, ale líšia sa priestorovým tvarom svojho väzbového miesta. Protilátky majú dve hlavné úlohy. Prvou je protilátková špecifickosť, rozpoznanie a väzba s komplementárnymi antigénovými determinantmi, druhou sú výkonné funkcie. Existuje obrovská rozmanitosť protilátok, odhaduje sa, že imunitný systém zdravého človeka dokáže vytvoriť protilátky najmenej s jedným miliónom rôznych špecifickostí. Protilátky sú proteíny, označované ako imunoglobulíny. Molekula imunoglobulínu má tvar Y, skladá sa z dvoch identických ľahkých reťazcov a dvoch ťažkých reťazcov, ktoré sú navzájom spojené disulfidickou väzbou. Reťazce sú priestorovo usporiadané do domén a modulov. Existuje päť tried imunoglobulínov s rôznymi štruktúrami, IgA, IgG, IgM, IgD a IgE (obr. 7). 12

13 Obr. 7. Triedy imunoglobulínov (Zdroj: Martin Brändli: Formy imunoglobulínů. Dostupné na internete: Interakcia antigénu a príslušných B-lymfocytov sa na úrovni organizmu realizuje formou protilátkovej odpovede. Protilátková odpoveď aj proti najjednoduchšiemu antigénu je väčšinou polyklonálna a výsledkom je zmes stoviek až tisícov odlišných molekúl imunoglobulínov, produktov veľkého počtu rôznych klonov plazmocytov. Naopak monoklonové protilátky sú produktom jedného klonu plazmatických buniek, majú jednu špecificitu a sú jedného izotypu. U človeka sa imunizácia - očkovanie robí podávaním určitých antigénov za účelom jeho ochrany pred infekčnými chorobami alebo niektorými mikróbnymi toxínmi. Účinnými zložkami vakcín môžu byť usmrtené mikroorganizmy, živé oslabené (atenuované) mikroorganizmy, toxoidy, prípadne antigény izolované z buniek mikroorganizmov alebo pripravené rekombinantnou technológiou. Vakcíny, ktorých súčasťou sú mikroorganizmy alebo ich produkty, indukujú najmä protilátkovú odpoveď. DNA vakcíny navodzujú nielen protilátkovú, ale aj bunkovú imunitu. 13

14 Protilátky nemajú výkonné funkcie, prostredníctvom ktorých by mohli bezprostredne usmrtiť patogénne mikroorganizmy, ktoré vnikli do tela. Na antimikróbnej obrane sa zúčastňujú nepriamo prostredníctvom niektorého z troch základných mechanizmov, a to neutralizácie, opsonizácie alebo aktivácie komplementu. ZÁPAL Zápal je fylogeneticky aj ontogeneticky najstarší obranný mechanizmus. Je odpoveďou organizmu na porušenie jeho integrity, poškodenie buniek a tkanív. Poškodenie môžu vyvolať mechanické (odreniny, porezanie), chemické (jedy, žieraviny), nutričné (nedostatok kyslíka, proteínov alebo vitamínov) alebo biologické faktory (baktérie, plesne, vírusy). Úlohou zápalu je likvidácia, zriedenie alebo vylúčenie škodliviny a poškodeného tkaniva alebo jeho ohraničenie a súčasná reparácia. Klasickými prejavmi lokálneho zápalu je začervenanie, opuch, bolestivosť, zvýšenie miestnej teploty a porušenie funkcie (obr. 8). Príznakom systémového zápalu je horúčka. Zápal môže byť akútny alebo chronický, obranný alebo poškodzujúci, povrchový alebo hlboký a pod. Zatiaľ čo akútny zápal je fyziologickou obrannou reakciou, chronický zápal je obvykle už patologický. Pri zápalovej odpovedi možno pozorovať štyri fázy: cievna odpoveď, akútna bunková odpoveď, chronická bunková odpoveď a zahojenie. Na zápalovej reakcii sa zúčastňujú: mnohé bunky patriace do imunitného systému, najmä neutrofily, makrofágy, T-lymfocyty, endotelové bunky ciev, eozinofily, žírne bunky, trombocyty mnohoenzýmové systémy krvnej plazmy hemokoagulačný, fibrinolytický, komplementový a kinínový množstvo rôznych výkonných a regulačných molekúl podporujúcich alebo naopak utlmujúcich priebeh zápalovej reakcie 14

15 Obr. 8. Príznaky lokálneho zápalu: zvýšenie teploty (heat), začervenanie (redness), opuch (swelling), bolestivosť (pain) a strata funkcie (loss of function) (Zdroj: The Cheerful medic. Dostupné na internete: Charakteristika procesu zápalovej reakcie: zvýšenie permeability ciev a prestup plazmatickej tekutiny do extravaskulárneho priestoru zvýšenie expresie adhezívnych molekúl a adhezivity endotela, prienik fagocytov a lymfocytov do poškodeného tkaniva aktivácia koagulačného, fibrinolytického, kinínového a komplementového systému ovplyvnenie miestnych nervových zakončení (bolesť) zmeny regulácie teploty 15

16 Priebeh zápalu regulujú osobitné chemické látky, zápalové mediátory. Patria medzi ne rôzne cytokíny, chemokíny a iné chemotaktické faktory, prostaglandíny, proteíny akútnej fázy zápalu a ďalšie. OBRANA PROTI PATOGÉNOM Existuje obrovský počet rôznych druhov mikoorganizmov, sú všade, vo vzduchu, vode, potravinách, na povrchu a vo vnútri našich tiel. Z nich len menšia časť je pre človeka patogénna a môže vyvolať infekčné choroby, napr. niektoré baktérie, plesne a kvasinky, parazity, vírusy. Niektoré mikroorganizmy sú pre človeka prospešné, napr. probiotické baktérie. Prienik patogénov do organizmu hostiteľa aktivuje mechanizmy nešpecifickej a neskôr aj antigénovo špecifickej imunity, ich účelom je obmedziť šírenie infekcie a prípadne eliminovať mikroorganizmus alebo neutralizovať jeho produkty. Prežívajú predovšetkým tie mikroorganizmy, ktoré sú schopné uniknúť alebo prekonať tlak imunitných mechanizmov. Kľúčový význam pre prežitie človeka má schopnosť odlíšiť vlastné bunky od buniek mikroorganizmov, ktorých obrovské množstvá sa nachádzajú v okolitom životnom priestore. Mikroorganizmy majú schopnosť prispôsobovať sa rôznym životným podmienkam a intenzívne sa podrobovať mutáciám. Človek a iné mnohobunkové organizmy museli na svojich bunkách vybudovať také receptory, ktoré boli schopné rozpoznať určitú typickú štruktúru nielen na jednom druhu mikroorganizmov, ale na ich viacerých druhoch. Takýmito štruktúrami na povrchu mikroorganizmov sú molekulové vzory spojené s patogénnosťou, napr. lipopolysacharid, ktorý sa nachádza na povrchu mnohých gramnegatívnych baktérií. Produkty humorálnej imunity majú prevažujúci význam v boji proti extracelulárnym mikroorganizmom, na likvidáciu intracelulárnych mikroorganizmov sú dôležitejšie mechanizmy bunkovej imunity. 16

17 IMUNOTERAPIA Látky ovplyvňujúce imunitný systém môžeme rozdeliť do dvoch základných skupín, látky potlačujúce imunitné reakcie (imunosupresíva) a látky stimulujúce imunitu (vakcíny a imunomodulátory). Imunosupresívne látky sú chemicky rôznorodé a používajú sa napr. k potlačeniu patologickej imunitnej reakcie pri autoimunitných chorobách alebo potlačeniu normálnej imunitnej reakcie pri transplantáciách orgánov. Látky stimulujúce alebo normalizujúce imunitu sa používajú k vyvolaniu špecifickej imunity proti určitému antigénu aktívna imunizácia, očkovanie alebo zabráneniu vzniku určitého ochorenia pasívna imunizácia. Vakcíny sú látky, ktoré obsahujú antigén upravený tak, aby vyvolal ochrannú imunitnú reakciu, ale nevyvolal ochorenie. Antigénom môžu byť modifikované vírusy, baktérie alebo toxíny. Pasívna imunizácia je podanie antiséra, to znamená špecifických protilátok proti určitému antigénu, ktorý môže vyvolať závažné ochorenie. Imunomodulácia je aplikácia takých látok, ktoré modulujú patologickú, zvyčajne zníženú imunitu. Medzi imunomodulátory patria produkty imunitného systému (napr. cytokíny a rastové faktory), syntetické látky, extrakty bakteriálnych stien alebo leukocytov (transfer faktor) a pod. NÁVŠTEVA V IMUNOLOGICKOM LABORATÓRIU V poslednej dobe nastal v imunológii výrazný rozvoj laboratórnych vyšetrení. Zvýšil sa počet imunologických laboratórií, kapacita vyšetrení a ich dostupnosť. O imunologickej diagnostike sa usudzuje na základe anamnézy, expozície prostrediu, výsledkov vyšetrení a klinickej symptomatológie. 17

18 Predpoklady racionálnej diagnostiky imunologicky podmienených chorôb: dostatočne široké spektrum vhodných imunologických metód znalosť klinickej hodnoty imunologických vyšetrení racionálna indikácia imunologických vyšetrení komplexné hodnotenie výsledkov vyšetrení s klinickým stavom Imunologické laboratórne metódy sa využívajú na vyšetrovanie parametrov humorálnej a bunkovej imunity. Základným princípom je reakcia antigénu a protilátky. Reakcia prebieha obvykle v tekutom prostredí alebo aj v prostredí gélu. Antigény alebo protilátky bývajú naviazané na rôznych nosičoch, ako sú napr. sklenené, latexové, alebo plastové guličky, erytrocyty, usmrtené baktérie, steny jamiek polystyrénových mikrotitračných doštičiek alebo steny skúmaviek a nitrocelulózové membrány. Rozmanité sú aj cesty detekcie reakcie antigénu a protilátok, napríklad odčítanie natívneho alebo zafarbeného precipitátu, zmeranie zákalu vzniknutého po reakcii antigén-protilátka, vizualizácia pomocou systému enzým-substrát, izotopmi, elektrochemicky, imunofluorescenčne a fluorometricky. V súčasnosti je veľa metód automatizovaných a prístroj býva napojený na laboratórny informačný systém. V imunologickom laboratóriu sa robia vyšetrenia na diagnostiku akútnych ochorení alebo monitorovanie liečby, najmä imunodeficientných stavov, recidivujúcich infekcií, alergií a autoimunitných ochorení. Prvým krokom pri vyšetrení bunkovej imunity je vyšetrenie leukocytov a stanovenie ich diferenciálneho počtu. Medzi bunkové parametre patrí aj identifikácia subpopulácie lymfocytov a fenotypové znaky zmien imunity, expresia adhezívnych molekúl na povrchu buniek, funkčná aktivita lymfocytov, neutrofilov, bazofilov, a iné. Pri vyšetrení humorálnej imunity sa využívajú imunochemické metodiky, napr. stanovenie imunoglobulínov, imunitných komplexov, cytokínov, produktov zápalovej reakcie, zložiek komplementu a špecifických protilátok. Výsledkový list obsahuje použité metódy, jednotky vyšetrovaných parametrov a referenčné hodnoty. Základnými požiadavkami pre laboratórne vyšetrenie je správny odber biologického materiálu (krv, bronchoalveolárna laváž), uchovávanie vzoriek a transport do laboratória. Pre väčšinu vyšetrovaných parametrov humorálnej imunity je vhodné krvné sérum (obr. 9), na 18

19 vyšetrenie bunkovej imunity sa používa nezrazená venózna krv odobratá do antikoagulantov (EDTA, heparín). Obr. 9. Krvné sérum sa získa oddelením zo zrazenej periférnej krvi pomocou laboratórnej centrifúgy (odstredivky). Nefelometria a turbidimetria sú reakcie založené na meraní množstva imunitných komplexov vytvorených interakciou špecifických protilátok s antigénom. V súčasnej dobe sa obe metódy využívajú na stanovenia sérových bielkovín v rutinných laboratóriách a na tieto účely sa vyrábajú veľkokapacitné analyzátory (obr. 10). Nefelometricky alebo turbidimetricky sa stanovujú základné bielkoviny v sére, imunoglobulíny IgG, IgA, IgM, IgE, podtriedy IgG, zložky komplementu C3 a C4, proteíny akútnej fázy (napr. CRP, transferín, alfa-1- makroglobulín, albumín). 19

20 Obr. 10. Imunochemický systém na kvantitatívne stanovenie ľudských proteínov v sére pomocou nefelometrie. Ďalšie metódy, ktorých podstatou je reakcia antigén-protilátka, sú imunoreakcie so značenými protilátkami. Historicky najstaršie sú izotopové metódy, nevýhodou je fakt, že vyžadujú protilátku značenú radioizotopom. Významný zvrat v laboratórnej diagnostike nastal po objavení možnosti použiť enzým a naviazať ho na molekulu špecifickej protilátky. Špeciálna analytická metóda s enzýmovým konjugátom ako indikátorom je ELISA (enzymelinked immunosorbent assay). Je to dostatočne citlivá, špecifická a reprodukovateľná metóda, kde reakcia prebieha na 96-jamkovej polystyrénovej mikrotitračnej platničke, protilátka proti vyšetrovanému antigénu je naviazaná na stenách jamiek. ELISA metódy sa v imunologickom laboratóriu používajú najmä na stanovenie proteínov, protilátok, ktoré sa vyskytujú v sére v nízkych koncentráciách. Základným vybavením pre ELISA metódy je tzv. ELISA-reader, modifikovaný spektrofotometer, ktorý umožňuje meranie farebnej reakcie pri rôznych vlnových dĺžkach (obr. 11). 20

21 Obr. 11. Prístrojové vybavenie pre ELISA metódy (ELISA-reader) pre odčítanie a vyhodnocovanie mikrotitračných platničiek. Obr. 12. Plnoautomatický systém na diagnostiku alergií a autoimunitných ochorení. Špecifické IgE protilátky v humánnom sére sa nadväzujú na alergény, ktorými sú potiahnuté testovacie disky. V druhom reakčnom kroku sa disk inkubuje s enzymaticky značeným anti- IgE, vzniká pevná fáza s naviazaným enzýmom proporcionálne k množstvu alergénšpecifického IgE vo vzorke pacienta. Po inkubácii s roztokom substrátu sa výsledné žlté zafarbenie meria spektrofotometricky. Koncentrácia alergén-špecifického IgE je priamo úmerná intenzite zafarbenia a je porovnaná voči referenčnej krivke IgE. 21

22 Alergické choroby sú dnes najčastejšou poruchou imunity v ekonomicky vyspelých štátoch. Dôkaz a stanovenie špecifických IgE protilátok proti alergénom patrí medzi klasické alergologické laboratórne vyšetrenia. Existujú viaceré metodické postupy, ktoré vychádzajú zo základného princípu enzýmoimunoanalýzy. Líšia sa možnosťami automatizácie, spôsobom naviazania antigénu (alergénu) alebo detekcie (obr. 12). Na stanovenie počtu leukocytov a ich diferenciálneho rozpočtu sa v súčasnosti používajú plnoautomatické hematologické analyzátory založené na rôznych technológiách (obr.13). Výsledky meraní sú vyjadrené v percentuálnych i absolútnych hodnotách. V minulosti sa vyšetrenie krvného obrazu robilo iba mikroskopicky, krvné bunky sa rozlišovali na základe ich tvaru a farbenia cytoplazmy kyslými alebo zásaditými farbivami (obr. 14). Obr. 13. Rôzne typy plnoautomatických hematologických analyzátorov s možnosťou stanovenia 5-populačného diferenciálu. 22

23 lymfocyt monocyt eozinofil neutrofil bazofil Obr. 14. Krvný náter pod mikroskopom. Klasifikácia buniek podľa morfológie a zafarbenia cytoplazmy lymfocyty, monocyty, neutrofily, eozinofily a bazofily. Obr. 15. Sterilný box na izoláciu buniek z plnej nezrazenej krvi. Bunky sa kultivujú v kultivačných fľašiach s určitým stimulačným agensom v CO 2 inkubátore. 23

24 Niektoré metodické postupy sledovania bunkovej imunity si vyžadujú izoláciu krvných elementov, ide najmä o funkčné testy, ako sú napr. cytotoxicita buniek alebo proliferačná aktivita lymfocytov. Existujú rôzne metódy ako oddeliť jednotlivé druhy bielych krviniek. Separované bunky sa pripravujú v laminárnych boxoch za sterilných podmienok a inkubujú sa s príslušnou stimulačnou látkou na kultivačných doštičkách alebo kultivačných fľašiach v CO 2 inkubátoroch (obr. 15). Prietoková cytometria je štandardnou metódou na analýzu buniek v suspenzii. Bunková suspenzia sa označuje najčastejšie pomocou monoklonových protilátok s naviazaným fluorescenčným farbivom. Označená protilátka sa špecificky viaže na antigény na povrchu alebo vo vnútri vyšetrovaných buniek. Zariadenie, ktoré umožňuje analyzovať bunkovú suspenziu sa nazýva prietokový cytometer (obr. 16). Najčastejšou imunologickou indikáciou je zistenie zastúpenia subpopulácií lymfocytov, tzv. imunofenotypizácia. Obr. 16. Prietokový cytometer prístroj na meranie fyzikálno-chemických vlastností buniek alebo iných biologických častíc, ktoré sú v kvapalinovej suspenzii. Základnou aplikáciou jeho využitia je imunodiagnostika krvných buniek, detekcia povrchových, cytoplazmatických a jadrových znakov, stanovenie imunofenotypu. 24

25 Virtuálne imunologické laboratórium je dostupné na internete: 25

26 LITERATÚRA Hořejší, V., Bartůňková, J.: Základy imunológie. Triton, 2013, ISBN: Bartůňková, J., Paulík, M.: Vyšetřovací metody v imunologii. Grada, 2011, ISBN: Ferenčík, M. a kol.: Imunitní systém informace pro každého. Grada, 2005, ISBN: Buc, M.: Imunológia. Veda, 2001, ISBN: