Imunologické metody fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test

Transkript

1 Imunologické metody fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test

2 Fagocytóza Jeden z evolučně nejstarších obranných mechanismů Součást přirozené imunity Schopnost buněk imunitního systému pohlcovat, usmrcovat a rozkládat mikroorganismy (u živých) Schopnost rozpoznat cizorodou částici, navázat se a pohltit ji Fagocytující buňky - neutrofily, eosinofily, monocyty, makrofágy

3 Fagocytóza jako mnohastupňový proces Interakce mezi fagocytujícími buňkami a endotelem Adhezní molekuly Chemotaxe s účastí chemoatraktantů Ingesce pohlcování částic, > 0,5um Nitrobuněčné zabíjení Mechanismy zabíjení nezávislé na kyslíku a závislé na kyslíku (NADPh oxidázový komplex)

4 Vrozené poruchy fagocytózy Imunitní nedostatečnost Primární poruchy geneticky podmíněné nízká incidence 1: : Sekundární poruchy Poruchy v počtu granulocytů (retikulární dysgeneze) Poruchy funkce granulocytů LAD syndrom (Leukocyte Adhesion Deficency, mutace genu pro podjednotku beta CD18)

5 Poruchy fagocytózy Poruchy chemotaxe Poruchy ingesce Poruchy tvorby granulí neutrofilních granulocytů ( Chediak-Higashiho sy, poruchy myeloperoxidázy)

6 Fagocytóza princip metody (testy postihující pohlcení) Substráty MSHP hydroxyetylmetakrylátové partikule Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans MSHP hydrofilní charakter částic (omezení nespecifické adherence), standardní velikost 1um (nízká spontánní agregace) Inkubace s plnou krví 1 hodinu při 37C, po inkubaci nátěr na podložní sklo, fixace, obarvení a počítání ve světelném mikroskopu Hodnocení určitého počtu buněk, pozitivní obsahují 3 a více partikulí.

7 Fagocytóza technické podmínky a hodnocení Čerstvá krev s heparinem (zpracování do 2 hodin po odběru) EDTa vyvázání kalciových iontů Třepání, nátěry Omezená výpovědní hodnoty v rutinní klinické praxi Toxikologie, farmakologie Termostat, třepačka, světelný mikroskop, event. průtokový cytometr

8 Baktericidní test Screeningová metoda Rozdílné mikrobicidní systémy s druhovou specificitou mikroba Substrát živý mikroorganismus!!! Candida albicans, Staph.aureus, pseudomonády Vyšetření z plné krve nebo na izolovaných granulocytech Vitální barvení kandid trypanovou modří, živé kandidy mají schopnost trypanovou modř eliminovat Staphylokok očkování na plotny a počítání kolonií nebo průtoková cytometrie s barvením přežívajících mikroorganismů

9 Baktericidní test technická úskalí Obtížná standardizace Heparinová krev, teplota zpracování, časový limit pro zpracování Substrát mikrobiologická laboratoř, různá citlivost kmenů, pasážování kmenů Uplatnění v rutinní diagnostice omezené, více ve výzkumu Technické vybavení třepačka, termostat, sterilizátor, mikroskop, průtokový cytometr

10 Testy oxidačního metabolismu Testujeme schopnost granulocytů tvořit kyslíkové radikály aktivací NADPH oxidázy NBT - nitroblue-tetrazolium chlorid INT iod-nitroblue tetrazolium Schopnost granulocytů redukovat bezbarvé tetrazoliové soli na barevné formazány Kyslíkový metabolismus, zabíjení stafylokoků, enterokoků, kandid Sklíčkový test optický mikroskop, pozitivní buňky jsou s modrými skvrnami ( redukovaný formazán) Mikrotitrační destičky s fotometrickým odečtem Klinické koreláty chronická granulomatozní choroba Zpracování do 2 hodin po odběru

11 Chemiluminiscence Měření chemiluminiscenční aktivity fagocytů Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí Redukce molekulárního kyslíku na superoxid a následně peroxid vodíku Peroxid vodíku je substrátem pro myeloperoxidázovou reakci s emisí fotonů a chemiluminiscencí fagocytů Pro chemiluminiscenci je stimulem phorbol-myristát-acetát, který aktivuje proteinkinázu C a následně NADPH oxidázu Chemické světlo se zesiluje akceptací fotonů luminolem Spontánní aktivita a aktivita stimulovaných fagocytů Chemiluminiscenční analyzátor Hodnotí se vrchol odpovědi a čas nezbytný k jeho dosažení

12 Chemiluminiscence technické podmínky, uplatnění testu Čas zpracování, teplota při zpracování 37C, koncentrace granulocytů, diferenciál krevního obrazu Širší uplatnění ve srovnání s NBT testem Poruchy NADPH v oxidázovém a myeloperoxidázovém systému Klinický korelát chronická granulomatóza Farmakologie Chemiluminometr, průtokový cytometr