Histochemie. Histochemie. Histochemie Příklady histochemických metod: Ionty. Histochemie Příklady histochemických metod: Ionty

Transkript

1 Modul IB CBO Odd. histologie a embryologie MUDr. Martin Špaček Histologická metoda užívaná k průkazu různých látek přímo v tkáních a buňkách Katalytická histochemie Imunohistochemie Lektinová histochemie In situ hybridizace Ionty Železo (Fe 3+ ) Perlsova reakce: řez tkání je inkubován ve směsi ferokyanidu draselného a kyseliny chlorovodíková výsledek: nerozpustné tmavě modré precipitáty ferokyanidu železitého diagnóza u pacientů s chorobami, při kterých se nadměrně ukládá železo (např. hemochromatóza) Ionty Zinek v molekule insulinu lze barvit zinconem (modře) či dithizonem (červeně) Vápník např. depozita ionizovaného vápníku lze barvit hematoxylinem modře Tuky barví se barvivy rozpustnými v tucích např.: Sudan IV, sudanová čerň, olejová červeň, nilská modř užívá se zpravidla fixace zmražením s následným krájením v kryostatu DNA Feulgenova reakce: hydrolýza DNA kys. chlorovodíkovou to vede ke vzniku aldehydových skupin volné aldehydové skupiny reagují potom se Schiffovým reagens výsledek: nerozpustná červená hmota

2 RNA Organely obsahující RNA se barví bazickými barvivy tj. např.: toluidinovou modří, metylenovou modří RNA však není jedinou bazofilní látkou ve tkáních, proto je nezbytné kontrolní preparát inkubovat ribonukleázou Cukry Cukry jsou prokazovány PAS reakcí (periodic acid-schiff) ta je založena na oxidaci kyselinou jodistou aldehydové skupiny ty potom reagují se Schiffovým reagens (jako ve Feulgenově reakci) výsledkem je sloučenina mající červenofialovou barvu Cukry PAS-pozitivní látky: polysacharidy (glykogen) glykosaminoglykany /mukopolysacharidy/ (hyaluronová kys., chondroitin sulfát) proteoglykany glykoproteiny (thyreoglobulin, kolagen) glykolipidy (lipofuscin) biopsie od pacientů s různými střádavými chorobami (glykogenózy, mukopolysacharidózy) Katalytická histochemie Enzymy jsou katalyzátory většiny biochemických reakcí Užívá se zpravidla fixace zmražením Princip: První reakce (histochemická): enzym + substrát reakční produkt Druhá reakce: vizualizace reakčního produktu Vždy nutnost kontrolních řezů Katalytická histochemie vizualizační reakce precipitace s kationty kovů vznik barevné nerozpustné soli Pb, Co simultánní azokopulace produkt (naftol) se převede na azobarvivo indigogenní reakce štěpení na indoxyl a jeho oxidace na indigo tetrazoliová metoda redukce tetrazoliové soli na barevný formazan spřažená peroxidázová reakce oxidace DAB Katalytická histochemie - příklady Gomoriho průkaz kyselé fosfatázy řez tkání + substrát štěpený enzymem (např. glycerofosfát sodný) uvolnění fosfátových iontů jejich zachycení dusičnanem olovnatým výsledek: elektrodenzní precipitát

3 Katalytická histochemie - příklady Peroxidáza tkáňové řezy jsou inkubovány v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB (diaminoazobenzidin) DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován výsledek: nerozpustné černé (hnědé) elektrodenzní precipitáty diagnostika leukémií (detekce peroxidázové aktivity v krevních buňkách) Peroxidáza se rovněž užívá ke značení v imunohistochemii a ISH Imunohistochemie Metoda sloužící k průkazu tkáňových či buněčných antigenů pomocí vazby mezi antigenem a protilátkou Antigeny: proteiny, glykoproteiny, proteoglykany Protilátky: sérové proteiny známé jako imunoglobuliny jsou vytvářeny plazmatickými buňkami v imunohistochemii nejčastěji používáme třídu IgG Protilátky Protilátka se skládá ze čtyř polypeptidových řetězců, dvou identických lehkých řetězců a dvou identických těžkých řetězců Epitopy Specifické místo antigenu, na které se váže protilátka, se nazývá epitop (antigenní determinanta) Většina antigenů má více epitopů, které vyvolávají při imunizaci vznik skupiny různých protilátek (polyklonálních), namířených proti jednotlivým epitopům Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky jsou klonované protilátky, které jsou všechny zaměřené proti stejnému epitopu jsou tedy mimořádně specifické Aktivované B-buňky produkují směs protilátek zaměřených proti různým epitopům Aktivovaná B-buňka má jen omezenou životnost a sama se nemnoží Jak můžeme selektovat jeden klon B-buněk a prodloužit buněčnou linii?

4 Monoklonální protilátky B lymfocyty mohou mutovat v nádorové buňky a vytvořit nádor zvaný myelom. Myelomové buňky se stávají nesmrtelnými a mohou růst neomezeně v tkáňové kultuře. Fůzí jedné plazmatické buňky s buňkou myelomovou vznikne hybridní buňka (hybridom), která se trvale množí a produkuje monoklonální protilátky Metody značení protilátek (markery) enzymy (např. peroxidáza vizualizace DAB) částice koloidního zlata (EM) fluorochromy biotin (avidin-biotin) Fluorochromy Fluorochromy jsou látky schopné absorpce záření ve formě UV či viditelného světla tato absorpce zapříčiní excitaci elektronů v molekule barviva při následném přeskoku zpět na energeticky nižší hladinu dojde k emisi záření o jiné vlnové délce fluorochromy: FITC (fluorescein isothiocyanát) zelený, rhodamine (TRITC) červený, DAPI modrý atd. Avidin-biotin Typy imunohistochemických metod Tato metoda je založena na vysoké afinitě mezi (značeným) avidinem a biotinem Až 150 molekul biotinu se může navázat na jednu molekulu protilátky zvýšení senzitivity Přímá metoda používá se značená primární protilátka Nepřímá metoda (citlivější) první krok: neznačená anti-x protilátka se naváže na antigen druhý krok: značená protiprotilátka se váže na anti-x protilátku

5 Typy imunohistochemických metod Lektinová histochemie Amplifikační metody: při malém množství prokazovaného antigenu ve tkáni Např. značení sekundární protilátky biotinem, na který se následně váže avidin nebo avidinbiotinový komplex (ABC) značený peroxidázou vizualizace peroxidázy se potom provede pomocí katalytické histochemie Lektiny jsou glykoproteiny schopné vázat různé sacharidové zbytky (zejména v integrálních proteinech buněčné membrány) Např. vazba v ABO systému (oligosacharid na povrchu erytrocytu a proteiny v séru aglutininy) Cukerné zbytky v membráně se mění při diferenciaci buněk i při jejich maligním zvratu Lektiny se značí podobně jako protilátky In situ hybridizace Umožňuje detekci specifických sekvencí v nukleových kyselinách (DNA, m-rna) in situ Je založena na navázání (hybridizaci) sondy (krátký úsek nukleové kyseliny o známé sekvenci bází) na cíl Využití: detekce abnormálních genů (např. v prenatální diagnostice) identifikace virových infekcí, atd. In situ hybridizace Značení sond: radioizotopy vazba nukleotidu s biotinem fluorochromy (FISH) Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)