Transformace ptdna tabáku genem E7/GUS a eliminace selekčního genu za využití homologní rekombinace

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Transformace ptdna tabáku genem E7/GUS a eliminace selekčního genu za využití homologní rekombinace"

Josef Kašpar
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Transformace ptdna tabáku fúzním genem E7/GUS a eliminace selekčního genu za využití homologní rekombinace Jiřich ich BřízaB 1,, Josef Vlasák 1, Štěpán n Ryba, Viera Ludvíkov ková 3, Hana Niedermeierová 1 1 Biologické centrum AV ČR, v.v.i., Ústav molekulárn rní biologie rostlin, Branišovsk ovská 31, 37 5 České Budějovice, ČR Biologická fakulta Jihočesk eské univerzity, Branišovsk ovská 31, 37 5 České Budějovice, ČR 3 Ústav hematologie a krevní transfuze, Oddělen lení experimentáln lní virologie, U Nemocnice 1, 18 Praha, ČR

2 Úvod v rámci grantu zabývajícího se produkcí proteinů lidského papilomaviru (HPV16) v rostlinách jsme přistoupili mj. k transformaci ptdna tabáku naše e předchozp edchozí práce ukázaly (Šmahel( et al.. 6, Bříza et al.. 7), že e samotný onkoprotein E7 je v buňkách vysoce nestabilní jeho stabilizace jsme dosáhli fúzovf zováním m s β- glukuronidázou (Vlasák et. al.. 6) pro transgenozi ptdna jsme se však v nejdříve rozhodli vyzkoušet fúzi f onkogenu E7 s genem aada (Ryba 6), který kóduje k enzym adenosyl-3 -adenyl adenyl transferázu a slouží tedy při p i plastidové transformaci jako gen selekční (rezistence ke spektinomycinu) ukázalo se však, v že e protein E7 byl v chloroplastech i ve fúzi se selekčním m proteinem aada velmi nestálý

. 7), že e samotný onkoprotein E7 je v buňkách vysoce nestabilní jeho stabilizace jsme dosáhli fúzovf zováním m s β- glukuronidázou (Vlasák et. al.

3 transformační vektor obsahoval mezi sekvencemi plastidové DNA z oblasti sousedících ch genů rpob a trnc v oblasti LSC (integrační místo č.. 3) fúzní gen E7/GUS s promotorem z genu pro 16S rrna a s terminační sekvencí z genu rbcl z Chlamydomonas reinhardtii a gen aada se stejnými regulačními sekvencemi

. 3) fúzní gen E7/GUS s promotorem z genu pro 16S rrna a s terminační

4 listové segmenty velikosti zhruba x cm z in vitro rostlin tabáku Nicotiana tabacum var. Samsun položených vrchní stranou listu na agarovém médiu RMOP (Svab( et al.. 199) bez spektinomycinu zařízen zení od firmy Bio-Rad PDS 1/He Au částice velikosti,6 µm tlak hélia h 11 (asi 4,7 atm) ) psi, snížen ení tlaku v komoře e o 8 Hg,, vzdálenost mezi průtr tržným diskem a nosičem Au částic 6 mm, vzdálenost pohybu nosiče e Au částic 11 mm,,5 mg Au a,8 µg g DNA na střelu, vzdálenost letu Au částic 9 cm po dvou dnech kultivace při p i 4 C C a 16 hod. fotoperiodě s nízkou intenzitou osvětlen tlení byly segmenty rozstříhány na velikost zhruba 5x5 mm a umíst stěny spodní stranou na médium RMOP s 5 mg/l spektinomycinu regenerované prýty byly přeneseny p k zakořen enění na bezhormonáln lní médium se spektinomycinem

diskem a nosičem Au částic 6 mm, vzdálenost pohybu nosiče e Au částic 11 mm,,5 mg Au a,8 µg g DNA na střelu, vzdálenost letu Au částic 9 cm po dvou dnech kultivace při p i 4 C C a 16 hod.

6 celkem získz skáno z x1 střel 9 spektinomycin rezistentních prýtů,, z toho zakořenilo na spektinomycinu a byla u nich změř ěřena aktivita GUS a PCR ověř ěřena integrace transgenu do ptdna Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* * aktivita GUS v pmol/min/mg listu

7 potenciáln lně homoplasmické rostliny byly získz skány dlouhodobou kultivací případně regenerací (1-x) listových explantátů na médiu m RMOP se spektinomycinem poté byly tyto rostliny (celkem 15) přivedeny p do květu a zkříženy s netransgenní samčí rostlinou stejného kultivaru sklizená semena každé rostliny byly v množstv ství -4 vyseta na selekční médium (se spektinomycinem) bylo-li li potomstvo homogenně zelené,, usuzovali jsme na homoplasmii z hlediska genu aada vyskytly se však v i štěpné poměry zel. x žl.. resp. zel x bílé, b které značily heteroplasmii mateřských rostlin z hlediska genu aada (Tab. )

každé rostliny byly v množstv ství -4 vyseta na selekční médium (se spektinomycinem) bylo-li li potomstvo homogenně zelené,, usuzovali jsme na

8 Č. rostliny Počet reg. cyklů Č. prim. transformanta Aktivita* mateř. r. Štěpnýpoměr zel. žl. bíl. 31X X X X X X X X X X X X X X X * aktivita GUS v pmol/min/mg listu

196 435X 33 5 199 437X 33 89 195 438X 3 1136 379 1 449X 33 376 198 454X 33 1431 146 53 46X 1

9 část žlutých a bílých b semenáčků (tj. senzitivních čili bez genu aada) ) byla co nejdříve přenesena p ze selekčního média m na půdu p bez selekční látky tím m se podařilo zachránit většinu v těchto t rostlin (celkem 9 jedinců), které byly dále analyzovány ny měřm ěřením m aktivity GUS a PCR Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* 49X X X X X6 9 47X X X X X X X X X9 37 5X X X X X X1 19 5X X X 58 5X X X3 65 5X X X4 46

v těchto t rostlin (celkem 9 jedinců), které byly dále analyzovány ny měřm ěřením m aktivity GUS a PCR Č. rostliny Aktivita* Č.

10 9 rostlin s vysokou aktivitou GUS bylo autogamizováno no,, získanz skaná semena byla vyseta na MS médium m a u 15 náhodnn hodně vybraných semenáčků každého potomstva byla změř ěřena aktivita GUS z analyzovaných rostlin bylo vybráno 6 jedinců s vysokou aktivitou GUS (a jeden bez aktivity), kteří byli analyzováni ni PCR s primery P1 a P (průkaz přítomnosti genu aada) ) resp. P3 a P4 (průkaz přítomnosti genu gus) na základz kladě těchto výsledků bylo vybráno 8 rostlin, které byly dále d analyzovány ny Southernovou hybridizací (soy gus a rpob), RT-PCR na E7/GUS i aada a westernovou hybridizací (antigus,, antie7)

analyzováni ni PCR s primery P1 a P (průkaz přítomnosti genu aada) ) resp.

11 Č. rostliny Aktivita* Prům. aktivita potomstva Aktivita vybraných rostlin 438X ; 484; X ; 494; X ; 661; 771; X ; X ; 59; 813; X ; 481 5X ; 9; 155 5X ; 635; 673; 469 5X ; 11 * aktivita GUS v pmol/min/mg listu

539; 494; 538 47X3 65 53 68; 661; 771; 677 47X4 46 45 64; 618 47X5 498 458 56;

12 PCR: primery P1+P PCR: primery P3+P4

13 SB: soa rpob SB: soa GUS

14 RT-PCR: E7/GUS RT-PCR: aada

15 WB: antigus Transformace genem E7/GUS

16 výsledkem je získz skání 6 homoplasmických rostlin nesoucích ch pouze gen E7/GUS,, jedné rostliny pouze s genem aada a jedné rostliny nesoucí v její ptdna buď oba geny v původnp vodní konfiguraci nebo pouze fúzní gen E7/GUS fúzní protein E7/GUS však, v zdá se, ani v tomto případě nevzniká,, detekován n byl pouze protein GUS

buď oba geny v původnp vodní konfiguraci nebo pouze fúzní gen E7/GUS fúzní

Podobné dokumenty

Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace

Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. BC AV ČR, v.v.i., ÚMBR a PřF JU, Branišovská 31 370 05 České Budějovice http://www.hybridmedicalanimation.com/pages/chloroplast.html