Kyselina hyaluronová. Kyselina hyaluronová. Streptococcus equi subsp. produkovaná kyselina hyaluronová a. Autor prezentace: Mgr.

Transkript

1 Kyselina hyaluronová Streptococcus equi subsp. zooepidemicus a jím produkovaná kyselina hyaluronová a glukuronidáza Marcela Tlustá Biotechnologická laborato Meyer a Palmer, 1934 Extracelulární matrix, o ní sklivec, synoviální tekutina, k Kyselina glukuronová (GlcUA) N-acetylglucosamin (GlcNAc) c) 1,3 a 1,4 Od n kolik MDa Kyselina hyaluronová Kyselina hyaluronová Nev tvená vlákna, v roztocích helikální konfigurace Velikost polymeru: kda - MDa Interakce s molekulami vody Velký hydrodynamický d objem Roztoky s vysokou viskozitou a elasticitou Vynikající mazací vlastnosti Výpl prostoru Filtra ní vlastnosti Vazba na receptory CD44, RHAMM Proliferace, lokomoce bun k, interakce s leukocyty, atd.

2 Kyselina hyaluronová Sklivec oka Synoviální tekutina Extracelulární matrix K P irození mikrobiální producenti: Streptococcus Pasteurela Rekombinantní mikrobiální producenti: E. coli B. subtilis L. lactis Biotechnologická produkce HA Kapsulární polysacharid SEZ Kohoutí h ebínky, sklivec oka hov zího dobytka, kloubní tekutina, pupe ní š ra Streptococcust skupina A a C Bacillus subtilis Kosmetický pr mysl Farmaceutický pr mysl Potraviná ský pr mysl Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Skupina C Nehemolytický Glukuronidáza pozitivní vysokokapsulární 3-5 g/l HA 15 1,5-2 MDa

3 Myšlenka Deaktivace Intracelulární glukuronidáza UDP-GlcUA substrát pro glukuronidázu UDP GlcUA substrát pro glukuronidázu UDP-GlcUA prekurzor prudukce HA Kompetice HA syntázy a glukuronidázy Deaktivace genu pro glukuronidázu Deaktivace genu pro glukuronidázu Porovnaní míry produkce Transkrip ní úrove Zastavení p episu mrna Zm nami v promotoru (delece) Transla ní úrove Zastavení syntézy proteinu Delece RBS Funk ní úrove Zm na sekvence v ORF inzerce nebo delece sekvencí v ORF Deaktivace genu glukuronidázy Na transkrip ní úrovni homologní rekombinace Delece celé promotorové oblasti Delece za átku ORF Zastavení p episu genu Bez glukuronidázové aktivity Šet ení energie Konstrukce muta ní kazety 2 homologické rekombina ní úseky P ed a za deletovanou ástí Velikost úsek p stejná Primery p stejná teplota topení Vn jší primery modifikované na 5 konci rozpoznávacím místem pro RE Jeden vnit ní modifikovaný na 5 konci reverzní formou druhého vnit ního

4 Konstrukce muta ní kazety Separace na elfo HRU1 HRU2 HRU1+2 Muta ní kazeta 650 bp 750 bp 1400 bp. Klonování puc19 EcoRI linearizace Defosforilace HRU1+2 extrakce z gelu Št pení EcoRI Ligace puc19 a muta ní kazety Transformace E. coli DH5 Bílomodrá selekce rekombinantních klon Sekven ní analýza plazmid

5 Bílo - modrá selekce Reklonování Replikovatelný v E. coli i ve S. equi subsp. zooepidemicus Podmín ná replikace (teplota 32 C) Determinanta t antibiotikové tik rezistence it E. coli RR1 Bez selekce rekombinantních klon innost identifikace klon s rekombinantním plazmidem Porovnání Blokování genu Inzercí cizorodé DNA Jednoduchá homologická rekombinace delecí úseku DNA Dvojitá homologická rekombinace Vým nou úseku DNA Dvojitá homologická rekombinace

6 Inzerce vs. delece Inzerce Vyšší pravd podobnost y p p Jednodušší selekce Nadbyte né sekvence Nadbyte né sekvence Delece podobnost jší selekce jší selekce Bez nadbyte ných sekvencí Muta ní plazmid Kombinovaná mutace 2 tandemové homologické rekombinace Inzerce: jedna homologická rekombinace Delece: druhá homologická rekombinace Pravd podobnost jako p i inzerci Selekce jako p i inzerci Bez nadbyte ných sekvencí jako p i deleci Teplotní zm ny 2 rekombina ní místa P ed a za deletovanou oblastí Determinanta antibiotikové rezistence Realizují se i v E. coli i v SEZ Po átek replikace Realizují se i v E. coli i v SEZ Podmín ná replikace Transformace, 29 C, selek ní tlak Inzerce 37 C C, selek ní tlak Delece 29 C, bez selek ního tlaku Lé ba 29 C, bez selek ního tlaku

7 Mutace PCR detekce Mutace Funk ní detekce

8 D kuji za pozornost T ším se na praktickou ást