Dávkování v plynové chromatografii A.Braithwaite, F.J.Smith - Chromatographic Methods, Fifth edition, Blackie Academic & Professional, 1996 Colin F. P

Transkript

1 Dávkování vzorku v GC (GC Inlets) - I Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Dávkování v plynové chromatografii A.Braithwaite, F.J.Smith - Chromatographic Methods, Fifth edition, Blackie Academic & Professional, 1996 Colin F. Poole and Salwa K. Poole - Chromatography Today, Elsevier Amsterdam, 1995 GC Inlets An Introduction Hewlett Packard, 1990,1991, Matthew Klee, Avondale, PA ISBN K.J. Hyver, P.Sandra - High Resolution Gas Chromatography, Third edition, Hewlett Packard, 1989 Ilan A. Fowlis - Gas Chromatograophy, Second edition, Analytical Chemistry by Open Learning, 1995

3 2.2 Dávkování vzorku v GC (GC Inlets) If the column is described as the heart of chromatography, then sample introduction may, with some justification, be referred to as the Achilles heel V. Pretorius Hlavní funkcí dávkovacího zařízení je poskytovat správné, reprodukovatelné nástřiky vzorku na kolonu Nejčastěji jsou na kolony v GC nastřikovány kapalné vzorky pomocí stříkačky, ale je možno dávkovat i plyny s užitím ventilů a dalších pomocných zařízení Dávkovací zařízení se obvykle dělí na dvě skupiny. Injektory pro nastřikování do náplňových kolon tvoří skupinu první a zařízení určená pro kapilární kolony skupinu druhou Provedení nástřiku na náplňové kolony je jednoduché, protože veškerý tok mobilní fáze je veden na kolonu. Na druhou stranu, požadavky na techniku dávkování vzorků v oblasti kapilárních kolon jsou podstatně větší Existuje celá řada nástřikových metod, zejména pro kapilární kolony. Výběr vhodného dávkování je někdy rozhodujícím krokem pro naměření odpovídajících dat

4 2.2.1 Vybrané aspekty související s dávkováním (týká se především kapilárních kolon) Typ analýzy a složení vzorku jsou faktory hrající primární úlohu při výběru následujících parametrů: Technika nástřiku, nastřikované množství vzorku, teplota na nástřiku, výběr kolony a teploty na koloně Rozšiřování píků Základní funkcí nástřiku je vnesení vzorku na kolonu ve formě úzké zóny, jejíž složení má být stejné jako původního vzorku Šířka zóny je po nástřiku zvětšována dvěma mechanizmy: 1. Rozšiřování zóny v čase 2. Rozšiřování zóny v prostoru ad 1. ad2. Je způsobeno pomalým přenosem par vzorku z nástřikového zařízení na kolonu Pokud je nastříknut vzorek ve velkém množství, nestačí kapacita kolny k zachycení vzorku ve formě úzké zóny na jejím začátku, dojde k rozmytí vzorku po větším úseku kolony a k velkému rozšíření zóny vzorku bezprostředně po nástřiku Podobně, když vzorek není kompatibilní se stacionární fází, utvoří velmi nehomogenní dlouhou vrstvu na stacionární fázi, to vede také k zhoršené účinnosti separace ihned po nástřiku

5 Fokusační techniky užívané ke zúžení šířky píků 1. Fokusace na stacionární fázi 2. Fokusace s přispěním rozpouštědla ad 1. Jde o nejčastější fokusační techniku, kterou lze použít jen při teplotním gradientu. V GC je retence solutu exponenciální závislostí teploty. Jestliže je teplota na koloně snížena, rychlost pohybu zón je také výrazně nižší. Pokud tedy vzorek ve formě par přichází na chladnou kolonu, dojde k jeho zachycení v úzké zóně. Teprve následující zvýšení teploty na koloně vede k zahájení separace a k významnějšímu pohybu složek na koloně ad 2. Jakmile se začne na začátku kolony odpařovat zkondenzované rozpouštědlo, má tendenci strhávat s sebou těkavé složky vzorku (podobné těkavosti jako rozpouštědlo) a fokusovat je v úzké zóně Např. Pokud je jako rozpouštědlo užit hexan a teplota kolony je vyšší než bod varu hexanu, neprojeví se efekt fokusace s přispěním rozpouštědla. Jestliže je ovšem jako rozpouštědlo užit oktan s teplotou varu nad teplotou na koloně, složky s nízkou retencí (vysokou těkavostí) jsou fokusovány v úzké zóně a následná separace vede ke vzniku úzkých píků

6

7

8 Retention Gap Jde o prázdný kus kapiláry, který je schopen pojmout kondenzovaný vzorek, ale neretarduje rozpouštědlo ani složky jakmile jsou odpařeny Hlavní účel této kapiláry spočívá v její schopnosti zkrátit oblast, ve které je vzorek kondenzován po nástřiku a chránit vlastní separační kapiláru před netěkavými složkami vzorku Ve chvíli, kdy je solvent odpařen, se všechny složky začnou pohybovat rychlostí mobilní fáze na začátek separační kolony, kde jsou fokusovány rozpouštědlovým efektem a/nebo stacionární fází Obecně, píky s ~ k<5 jsou fokusovány rozpouštědlovým efektem a píky ~ k>5 jsou fokusovány stacionární fází Povrch této prázdné kapiláry je deaktivován s cílem minimalizovat délku kondenzované zóny vzorku. Kromě toho je cílem deaktivace také snížení nebezpečí degradace složek a chvostování. Nepolární rozpouštědla vyžadují nepolárně deaktivované kapiláry a polární rozpouštědla kapiláry polárně deaktivované

9

10 Nástřik vzroku Nástřiková zařízení uvádějí vzorek na kolonu dvěma způsoby: 1. Ve formě výparů po jeho odpaření (většina technik) 2. Ve formě kapalné přímo do kolony ( Cool on-column injection ) ad 1. Klasický postup při nástřiku na kolonu je založen na nástřiku kapalného vzorku stříkačkou do vyhřátého vstupu (inlet), kde dojde k rychlému vypaření vzorku Výhody této techniky Rychlý přesun vzorku již v plynné fázi na kolonu Ochrana kolony před netěkavými složkami, protože ty zůstanou v injektoru Nevýhody techniky: Možné rozšíření píku v čase a prostoru (především splitless technika) Diskriminace jehlou Diskriminace v injektoru Možnost rozkladu vzorku vysokou teplotou Některé nevýhody lze částečně eliminovat použitím rychlých autosamplerů pro dávkování vzorku, významně se sníží diskriminace jehlou, zlepší se přesnost a správnost nástřiků (ve srovnání s manuálním nástřikem)

11

12 Existuje více technik manuálního nástřiku, nejmenší diskriminace jehlou je spojena s technikou horké jehly (hot-needle), kdy je v jehle vzduch a po propíchnutí septa je nástřik proveden po ~3-5s, kdy dojde nejprve k vyhřátí jehly

13

14

15 ad 2. Jedná se o techniku, kdy je vzorek bez převedení do plynné fáze přímo zaveden do chladné kolony Výhody techniky: Eliminace diskriminace jehlou a v injektoru Snížení rizika rozkladu vzorku Vysoká analytická přesnost Nevýhody techniky: Rozšiřování zóny v prostoru Snadné přetížení kolony Možnost kontaminace kapiláry

16 Septum Jedna z klíčových komponent nástřikového systému Septum musí těsnit tak, aby nedocházelo k úniku nosného plynu a do systému se nedostaly složky z okolního prostředí Volba kolony Fázový poměr kolony (WCOT, β = r/2d f ) je velmi důležitý, má velký vliv na kapacitu kolony, a tím na možnou velikost dávkovaného vzorku na kolonu Pokud se β zvyšuje, zmenšuje se množství vzorku, jenž je možno na kolonu dávkovat Kapilární kolony pro obecné použití mají fázový poměr ~ 250 Především na kolonách s vysokou účinností, je kvalita nástřiku zásadní věcí Počáteční teplota kolony je velmi důležitá, jestliže má dojít ke kondenzaci solventu na začátku kolony a využití fokusace solventem, je třeba, aby teplota na koloně byla o ~ 20 C nižší než je bod varu rozpouštědla

17 Inlet Liners Mají přímý vliv na výsledky separace Pokud jsou analyzovány silně znečištěné vzorky, nečistoty se zachytávají na stěnách lineru a nekontaminují kolonu Objem, typ a deaktivaci (obvykle silanizace) lineru je nutno pečlivě vybírat podle aplikace

18 2.2.2 Dávkovače pro náplňové kolony 1. Dávkovač pro náplňové kolony (Packed-Column Inlet) Analýzy na náplňových kolonách jsou používány zejména pokud nejsou vysoké nároky na účinnost Packed-Column Inlet je svou konstrukcí poměrně jednoduchý, veškerý nosný plyn procházející zařízením jde na kolonu (v klasickém zapojení) Jedná se o typ odpařovacího nástřikového zařízení, z toho plynou výhody: kolona je chráněna před netěkavými složkami, ale i nevýhody: v jistých případech dochází k rozkladu vzorku v nástřiku, dochází k diskriminaci jehlou a adsorpci polárních látek na aktivních površích Obvykle se během analýzy pracuje za konstantního průtoku nosného plynu, průtok je nastavován na základě kontinuálního měření teploty a tlaku v systému

19

20 Tepelně labilní látky jsou zpravidla analyzovány pomocí intrakolonové (on-column) techniky přímého nástřiku na skleněnou náplňovou kolonu, kdy je začátek kolony prázdný a nástřik je prováděn přímo do kolony. Vzorek nepřichází do kontaktu s kovovými částmi dávkovacího systému Pokud je vzorek znečištěný je lepší způsob nástřiku extrakolonovou technikou, kdy je nástřik proveden do insertu (kovového) nejlépe opatřeného vyměnitelným linerem Teplota na nástřiku má být asi C nad teplotou varu rozpouštědla a hlavních složek vzorku. V takovém případě je zajištěn účinný přenos vzorku do kolony Průtok nosného plynu na náplňových kolonách bývá kolem 30ml/min helia Flashback-nástřik příliš velkého množství vzorku může vést k jeho rychlému odpaření za vývoje takového množství par, že ani relativně vysoký tok nosného plynu nepřenese odpařený vzorek dostatečně rychle na kolonu a část vzorku se dostane na septum a do nástřikového systému, jenž je kontaminován. Výsledkem mohou být falešné píky, dekompozice vorku, špatná reprodukovatelnost aj.

21 2.2.3 Dávkovače pro kapilární kolony 2. Dávkovač pro přímý nástřik na kapilární kolony (Capillary direct Inlet) Dávkovač pro náplňové kolony je snadno modifikovatelný pro široké kapilární kolony (wide-bore capillary columns) Princip činnosti dávkovače je velmi podobný a také výhody a nevýhody jsou v podstatě stejné Nastřikovaný objem je třeba důsledně omezit, nemá přesáhnout 1µl, a průtok nosného plynu má být vysoký, aby nedošlo k přetížení kolony a neprojevil se flashback efekt Linery jsou zásadní částí nástřikového zařízení a je nutno zvolit vhodný tvar a velikost, podle charakteru vzorku a především rozpouštědla Průtoky na kapilárách s vnitřním průměrem 0.53 mm jsou asi 3 ml/min v optimu van Deemterovy závislosti pro helium, pneumatický systém musí umožnit nastavení stabilního průtoku Fokusace vzorku pomocí solventu a na koloně je velmi důležitým a efektivním způsobem dosažení vysokých účinností dělení

22

23 3. Dávkovač s děličem toku (Split Inlet) Kombinovaný split/splitless dávkovač je nevíce užívaným nástřikovým zařízením pro kapilární kolony vzhledem k jeho univerzálnosti Dávkovač s děličem toku byl historicky prvním nástřikovým zařízením používaným pro kapilární kolony Kapalný vzorek je vnesen stříkačkou do horké oblasti dávkovače a bleskově odpařen. Pouze malá část vzorku je uvedena na kolonu a větší podíl par je veden mimo kolonu do odpadu, tím je zabráněno přetížení kapilární kolony

24

25

26 Split technika je vhodná především pro kolony s průměrem pod 0.5 mm, které nejsou vhodné pro přímý nástřik vzhledem k jejich velmi malé kapacitě a snadnému přetížení Technika zaručuje, že na kolonu přichází jen velmi úzký pás odpařeného vzorku díky vysokým průtokovým rychlostem v nástřiku Tok je dělen do tří proudů: 1. Oplach septa 2. Do lineru 3. Tok v lineru je dělen do kolony a mimo kolonu Split technika je zvláště vhodná pro vzorky: 1. Velmi koncentrované 2. Velmi těkavé 3. Které nelze ředit pro analýzu (testy rozpouštědel) 4. Plyny, které nelze fokusovat 5. Znečištěné, jen limitované množství vstupuje na kolonu 6. Analyzované při ultravysokém rozlišení, při vysokém dělícím poměru >1: Látky v malých koncentracích eluující se před píkem solventu

27 Liners- řada typů, obvykle plněné skelnou, křemenou vatou, apod. ke zvýšení reprodukovatelnosti a snížení diskriminace, díky zajištění dokonalého odpaření vzorku před vstupem na kolonu. Důležité je umístění plniva

28

29

30 Tok nosného plynu: 1. Oplach septa: ~3-5ml/min, 2. Dělící poměr (split ratio) = tok nosného plynu na kolonu/tok nosného plynu do odpadu [ml/min] Poměr bývá v rozmezí: 1:5 1:500 Největší výhodou dávkovače s děličem je eliminace nežádoucího rozšiřování píků vlivem nástřiku, neboť vzorek je na kolonu vnášen velkými rychlostmi v úzké zóně Nevýhodou je ovšem možná diskriminace jehlou, ale na rozdíl od předchozích technik přímého nástřiku i diskriminace v dávkovacím zařízení. K diskriminaci v dávkovači dochází neuplným odpařením určitých složek, vzájemně odlišnou difúzní rychlostí složek od místa nástřiku k začátku kolony

31 Diskriminace jehlou může být omezena: Autosamplerem Minimální teplotou na nástřiku Nástřikem velkého objemu vzorku Použitím rozpouštědla s vysokou hodnotou bodu varu Diskriminace v dávkovacím zařízení se zpravidla týká výševroucích komponent a může být omezena: Zvýšením teploty na nástřiku Zmenšením objemu nastřikovaného vzorku Volbou vhodného lineru Snížením dělícího poměru

32 4. Dávkovač s uzavřeným děličem toku (Splitless Inlet) Běžný dávkovač s děličem je provozován ve splitless modu Vzorek je odpařen v nástřikovém zařízení s uzavřeným děličem, takže veškerý vzorek s nosným plynem proudí na kolonu. Díky nízké teplotě kolony dojde ke kondenzaci rozpouštědla na začátku kolony a fokusaci vzorku. Zbytek vzorku, který nebyl převeden do kolony, je z nástřikového zařízení odstraněn otevřením děliče a profoukáním nosným plynem, a pak je zahájen teplotní gradient na koloně

33

34

35 Největší výhodou tohoto systému nástřiku (ve srovnáním s dávkováním se splitrem) je to, že většina vzorku je vnesena na kolonu, což je důležité při velmi malých koncentracích analytu. Látky eluující se na chvostu rozpouštědla mohou být solventovým efektem účinně fokusovány Nevýhodou je poměrně nízká rychlost přenosu vzorku z dávkovače na kolonu, dochází k rozšiřování píků, proto je nutno využít některé z fokusačních technik Rozpouštědla pro splitless techniku musí být volena tak, aby byla kompatibilní nejen pochopitelně se vzorkem, ale také se stacionární fází na níž kondenzují. Pokud tomu tak není, je nutno použít retention gap Pokud jsou analyzovány komponenty s vysokým bodem varu, splitless analýza je nezávislá na bodu varu rozpouštědla a na počáteční teplotě na koloně. Přestože je teplota kolony na začátku analýzy vyšší než je bod varu rozpouštědla a nedojde k fokusaci pomocí solventu, stačí fokusace na stacionární fázi k účinnému zkoncentrování složek na začátku kolony Liners-obvykle mají objem od 0.25ml-1ml, podle způsobu nástřiku Pro manuální pomalý nástřik je lepší menší objem (omezené rozšíření vzorku na koloně), pro autosamplery větší (flashback) Aktivita lineru může komplikovat analýzu, protože doba kontaktu se vzorkem je reletivně velká. Linery se užívají prázdné i plněné

36 Příliš nízká teplota na nástřiku může mít za následek diskriminaci nástřikem Důležité je stanovaní doby přepnutí ventilu po nástřiku (Purge Delay Time). Obvykle se volí tak, aby 95% vzorku bylo vneseno na kolonu Pro analýzu složek eluujících se na chvostu solventového píku je lépe zvolit krátký čas pro přepnutí ventilu po nástřiku, protože to vede k zaostření píků s malou retencí Pro analýzu pozdě eluujících složek naopak dlouhý čas, protože je tím eliminován vliv diskriminace nástřikem a zvyšuje se citlivost bez nebezpečí snížení účinnosti Obecně ovšem platí, že použití dlouhé doby před přepnutím ventilu vede k vyšší kontaminaci kolony a dlouhým dobám analýzy

37

38 5. Dávkovač pro přímý nástřik za studena (Cool On-Column Inlet) Nástřik je proveden autosamplerem nebo manuálně, existuje více technicky odlišných dávkovačů tohoto typu Pro manuální nástřik se používá stříkačka s jehlou z taveného křemene, která je určena k vnesení kapalného vorku přímo na kolonu. Speciální ventil z měkkého elestomeru zabezpečuje těsnost systému (duckbill valve). Při manuálním nástřiku vzorku se jehla pomocí vodiče jehly zavede do kapilární kolony, aniž by došlo ke kontaktu jehly se septem, pak je jehla utěsněna v septu, vzorek rychle nastříknut a jehla vyjmuta ze septa Vzorek vytvoří v koloně stabilní film (flooded zone). Pak je zvýšena teplota na nástřiku a na koloně a začne separace Při automatickém nástřiku je pro dávkování využívána běžná jehla autosampleru, speciální ventil je nahrazen septem

39

40 Výhody při správném provedení: 1. Eliminuje diskriminaci nástřikem 2. Diskriminace jehlou je zcela vyloučena 3. Eliminuje tepelnou degradaci vzorku v nástřiku 4. Vede k zkoncentrování složek majících malou retenci efektem solventové fokusace 5. Nejpřesnější metoda dávkování z kvantitativního hlediska Omezení a nevýhody techniky: 1. Maximální nastřikované objemy jsou poněkud menší (0.2-2µl) než u ostatních technik, pokud není zařazena před dělící kolonu retention gap 2. Složky, které se eluují těsně před rozpouštědlem nejsou fokusovány a je těžké je stanovit 3. Kapilární kolony lze snadno přetížit 4. Nečistoty obsažené ve vzorku mohou kontaminovat kolonu 5. Parametry na nástřiku a kolně je nutno důsledně optimalizovat

41 Příprava vzorku a nástřik vyžadují velkou pozornost, protože musí být vyloučena možnost nepříznivých vlivů jako: přetížení kolony, nekompatibilita solventu s kolonou, kontaminace kolony apod. Nástřik je nutno provést velmi rychle, nemá dojít k nanesení vzorku na jehlu z vnější strany Pokud je nástřik velký nebo průtok nosného plynu nízký, vzorek kontaminuje jehlu i septum, může dojít k deformování píků a jejich štěpení

42

43

44 Retention gap Chrání separační kapiláru před kontaminací netěkavými složkami Vede k větší fokusaci vzorku na separační koloně Slouží ke spojení autosampleru s úzkými analytickými kapilárami Lze zařadit jako interface pro multidimenzionální chromatografické techniky-lc/gc Deaktivace povrchu je často nutná

45 6. Dávkovač s programovatelnou teplotou (Programmed-Temperature Vaporizer Inlet - PTV) PTV dávkovač kombinuje výhody split, splitless a on-column dávkovačů, tak je nejuniverzálnějším nástřikovým zařízením pro GC Vzorek je nastříknut do chladného lineru, pak je zvyšována teplota nástřiku a vzorek je odpařen. Lze nastavit dělící poměr a teplotu, tím docílit split nebo splitless funkce

46

47 Výhody PTV: Vyloučení diskriminace vzorku jehlou Minimální diskriminace nástřikem Možnost nastřikovat velké objemy vzroku (>200µl) Možnost selektivního odstranění rozpouštědla a nízkovroucích komponent Zachycení netěkavých složek v lineru, omezení kontaminace kolony Možnost techniky split/splitless Reprodukovatelnost retenčních časů a ploch téměř stejná jako u techniky cool on-colunm Lze provést zkoncentrování plynů z nástřikových ventilů, headspace aj. Není třeba speciální jehla pro nástřik

48 Nejběžnější techniky nástřiku s PTV: 1. Nástřik za studena s děličem (Cold Split PTV Injection) Nástřik kapaliny se provede do chladné odpařovací komory, to vyloučí diskriminaci jehlou. Po vyjmutí jehly je otevřen dělič a komora je vyhřáta. Toky par jsou děleny mezi kolonu a odpad, stejně jako při split technice. Vzorek je ale odpařován postupně, odpařování se děje v pořadí těkavosti složek, které se také postupně dostávají na kolonu, to umožňuje dávkovat větší objemy vzorku bez ztráty rozlišení 2. Nástřik za studena s uzavřeným děličem (Cold Splitless Injection) Technika vhodná pro stopovou analýzu, podobně jako běžná splitless metoda, ale s výhodou sníženého nebezpečí diskriminace jehlou a rozkladu vzorku vysokou teplotou na nástřiku Nástřik kapaliny je proveden do chladné odpařovací komory, pak je nástřik vyhřát a vzorek postupně odpařen a nanesen na kolonu, která je udržována na nízké teplotě, analogicky jako pro normální splitless techniku, dojde k rekondenzaci rozpouštědla a fokusaci solventem. Po celou dobu je uzavřen splitovací ventil. Jakmile je vzorek kvantitativně přenesen na kolonu, je splitr otevřen a zbylé páry jsou z odpařovací komory odstraněny rychlým průtokem nosného plynu

49 3. Nástřik s odstraněním rozpouštědla (Solvent Elimination Split/Splitless Injection) Je používán pro selektivní odstranění rozpouštědla ze vzorku, lze nastřikovat stovky mikrolitrů vzorku Kapalný vzorek je nastříknut do odpařovací komory při uzavřeném splitovacím ventilu. Teplota na nástřiku je těsně pod bodem varu rozpouštědla, nástřik vzorku je proveden pomalu aby se zabránilo efektu flashback. Po nástřiku je otevřen splitovací ventil a aplikován vysoký průtok nosného plynu, ~1000ml/min pro odpaření rozpouštědla. Po odstranění větší části rozpouštědla ze vzorku se splitovací ventil uzavře a teplota na nástřiku postupně zvýší. Vzorek je přemístěn na kolonu a začne separace Technika umožňuje zvýšit citlivost analýzy pro méně těkavé látky bez negativního vlivu přetížení kolony Látky těkavé jsou ovšem částečně eliminovány spolu s rozpouštědlem Látky středně těkavé mohou být uvedeným postupem separovány, ale s využitím plněného lineru adsorbentem, skelnou vatou, Tenaxem, polymerním materiálem atd. Pro desorpci se užívá vysokých teplot 300 C-možná dekompozice vzorku

50 Chlazení nástřiku je prováděno Peltierovou technikou, kapalným dusíkem a oxidem uhličitým Vyhřívání elektricky nebo předehřátým stlačeným vzduchem Liners-obvykle stačí menší objem. Tvar lineru a správná volba případné náplně a její deaktivace je velmi podstatná. Často se užívá deformovaný liner umožňující velké objemy nástřiku