Transkript

1

2 ŽIVOTNÍ CYKLUS X BUNĚČNÝ CYKLUS Alternativní programy EB: Meiosa, sporulace, párování diferenciace apoptosa PB: Sporulace diferenciace apoptosa-like Externí signály zdroje živin další buňky teplota atd. Změna v dalším vývoji buňky: - alternativní programy - dráhy signální transdukce ROZHODOVÁNÍ: EB: G1 fáze START mitosa X alt. program PB? Před iniciací replikace B.dělení X alt. program VNĚJŠÍ PROSTŘEDÍ EB: Mitosa PB: Buněčné dělení Konstantní Cyklická reprodukce buňky Zachování kontinuity jaderné (DNA) i mimojaderné informace Interní signály

3 METODY STUDIA BUŇEČNÝCH A ŽIVOTNÍCH CYKLU KLASICKÉ METODY 1. SYNCHRONISOVANÉ KULTURY selekční a indukční metody a) SELEKČNÍ - velikost buněk (filtrace) - hustota (gradienty) -stáří filtr b) INDUKČNÍ - složení média (limitace fosfátů, vitaminů etc.) -teplota -tma/světlo (řasy) - chemické látky 2. MATEMATICKÉ METODY Generační doba τ Relativní stáří buňky: a = t / τ, t je doba od posledního dělení 3. MIKROSKOPICKÉ TECHNIKY / BARVENI

4 4. GENETICKÉ METODY: Mutanty buněčného cyklu + molekulárně biologické (genové manipulace) + cytologické Replikace Cytoskelet B.stěna X Organely atd. X Morfologie - TERMINÁLNÍ FENOTYP Problém = LETHALITA termosensitivní (ts) a chladosensitivní (cs) mutanty (termolabilní protein; reversibilní x ireversibilní) Analysy ts (cs) mutant: - terminální fenotyp - komplementace mutace - knihovna divokého kmene (centromerové vektory) isolace genu Analysy genů: - sekvenční/restrikční/počitačová - funkce genu v buňkách: amplifikace, modifikace genu (lokalisace), suprese jiných mutací, lokalisace v buňkách za různých podmínek (imunofluorescence etc.) MUTACE: Zrušení funkce X Změna funkce (např. jiný komplex)

5 MODERNÍ METODY 1. NOVÉ TECHNIKY BARVENÍ / MIKROSKOPIE - GFP (Green fluorescent protein) - varianty barevné, optimalisace pro organismy možnost sledování chování proteinů in vivo (kvasinky - genomové GFP fuse) 2. TECHNIKY GENOMIKY A PROTEOMIKY - sekvenování genomů a) Technika mikroarrays b) Technika 2d elektroforesy / MALDI analysa etc -proteomika c) DATABASE SGD Stanford Genomic Resources Published Datasets Stanford PROTEOME, YPD, d) PROJEKTY PŔÍPRAVY KMENU - EUROSCARF, deleční mutanty, kmeny - TRIPLES database - GFP-tag kmeny - lacz - tag kmeny

6 BUNĚČNÝ CYKLUS PROKARYOT : E. COLI Replikace DNA Růstové pochody (složky biomasy, povrchové struktury) Specifika (x EB): E.coli Generační doba = závisí na kultivačních podmínkách (E.coli: minimální gen. doba = 20 min = 1/2 doby replikace) Interval před zahájením replikace DNA (pouze je-li gen doba > 60min) Fáze B Replikace DNA Fáze C = 40 min (analogie S-fáze) Interval mezi terminací replikace a dělením buňky Fáze D = 20 min (analogie G2+M fází) Gen doba < 60min PŘEKRYVNÉ CYKLY

7 Gen doba < 60min PŘEKRYVNÉ CYKLY Inic. Termin. Dělení τ = 60 min C D τ = 50 min τ = 40 min τ = 30 min

8 BUNĚČNÝ CYKLUS E.COLI Exponenciální balancovaný růst: Dělení: stejná velikost buněk (pouze při balancovaném růstu x variabilní gen.doba) iniciace replikace ve stejném věku buňky tvorba septa v centru tvorba septa závislá na terminaci replikace pravidelná distribuce nukleoidů do dceř. buněk Interní signály Chemické (regulační proteiny; ionty - např. Ca 2+ - myosin-like molekuly; camp, cgmp etc ) Mechanické - stérické zábrany (např. při septaci) Redundantní regulace I. REPLIKACE 1963 (Jacob, Brenner, Cuzin) - role membrány -iniciační místa na membráně - separace nukleoidů

9 INICIACE REPLIKACE 1 x za buněčný cyklus I. 1. DnaA protein iniciátor replikace (koncentrace v b.cyklu stabilní, konzerv.) oric sekvence - 4 vazebná místa pro DnaA protein, vazba cca 20-40ti monomerů DnaA otevření oric pro replikační aparát ROLE MEMBRÁNY: DnaA - ATP = aktivní DnaA = neaktivní DnaA - ADP = neaktivní MONOMERY - vazba na oric DnaA - ATP ATP Poměrně DnaA stabilní DnaA - ADP ADP FOSFOLIPIDY = hlavně fosfolipidy s nenasycenými mastnými kyselinami 2. DnaA + fosfolipidy = neaktivní komplex (agregát) - nadprodukce DnaA - isolována směs: aktivní monomery neaktivní agregát DnaA+fosfolip. Aktivace fosfolipasami (DnaK) Membrána udržuje část DnaA v neaktivnim stavu (neváže oric)

10 II. INTERAKCE oric S MEMBRÁNOU oric sekvence: 11 kopii GATC Methylace Dam methyltransferasou (dam) Po iniciaci replikace - methylován jen rodičovský řetězec HEMIMETHYLOVANÁ DNA - blok reiniciace replikace -? posun vazby na vnější membránu (? Represorový protein) τ = min hemimethyl. DNA cca 8-10 min MODEL 1) Iniciace replikace na vnitřní membráně. - role fosfolipidů - vhodné množství monomeru DnaA-ATP INICIACE - inaktivace nenavázaného DnaA-ATP - agregace BLOK REINICIACE 2) Hemimethyl. oric DNA - posun z vnitřní membrány na inhibitor na vnější membráně, dokud není DnaA-ATP inaktivován X dam - kmeny

11 SEGREGACE NUKLEOIDU - terminace replikace (FtsA exprese -? signál pro buněčné dělení) - separace nukleoidů - posun 1/4 a 3/4 - septace 1963 Jacob - model - růst membrány X - Inhibice syntézy proteinů - nukleoidy zůstanou centrálně obnovení syntézy proteinů - posun nukleoidů bez viditelného růstu membrány inhibitory tvorby septa neovlivní umístění Růst membrány nemá vliv na odtažení nukleoidů MODEL Filamenta-? Vazbanastěnu (membránu) SEPTACE FtsZ protein = prokaryotický homolog tubulinu MukB protein =? Motorový protein - mutanty mukb - nukleoid zůstává v centru - in vitro vazba s mikrotubuly - interakce s FtsZ proteinem - vazba k DNA C-koncovou doménou - homologie s kinesinem a myosinem - Komplex s MukE a MukF ENZOSKELETON - membrána - DNA - cytoskelet -? Regulace Ca 2+, proteinfosforylace) - role i při adaptaci na různé prostředí

12 mukb -změny hydrodynamických vlastností nukleoidů rozbalení bakteriálního chromosomu MukB - ovlivňuje superhelicitu nukleoidu -? Síla nutná pro kondenzaci a oddělení dceřiných nukleoidů MukB - udržuje nukleoidy stacionárních buněk v kondensovaném stavu kondensované domény chromatinu dekondensované domény chromatinu Replication machinery SeqA vazba na hemimethylovanou DNA vedle replikační mašinerie a replikační vidličky, SeqA udržuje replikující se nukleoid v rozbaleném stavu -po remethylaci SeqA disociuje a MukB obnoví kondensovaný stav Oddělování nukleoidů probíhá paralelně s replikací - replikované domény se rovnou posunují na správné místo Replikace a oddělení nukleoidů v PB jsou paralelní procesy (X EB)

13 BAKTERIÁLNÍ CYTOSKELET

14

15 Bakteriální actin-like cytoskeletální proteiny - homologní k aktinu MreB a MreB homology - role v řadě buněčných funkcí (e.g. Regulace buněčného tvaru, segregace chromosomu, buněčná polarita..) - Proteiny uspořádány do helikálních filamentárních struktur - na vnitřní straně membrány MreB X není jasné, zda MreB hraje nějakou roli v cytokinesi E.coli Caulobacter crescentus Filamenta B. subtilis dynamické struktury, změny v průběhu b.cyklu - MreB protein Thermotoga maritima self-assembly in vitro - dlouhá filamenta - MreB využívá in vitro buď ATP nebo GTP pro tvorbu filament, filamenta pevnější než aktinová (podobnější intermediálním filamentům - poskytuje buňkám pevnost ) Možné role: 1 - regulace tvaru tyčovitých bakterií prostřednictvím organizace biosyntetických enzymů mureinu do helikální struktury podél dlouhé osy buňky - vzorec syntézy mureinu, který je zodpovědný za tyčovitý tvar buňky Murein (peptidoglykan) = primární determinanta tvaru bakteriální buňky, tvoří exoskeleton vně plasmatické membrány

16 2. participace na určení buněčné polarity -? Lokalisace specifických proteinů do jednoho nebo obou pólů buňky Např. C.crescentus - diferenciační cyklus - řada proteinů specificky cílena do jednoho nebo obou pólů (např. membránové histidine kinasy). MreB je pro lokalisaci nezbytný. Není-li přítomen, proteiny difusně rozloženy uvnitř buňky. Dále - polární lokalisace proteinů participujících na chemotaxi, pohybu, virulenci.? Mechanismus? 3. Segregace chromosomů - poškozená není-li MreB nukleoidy nesprávně distribuované v cytoplasmě, buňky bez nukleoidů nebo nukleoidy poškozeny septem -Mechanismus pohybu nukleoidu není znám,? Interakce (přímá nebo nepřímá) oric oblasti s MreB cytoskeletem pohyb podél helikální MreB struktury?

17 MamK aktinový homolog - subcelulární organizace membrán magnetosomů = další role pro aktin-like cytoskelet = umístění organel v bakteriální buňce Magnetosomy - na membránu vázané organely Magnetospirillum magneticum obsahující krystaly železa. Membrány magnetosomů = invaginace cytoplasmatické membrány - podél dlouhé osy buňky. - ohraničeny filamentárními MamK strukturami (MamK-GFP), Vazba MamJ - ΔmamK - nejsou filamenta ani uspořádané řetízky magnetosomů. Magnetosomy - role při orientaci bakterií podle magnetického pole, magnetotaktické bakterie -? Role při nalezení optimálního prostředí pro existenci rozhraní mezi kyslíkovým a anoxickým prostředím v půdě (mikroaerofilní bakerie)

18 FtsA aktinový homolog FtsA - komponenta mašinérie buněčného dělení - interakce s C-koncem FtsZ - Lokalizuje do FtsZ ringu -esenciálníprotein FtsA - in vitro tvoří polymerní strukturu -Váže ATP Funkce?

19 ParM a AlfA proteiny - Role při segregaci plasmidů (low copy number) - Kódované plasmidy E.coli ParRMC (parr a parm geny), pars lokus s repeticemi kam se váže ParR Par - E.coli AlfA B.subtilis, segregace plasmidů, tvoří vlákno mezi póly b.

20 Bakteriální tubulin-like cytoskeletální proteiny - homologní k tubulinu 2 typy = FtsZ a BtubA/BtubB proteiny (Prosthecobacter dejongeii), GTPasy FtsZ protein - vytváří transientní dynamickou helikální strukturu podél dlouhé osy buňky a tzv. Z-ring uprostřed buňky Bacillus subtilis - FtsZ konservativní, pravděpodobně u všech prokaryot - GTP-vazebný protein, GTPasová aktivita - in vitro - polymerace do uspořádané struktury - dynamické vlastnosti, růst z nukleačního místa Dynamická lokalizace v průběhu cyklu Assembly ve středu buňky, zůstává alespon polovinu BC než nastává invaginace Během septace: Z-ring shluknutí na konci invaginace half-life méně než minuta, prodloužení u FTsZ mutants s redukovanou GTPasovou aktivitou Assembly FtsZ - vytvoří se aktivní místo pro GTP hydrolysu mezi asociovanými monomery, k hydrolyse docházi asi hned po assembly Lokalisace (FtsZ-GFP)

21 Interaguje s mnoha proteiny

22 Bakteriální homology intermediálních filament Crescentin - homolog intermediálních filament EB - cca 25 % identita a 40 % similarita s IF EB. - zodpovědný za prohnutý tvar Caulobacter crescentus -cresmutanty = změna tvaru na tyčovitý Filamenta crescentinu

23 CfpA a Scc proteiny - u Spirochet cytoplasmatická filamenta- průměr 5-7 nm (EB IF = 8-10) -4-6 filament pod membránou, podél dlouhé osy buňky (helikální), vazba na membránu prostřednictvím proteinů AglZ protein u Myxococcus xanthus - hraje roli v sociální motilitě, interaguje s malými GTPasami -tvoří filamenta in vitro

24 Další bakteriální cytoskeletární proteiny, které nemají homology v EB MinD/ParA třída bakteriálních cytoskeletárních proteinů MinD skupina: umístění bakteriálních míst dělení ParA skupina: oddělování DNA MinD skupina: tvoří dynamickou helikální strukturu pod cytoplasmatickou membránou In vitro tvorba svazků MinD filament bundles v přítomnosti MinE, ATP, a phospholipidových vesiklů.

25 ParA skupina: plasmid partitioning proteins kódované plasmidy - zodpovědné za distribuci nízkokopiových plasmidů do dceřiných buněk In vivo - ParA proteiny tvoří helikální filamenta osciují podél nukleoidů (podobné min ) In vitro tvorba svazků ParF filament v přítomnosti ParG a ATP.

26 BUNĚČNÉ DĚLENÍ - TVORBA SEPTA Polar annuli (PA) Periseptal annuli (PSA) Elektronová mikroskopie 1983 Vnější membrána Vnitřní membrána Peptidoglykan PSA - vnitřní membrána těsně spojena s peptidoglykanem a vnější membránou - definuje oblast membrány, kde vznikne septum Fluorescenčně značené proteiny - do periplasmatického prostoru - oblasti PSA resp. PA - není volná komunikace se zbytkem periplasmatic. prostoru Komponenty pro tvorbu septa nedifundují, jsou lokalisovány

27 ts MUTANTY = fts (filamenting ts phenotype) - filamenta - blok v buněčném dělení (x mutace ovlivnující i jiné fce - CYKLUS SEPTACE: např sekrece, replikace etc) Předp. fenotyp = filamenta bez PSA (původní PSA dorozdělená) Nebyly identifikovány:? tvorbapsa I. Tvorba nových PSA nezbytná pro růst b. (např. signál pro inkorporaci nového materiálu) = letálni II. Změna lokalisace nových PSA + maturace PSA Zastavení v 1/4 resp. 3/4 délky III. Morfogenese septa Septum - invaginace všech tří vrstev IV. Modifikace PA PA odvozen od původního PSA = obsahuje elementy pro buněčné dělení Předp. fenotyp = filamenta s nekomplet. PSA, náhodně rozmístěná ftsz 84 = nematurovaná PSA náhodně podél filamenta Předp. fenotyp = filamenta s PSA - různá stádia tvorby septa ftsa = kompletní PSA ve správných posicích, po přenesení do permisivní teploty - dokončení sept -začátek invaginace ftsq -ddto enva, cha Změny permeability k antibiotikům

28 MINICELL MODEL: Mutanty min - fenotyp = heterogenní délka buněk v populaci -1 dělení / buněčný cyklus X 3 možná místa dělení Delece min lokusu = MINICELL FENOTYP 3 geny: minc mind mine Analysa min mutant + kmenů nadprodukujících min geny: FENOTYP - nadbytek minc + mind inhibice dělení filamenta - nadbytek mine dělení ve všech místech minicell - delece minc, D, E dělení ve všech místech minicell - delece mine inhibice dělení filamenta 1. Wild type CD E FINÁLNÍ FENOTYP určen poměrem množství min produktů 2. ΔminE nebo nadbytek mincd CD 3. ΔminCD nebo nadbytek mine CD E E E MinC+MinD = inhibitory buněčného dělení ve všech místech MinE = určuje specificitu mincd inhibitoru

29 Min proteiny vytváří dynamické struktury oscilace mezi 2 polovinami buňky MinC a MinD mají stejný pattern i periodicitu oscilace asi oscilují v komplexu (potvrzená interakce MinC a MinD) MinD-ATP vazba na fosfolipidy MinE MinD-ATP MinD-ADP MinE stimuluje ATP hydrolysu jen když je MinD-ATP vázán na membránu ATP a MinE regulují vazbu MinD na membránu Regulace assembly FtsZ uprostřed buňky: MinC je antagonista Z-ring assembly tato funkce stimulovana MinD?MinD přivede MinC k membráně (MinC v nepřítomnosti MinD v cytoplasmě) Cyklus oscilace cca 50s Proč assembly iniciuje na pólu?

30 FtsZ gen - overexprese - minicell fenotyp X nejsou prodloužené buňky - zvýšení frekvence buněčného dělení za buněčný cyklus = dělení v centru zůstává + dělení i na pólech - nadřazeno inhibici min lokusem (nadprodukce mincd částečně suprimuje) - lokalisace PSA INHIBITORY BUNĚČNÉHO DĚLENÍ MinC, MinD SfiA, SfiC: normálně reprimovány dereprese po SOS indukci - reversibilní blok septace (čas pro opravy a rekombinace)

31 Regulace dělení v závislosti na živinách Bacillus subtilis komponenta b.stěny lipoteichoic acid UgtP glucosyltransferasa hodně glukosy - vysoká úroveň aktivity glucolipid biosynthesis pathway UDP-glucose Blok FtsZ assembly glucose 1-phosphate phosphoglucomutasa hodně živin glucose 6-phosphate Lokalizace UgtP v závislosti na živinách UgtP-GFP wt překryvné cykly porucha UgtP dráhy

32 ? Udržuje konstantní poměr FtsZ rings vzhledem k buněčné délce a zajišťuje, že buňka dostatečně naroste a dokončí segregaci chromosomů před cytokinesí