Determinanty lokalizace nukleosomů

Transkript

1 METODY STUDIA CHROMATINU Topologie DNA a nukleosomů

2 Struktura nukleosomu otáčky

3 Struktura nukleosomu 10.5 nt 1.8 otáčky 10n, 10n nt

4 Determinanty lokalizace nukleosomů mechanické vlastnosti DNA (závislé na sekvenci) ohraničující účinek vazby nehistonových proteinů stav sbalení chromatinu Šipka naznačuje míru volnosti pohybu histonového oktameru vzhledem k dvoušroubovici DNA

5 Poloha vazebných elementů DNA vzhledem k nukleosomu a její vliv na vazebné interakce 1. Linker - spojovník 2. rozhraní linkeru a těla 3. tělo nukleosomu Šipka naznačuje míru přístupnosti vazebného elementu

6 Topologie změn polohy nukleosomu vůči specifické sekvenci DNA -rotační poloha - translační poloha Pohyby histonového oktameru vůči určité sekvenci DNA jsou charakterizovány změnou rotační či translační polohy (nebo jejich kombinací)

7 Změna rotační polohy 146 nt - rotace dvoušroubovice DNA kolem podélné osy - v kontaktu s histonovým oktamerem zůstává stejný úsek DNA -mění se poloha vazebného elementu vůči tělu oktameru

8 Změna translační polohy 146 nt linker 146 nt linker - posun dvoušroubovice DNA vůči histonovému oktameru -rotační poloha se nemění

9 Vliv translační pozice na polohu dvou DNA vazebných elementů A B ~70 nt B B A C* C A

10 Princip metod detekce translační polohy nukleosomů Zvýšená citlivost linkerové DNA: -k chemickým modifikacím (DMS, volně-radikálové reakce, apod.) - k endo- a exonukleázám (např. mikrokokální nukleáza; DNáza I)

11 Mikrokokální nukleáza endo- a exonukleáza aktivita závislá na přítomnosti Ca ++ iontů sekvenční specifita (!) chromatin štěpen preferenčně v oblasti linkerů

12 Štěpení chromatinu mikrokokální nukleázou Permeabilizace buněk lyzolecitinem Štěpení chromatinu MNázou MNáza DD Chr Chr Chr MNáza

13 Štěpení chromatinu MNázou DD Chromatin MNáza [t] DD - deproteinovaná DNA

14 Metody identifikace translační polohy nukleosomů přesnost ~20 nt: 1) indirect end labeling přesnost 1 nt: 2) extenze primeru - primer extension (jedna kopie genu v malém genomu - kvasinky) 3) PCR pomocí ligovaných primerů - ligation-mediated PCR LM-PCR = genomic footprinting (velké genomy - savci)

15 Indirect end labeling Permeabilizace buněk lyzolecitinem R R MNáza 1. limitované štěpení chromatinu MNázou 2. purifikace DNA 3. štěpení restrikčním enzymem (R) M DD Chr R R 4. agarózová elektroforéza (20-30 cm) 5. Southern blot 6. Hybridizace s rad. značenou sondou 7. Autoradiografie

16 Indirect end labeling autoradiogram Klon Deprot. DNA G11 C11 D7 MNáza Parentalní pás R R 100

17 Štěpení chromatinu rekonstituovaného in vitro MNázou Indirect end labeling autoradiogram

18 Detekce extenzí primeru 1. Permeabilizace buněk lyzolecitinem 3. purifikace DNA 4. štěpení restrikčním enzymem R MNáza 5. denaturace DNA/anealing R R 2. limitované štěpení chromatinu MNázou 6. DNA syntéza (Taq polymeráza) 7. denaturace DNA, anealing 30 x 8. elektroforéza na PA sekvenačním gelu 9. Autoradiografie

19 Primer extension autoradiogram K. Weiss and R. T. Simpson The EMBO Journal (1997) 16,

20 Princip metod detekce rotační polohy nukleosomů Zábrana/protekce: - DNA methylace (DMS) Gilbert-Maxam -volně-radikálového štěpení DNA Fentonova reakce (askorbát + Fe++) -štěpení DNázou I -oxidačního štěpení KMnO 4

21 Metody detekce rotačního polohy nukleosomů 1) extenze primeru primer extension 2) PCR pomocí ligovaných primerů genomic footprinting/ ligation-mediated PCR

22 Štěpení chromatinu KMnO 4 primer extension autoradiogram

23 GENOMIC FOOTPRINTING LM PCR primer 2 1. limitované štěpení DNA 6. extenze primeru denaturace anealing primeru 1 primer 1 extenze primeru 1 7. linker-primer 8. denaturace anealing primeru 2 a linker-primeru primer 2 extenze linkerprimeru a primeru 2 16 cyklů PCR 4. linker 5. ligace linkeru na tupý konec denaturace nové DNA anealing primeru 2 9. denaturace anealing značeného primeru 3 extenze primeru 3 primer 3

24 GENOMIC FOOTPRINTING LM PCR 10. elektroforéza na PA sekvenačním gelu (50 60 cm) 11. autoradiografie

25 Štěpení chromatinu in vivo DNázou I genomic footprinting autoradiogram J. R.Jackson and Ch. Benyajati, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No

26 Štěpení Exo III nukleázou 5-1. radioaktivní označení DNA konce 2. rekonstituce chromatinu 3. restrikční štěpení (příprava vstupního místa pro Exo III) 4. štěpení Exo III R 5. analýza na PA gelu