SPORULACE BACILLUS SUBTILIS

Transkript

1 SPORULACE BACILLUS SUBTILIS 1.Buňka 1 nebo více buněk odlišných DĚLENÍ EXTERNÍ SIGNÁLY (pokles zdrojů výživy, hustota populace) INTERNÍ SIGNÁLY (stádium buněčného cyklu) Signální transdukce SPORULACE HLADOVĚNÍ - pokles intracelulární hladiny GTP (inhibice GTP biosynthesy = sporulace i v prostředí bohatém živinami HUSTOTA - sporulace pouze při vysoké hustotě buněk feromon-like faktor (peptidy) - akumulace v husté kultuře B.CYKLUS -? NESPORULUJÍCÍ MUTANTY geny Spo0 (A,B,E,F,H,J,K ) - Exprimují se při normálním růstu buněk role v detekci signálů a regulaci přechodu vegetativní růst sporulace - Spo0A = transkripční faktor

2 Terminální buňka LYSE Mateřská buňka (MB) Forespore (FS, pre-spora ) Zárodečná buňka DALŠÍ VÝVOJ Tvorba septa σ F II σ E Tvorba axiálního filamenta 0 - I SPORULACE BACILLUS SUBTILIS 6-8 hod VII V - VI III. IV σ G -Oddělené kompartmenty - Kompletní genomy - Rozdílná exprese (koordinace) - >500 genů (1/10 genů) = časová a místní regulace genové exprese - 5 sigma (σ) faktorů RNA polymeras + 4 DNA vazebné proteiny - cot geny = kódují polypeptidy komponent obalu spory - synt MB - ssp geny = malé proteiny uvnitř spóry (SASP) - synt PRE-SPORA některé vazba na genom = resistence k UV σ k

3 ???? ROZHODOVÁNÍ B.CYKLUS SPORULACE ASYMETRICKÉ BUNĚČNÉ DĚLENÍ JAK ASYMETRICKÉ DĚLENÍ OVLIVNÍ OSUD OBOU KOMPARTMENTU = MB x FS KOMUNIKACE OBOU KOMPARTMENTU BĚHEM VÝVOJE ŘÍZENÍ GENOVÉ EXPRESE V ZÁVISLOSTI NA MORFOGENESI = TIMING Richard Losick (Harvard University) REGULACE úroveň transkripce úroveň post-translační

4 2 KOMPONENTOVÝ REGULAČNÍ SYSTÉM signální transdukce regulace genové exprese a chování buněk jako odpověď na změny externích podmínek A) SENSOR membránový B) REGULÁTOR N Registrace signálu vnitrobuněčný N C Přenos signálu C Přenos fosfátu N Detekce signálu C Funkce Konservativní doména na N-konci 120 AK Konservativní doména na C-konci AK Často histidine protein kinasa - autofosforylace na His Často transkripční faktor PŔÍKLADY: - Sporulace - Chemotaxe - Exprese porinů etc. SPORULACE X DALŚÍ SYSTÉMY Kaskáda fosforylací mezi PK a transkripčním faktorem Regulátor - přímá fosforylace protein kinasou

5 SPORULACE BACILLUS SUBTILIS A) SENSOR = KinA B) REGULATOR = Spo0A kina mutanta - redukce sporulace na 10 % další protein kinasa - KinB kina,kinb mutanta - nesporuluje možná substituce protein kinas KinA =? Integrace signálu množství živin a signálu buněčného cyklu = 3 PAS domény -? Sensing energie buňky a redox stavu - inhibice jako odpověď na DNA poškození nebo blok DNA replikace SIGNÁL KinA + ATP KinA~ P + ADP KinA~ P + Spo0F KinA + Spo0F~ P Spo0F~ P + Spo0B Spo0F + Spo0B~ P Spo0B~ P + Spo0A Spo0B + Spo0A~ P TRANSKRIPČNÍ FAKTOR Geny Spo0F, Spo0B, Spo0A - Není amplifikace signálu - V každém kroku lze ovlivnit - Exprimují se při normálním růstu buněk V nesporulujících buňkách, basální hladina exprese Fosforylace transkripce > 500 genů

6 KinA Cell density signály (sekretované peptidy processing import jako pentapeptidy zpět do buněk inhibice fosfatas) Rap1 Signály Spo0E KinA~ P Spo0F Spo0B Spo0A KinB~ P Spo0F~ P Spo0B~ P Spo0A~ P KinB + další kinásy KinC,D,E Spo0E = Inhibitor iniciace sporulace (specifická fosfatasa, defosforylace Spo0A~ P) -mutace zvýšená sporulace - overexprese inhibice sporulace -některé nonsense mutace inhibice sporulace C-konec - detekce signálu N-konec - inhibice krátké fragmenty mohou inhibovat Rap1 = fosfatasa defosforylace Spo0F~ P Obg gen = GTP-binding protein (esenciální, GTP vazebná doména homologní s RAS)? Detekce hladiny GTP nebo signálů buněčného cyklu regulace aktivity Spo0B HLADOVĚNÍ? Pokles GTP? Aktivace protein kinasy nebo vliv na Obg GTP váže CodY protein (represor sporulace), snížení GTP vede k ztrátě represorové aktivity Obg Signály -? GTP

7 Represor CodY = má 2 ko-represory (GTP, Ile), = snížení každého z nich částečná dereprese Limitace aminokyselin Vazba nenabitých trna na ribosom aktivace inosine monophosphate xanthosine monophosphate ribosome-bound enzyme IMP dehydrogenase Snížení množství GTP branched chain fatty acid -Tvoří 90 % membránových mastných kyselin branched chain keto acid stimulace CodY vazby na DNA Sporulace GTP-binding protein, represor Bacillus subtilis dipeptide (dppabcde) operonu

8 Signály KinA Cell density signály (sekretované peptidy processing import jako pentapeptidy zpět do buněk inhibice fosfatas) Rap1 Signály Spo0E Oligopeptid signál Spo0K KinA~ P Spo0F Spo0B Spo0A KinB~ P Spo0F~ P Spo0B~ P Spo0A~ P Signály KinB + další kinásy KinC,D,E Obg Signály -? GTP AKTIVACE/REPRESE TRANSKRIPCE Spo0K operon = transportní systém = receptor CSF signálního polypeptidu - podobný permease polypeptidů u Salmonella), - substrate binding protein (povrch buňky) - 2 membránové proteiny (přenos substrátu) - 2 ATPasy (ATP hydrolysa, energie) - nadprodukce KinA částečná substituce Spo0K systému? Aktivace protein kinasy po detekci nebo transportu oligopeptidu Spo0A transkripční faktor - Spo0A~ P akumulace aktivace alespoň 500 genů přepnutí ze symetrického na polární dělení (SpoIIE, SpoIIA, SpoIIG) - nutné udržení určité hladiny i po iniciaci sporulace - autoaktivace exprese

9 sigh σ H faktor Spo0A~ P nepřímý regulátor sigh (represe represoru AbrB) - Řídí transkripci spoiiaa-spoiiab-sigf operonu kóduje σ F (časný faktor pre-spóry) Funguje ve vegetativních buňkách

10 SYMETRICKÉ DĚLENÍ POLÁRNÍ DĚLENÍ 0 - I - vegetativní buňky - FtsZ (tvorba septa v místě FtsZ assembly) - Min systém DivIVA PLR Spo0J oric SpoIIIE Chromosome - sporulace nukleoidy spojené axiálním filamentem (stadium I) FtsZ ring - změna posice z centra do oblasti obou pólů - pod kontrolou Spo0A~P (? jaké geny) septum v jednom z polárních rings FtsZ - kontrola sporulačním σ H faktorem (mutanty mají asymetrický FtsZ ring, ale netvoří septum) oba póly jsou místem, kde může septum vzniknout - mutanty v σ E faktoru pre-sporové kompartmenty na obou pólech nukleoid - translokace do pre-spory (přes septum) SpoIIIE = podobný proteinu pro přenos konjugativních plasmidů Streptomycet spoiiie mutanty - 30 % nukleoidu z oblasti ori - chyceno v prespoře (? CEN-like oblast) Spo0J =? Vazba ori k pólu (spo0j / spoiiie mutanta není chycena

11 Vegetativní buňky - FtsZ v centru Iniciace sporulace FtsZ zmizí z centra a objeví se v krajových posicích vyžaduje Spo0A~P FtsZ tvoří spiralovitou strukturu - posun k pólum, stejná struktura FtsA-GFP a EzrA- GFP (proteiny vážící FtsZ) FtsZ -GFP SpoIIIE chromatin centrální ring polární ring Reverse sporulace přidáním živin opět spirály - posun směrem k centru Tvorba spirály závislá na FtsA a na σ H FtsZ - degradace FtsZ Soj Relokalizace z pólu na pól DivIVA RacA exprese SpoIIIE

12 Stádium II asymetrické kompartmenty TRANSKRIPČNÍ FAKTOR σ F PRE-SPORA Mateřská buňka (MB) σ F Forespore (FS, pre-spora ) σ F - kontrolované geny se začnou exprimovat hned jak se vytvoří polární septum σ F : -přítomen před sporulací (imunofluorescence) - po septaci v obou kompartmentech (i v mateřské buňce - imunofluorescence) jeho produkce začíná PŘED septací -v některých mutantách je aktivní před septací a v mutantě s 2 pólovými kompartmenty je aktivní v obou Regulace AKTIVITY σ F Proteiny: SpoIIE SpoIIAB SpoIIAA Syntetisovány před septací SpoIIAB: anti- σ - faktor - vazba σ F inhibice transkripce řízené σ F PK - fosforylace Ser SpoIIAA: anti- anti- σ - faktor - fosforylace prostřednictvím SpoIIAB ruší schopnost SpoIIAA vázat SpoIIAB SpoIIAB: vazebné místo pro adenosinové nukleotidy ovlivnění relativní afinity SpoIIAB pro alternativní vazebné partnery (σ F, SpoIIAA) ATP stimulace tvorby komplexu SpoIIAB - σ F ADP stimulace tvorby komplexu SpoIIAB - SpoIIAA SpoIIE: specifická Ser fosfatasa, defosforyluje (aktivuje) SpoIIAA vazba na σ F - SpoIIAB komplex uvolnění σ F

13 σ F SpoIIAB - σ F (ADP) inaktivní (ATP) SpoIIAB aktivní fosforylace SpoIIAA aktivní σ F SpoIIAA ~ P inaktivní aktivní SpoIIAB - SpoIIAA inaktivní SpoIIE defosforylace? Důležitým regulačním faktorem je pokles hladiny ATP : ADP v malém kompartmentu prespory Preferenční vazba SpoIIAB - SpoIIAA (ADP) SpoIIE: integrální membránový protein, C-doména má fosfatasovou aktivitu Lokalisace: před septací - v obou místech potenciálního polárního dělení (závislá na FtsZ) po tvorbě polárního septa - zmizí z druhého pólu, zůstává v septu aktivace σ F - zmizí i ze septa v době septace - v místě mezi oběma kompartmenty Prespóra = 5-7 x menší než mateřská buňka koncentrace nefosforylovaného SpoIIAA vyšší v PRESPOŘE SpoIIAA -uvolníσ F z komplexu SpoIIAB - σ F Nadprodukce SpoIIE zvýšená defosforylace SpoIIAA ~ P předčasná aktivace σ F + Další role SpoIIE - mutanty - aberantní septum, tenčí vrstva peptidoglykanu -zpoždění septace

14 ? ATP : ADP ATP : ADP IIAB - σ F IIE σ F IIAA ~ P IIAB-IIAA?? -Jak je určena subcelulární lokalisace SpoIIE - Role ADP:ATP etc... MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA TRANSKRIPČNÍ FAKTOR σ E MATEŘSKÁ BUŇKA aktivace genů kontrolovaných σ E - krátce po aktivaci σ F v prespoře syntetisován jako prekursor pro- σ E (SpoIIGB) - aktivován proteolytickým štěpením N-koncových 27 AK synthesa pro- σ E -před asymetrickým dělením, Operon SpoIIG - indukován Spo0A~ P SpoIIGA protein - membránově vázaný - processing pro- σ E, je přítomen před septací Regulace processingu časová (po septaci) i místní (mateřská buňka) Úprava pro- σ E σ E vyžaduje ještě další gen(y) pod kontrolou σ F SpoIIR identifikován časováregulacezávislánaσ F (na prespóře) a na RsfA aktivatoru (pod kontrolou σ F )

15 SpoIIR nese potenciální signální sekvenci - při expresi ve vegetativních exponenciálně rostoucích buňkách - produkce do média SpoIIR sekrece z prespory? kontakt s extra - cytoplasmatickou doménou SpoIIGA (nebo jiného proteinu) SpoIIGA = receptor / proteasa (aspartátová) SpoIIR = sekretovaný signální protein interagující s receptorovou doménou SpoIIGA - aktivace proteasové domény pro- σ E σ E SpoIIGA spoiir spoiir Hlavní funkce SpoIIR: koordinace vývoje mateřské buňky a prespory?? Jak se zabrání, aby SpoIIR neaktivoval SpoIIGA molekuly v membráně prespory? další mechanismy (? Blok aktivity σ E v prespoře) -zjištění, že σ E zmizí z prespory -? fce SpoIIIE

16 ENGULFMENT (POHLCENÍ) = Fagocytosa-like proces σ E σ F III. σ G Kooperace mateřské buňky a prespory MORFOLOGICKÉ ZMĚNY: Konverse post-septačního sporangia Vznik struktury buňka v buňce = STÁDIUM III Degradace peptidoglykanu septa (od centra) vychlípení kompartmentu přespory do mateřské buňky (vyšší osmolarita prespory) migrace cytoplasmatické membrány mateřské buňky fuse uzavření PRESPORY - dvojitá membrána kontrola σ F (prespora) a σ E (mateřská buňka) aktivace řady genů

17 GENOVÉ EXPRESE V PRESPOŘE + KONTROLA MATEŘSKOU BUŇKOU - Po ukončení engulfment stádium III - σ F (prespora) aktivace transkripce SpoIIIG (sigg) v prespoře σ G závislá na přítomnosti σ E v mateřské buňce mateřská buňka generuje signál nutný pro expresi SpoIIIG σ G aktivuje řadu genů pre-spory (včetne ssp) autoaktivace vlastní exprese zvýšení hladiny KONTROLA MATEŘSKOU BUŇKOU na úrovni transkripce na úrovni aktivace (i když je SpoIIIG pod kontrolou jiného promotoru, není σ G dostatečně aktivní bez σ E aktivity ) závisí na 8 proteinech produkovaných ze SpoIIIA operonu pod kontrolou σ E v mateřské buňce, spoiiiah kóduje protein podobný komponentám sekrečního systému. SpoIIIAH interaguje s SpoIIQ prespory pravděpodobně tvoří kanál mezi prespórou a mateřskou buňkou? Co transportuje (?regulační protein/y, malé metabolity, živiny, důležitý i v pozdějších stádiích) KOORDINACE ČASOVÉHO VÝVOJE

18 MATEŘSKÁ BUŇKA REGULACE GENOVÉ EXPRESE V MATEŘSKÉ BUŇCE - KASKÁDA σ E (mateřská buňka) 1. set genů regulační gen SpoIIID (DNA-vazebný protein) SpoIIID spolu se σ E -polymerasou zapnutí 2. setu genů = geny nutné pro σ K (mateřská buňka) σ K -polymerasa σ K -polymerasa zapnutí 3. setu genů - GerE (DNA-vazebný protein) GerE = represor časněji zapnutých genů (včetně σ K ) GerE spolu se σ K -polymerasou zapnutí 4. (posledního) setu genů MATEŘSKÁ BUŇKA: 2 sigma faktory (σ E, σ K ) + 2 DNA-vazebné proteiny (SpoIIID, GerE)

19 ZPĚTNÁ SIGNALISACE Z PRESPORY DO MATEŘSKÉ BUŇKY III. σ G IV σ K σ K Kontrola pozdní genové exprese v mateřské buňce Syntetisován jako pro- σ K (aktivace odstraněním N-koncových 20ti AK) Aktivace (processing) blokován mutací v SpoIIIG (σ G ) Aktivace vyžaduje účinek produktu(ů) genu(ů) aktivovaných σ G v prespoře Role produktu genu SpoIVB lokalisace na membráně prespory SpoIVFB pro- σ K σ K SpoIVB SpoIVB SpoIVB aktivace membránově vázané metaloproteasy SpoIVFB, aktivita modulovaná dvěma membránovými proteiny mateřské buňky SpoIVFA a BofA SYNCHRONISACE VÝVOJE OBOU KOMPARTMENTU exprese σ K bez pro-sekvence předčasná aktivace σ K defekty ve sporulaci, aberantní spory

20 σ K Několik hladin regulace VEGETATIVNÍ BUŇKA SpoIVCA 48kbp MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA SigK SpoIVCA Skin element (48 kbp) obsahuje gen SpoIVCA je aktivován SpoIIID - σ E kóduje místně specifickou rekombinasu - vyštěpí skin element (specifická sekvence 5 bp) spojení SigK genu (pro- σ K ) POUZE V MATEŘSKÉ BUŇCE Skin element homologie s genomem bakteriofága PBSX asi kryptický profág využit buňkou pro- σ K SpoIVCA X Umělé odstranění skin elementu nepoškozuje sporulaci další hladiny regulace Další hladiny regulace σ K : regulace exprese SigK = kombinovaná akce SpoIIID - σ E aktivace odštěpením pro-sekvence positivní feedback = autoaktivace exprese Exprese cot genů (obaly spóry)

21 MATEŘSKÁ BUŇKA σ A σ H Spo0A~ P POLÁRNÍ DĚLENÍ PRESPORA FM membrána SpoIIE σ F FM membrána spoiid-gfp (σ E ) pro- σ E σ E SpoIIGA-SpoIIR proteolýza? SpoIIIA kanál σ G spoiiq-gfp (σ F ) FM membrána FM membrána sspa-gfp (σ K ) pro- σ K σ K cot SpoIVFB-SpoIVB proteolýza Septum/ obal prespory ssp gere-gfp (σ G ) Membrána prespóry není dostupná pro lipofilní FM4-64 (engulfment)

22

23 LABORATORNÍ KMENY, INDIVIDUÁLNÍ BUŇKY X DIVOKÉ KMENY ISOLOVANÉ Z PŘÍRODY Branda et al., (2001), Fruiting body formation by Bacillus subtilis, PNAS 98: Laboratorní kmen Divoký kmen Divoký kmen = u okraje kolonie 100 μm Divoký kmen = SEM 10 μm 10 μm

24 Fuse: - lacz genu + sspe (exprese v pozdějších fázích sporulace, prespora) - lacz genu + spoiid 50 μm Vzdušné (aerial) struktury na koloniích lokalisace exprese lokalisace sporulace MÍSTNÍ LOKALISACE DIFERENCIACE UVNITŔ MNOHOBUNĚČNÉ STRUKTURY Podobně u dalších mikroorganismů - Streptomyces, Myxobacteria etc...

25 REGULACE LOKALISACE SPORULACE? Analysa mutant - v genech Spo0A, Spo0H (σ H ) = regulátory iniciace sporulace - v genu SigF (σ F )= časný regulátor vývoje prespory - v genech YveQ and YveR = transkripce pod kontrolou Spo0A a σ H, pravděpodobně kódují enzymy syntetisující EPS (exopolysacharide, často součástí mnohobuněčných agregátů, biofilmů) - mutanta sfp = nemá phosphopantetheinyltransferasu, která je důležitá pro produkci surfactinu (surfactants důležité pro tvorbu vzdušných struktur - snížení povrchové smáčivosti ) 0.5 μm Spo0A, Spo0H (σ H ) ROLE PŘI TVORBĚ VZDUŠNÝCH STRUKTUR, KTERÉ SE STANOU MÍSTEM SPORULACE MNOHOBUNĚČNÝCH POPULACÍ B.SUBTILIS, ASOCIOVANÝCH S PEVNÝM POVRCHEM

26 Změny ve vnitrobuněčné koncentraci Spo0A-P regulují odlišnou genovou expresi v různých buňkách Nižší hladina Spo0A-P Vysoká hladina Spo0A-P Transkripční represor, konstitutivní Studium diferenciace

27 Okraj kolonie Diferenciace v kolonii/biofilmu

28 B. subtilis E.coli P. aeruginosa B. subtilis Aguilar et al., Curr Opin Microbiol. 10: , 2007 Veening et. al,.j Bacteriol. 188, , 2006? DOMESTIKACE = Obecná vlastnost mikroorganismů

29 Kanibalismus Bacillus subtilis Stress indukce záchranného programu, např. sporulace - spóry přežijí Spo0A aktivován pouze v cca ½ buněk populace při hladovění (závisí na podmínkách) směsná populace buněk (Spo0A-ON) a buněk (Spo0A-OFF) základem pro kanibalismus Spo0A-ON buňky: zapnutí transkripce operonů skfa-h a sdpabc produkce a export peptidového faktoru Skf podobného antibiotiku (cyklický 26 AK peptid) + proteinového toxinu SdpC zabijí Spo0A-OFF buňky Spo0A-ON Skf Sporulation killing factor Spo0A-OFF Sdp Sporulation delay protein 42 AA peptid Živiny ze zabitých buněk zpomalí sporulaci, resp. průchod Spo0-ON buněk stádiem, kdy je nastartován irreversibilní program - Oddálí se rozhodnutí Ochrana Spo0A-ON buněk před zabitím skfa-h nese geny pro proteiny exportující peptidový killing faktor. SdpC proteinový toxin stimuluje sousední operon SdpRI SdpI imunitní protein pouze v Spo0A-ON buňkách

30 Kanibalismus Bacillus subtilis v kolonii/biofilmu - Spo0A-ON buňky, které kanibalizují (produkuji toxiny a jsou resistentní), zároveň produkují ECM - Živiny z lysovaných buněk podporují tvorbu ECM, zároveň oddalují sporulaci dokud se nevytvoří struktura ve které spóry vznikají, spóry jsou pak lépe chráněny - Analogie programované buněčné smrti - Koordinace kanibalismu a produkce ECM specifickou buněčnou subpopulací je zprostředkovaná surfactinem který funguje jako quorum sensing molekula.