BUNĚČNÝ CYKLUS CAULOBACTER CRESCENTUS

Transkript

1 BUNĚČNÝ CYKLUS CAULOBACTER CRESCENTUS

2 BUNĚČNÝ CYKLUS CAULOBACTER CRESCENTUS C.crescentus: g - 15 % buněčných proteinů = periodická syntéza nebo syntéza specifická pro buněčný typ -mot + - receptory pro fágy na pólu s flagellem DIFERENCIACE: 1. Časová regulace genové exprese (regulace iniciace transkripce) 2. Posiční informace v buňce Polární flagellum blok reiniciace replikace DNA c Biosyntéza flagella - distribuce proteinů do specifických míst - distribuce mrna CS G2 (30 ) G1 (60 ) S (90 ) stk Ztráta pohyblivosti (mot - ) DNA i replikace Růst a septace B.cyklus - diferenciace sw = swarmer cell b. s flagellem stk = stalked cell b. se stonkem Ztráta flagella Tvorba stonku v místě flagella Replikace: - 1 ori, obousměrně - dnac (elongace) = periodická exprese v b.cyklu (konec G1) - dnak ddto

3 Mutanty: - nepohyblivé - tvorba flagella > 40 genů - časová regulace genů pro tvorbu flagella - postupná exprese - ovlivněna postupem skládání flagella - flg geny POSIČNÍ INFORMACE 1) Asymetrická distribuce proteinů (v buňce před dělením) - Proteiny flagella a pro chemotaxi = swarmer pól - specifické sekvence - např. receptorový protein pro chemotaxi - mutagenese C - konec nutný pro distribuci - flagellarní proteiny = segregace stejně ve fla + i fla - buňkách tvorba flagella není podmínkou segregace -Heat shock proteiny = segregace do stalk pólu -Regulační proteiny 2) Distribuce mrna (mrna pro tvorbu flagella) flagellin mrna = swarmer pól? mechanismus Sekvence nezbytné pro transport nebo degradaci a) mrna se přepisuje z obou nukleoidových DNA (po replikaci) - tj. v obou pólech a pak je specificky transportována do 1 pólu b) mrna se přepisuje z obou nukleoidových DNA (po replikaci) - tj. v obou pólech a pak je specificky degradována v 1 pólu c) mrna se přepisuje specificky z 1 nukleoidové DNA (po replikaci) - Experiment = Promotor + reporterový gen

4 Swarmer versus Stalked buňky: DNA se liší - v replikaci - v transkripci? Vliv struktury DNA ( transkripční a replikační aparát odliší nukleoidy) - odlišná sedimentace v sacharosovém gradientu -při přechodu swarmer stalked = změna sedimentace nukleoidů? Během cyklu - různá vazba proteinů změna topologie nukleoidů HU protein (histone-like protein) vazba = blok transkripce IHF protein = homolog USF transkripčního faktoru (EB) = stimulator transkripce, znemožní vazbu histonů? V cyklu - oscilace mezi HU-nukleoproteinovým komplexem (neaktivní) a IHF komplexem (aktivní)

5 ROLE 2-KOMPONENTOVÝCH REGULAČNÍCH SYSTÉMU Kontrolují genovou expresi, DNA replikaci a asymetrickou morfogenesi + regulace mezi procesy Ustanovení buněčné asymetrie: Regulační kaskáda centrální regulátory: 1. 2-komponent regulátor CtrA určuje odlišný osud dceřiných buněk

6 1. CtrA (cell-cycle transcriptional activator) = DNA vazebný protein, reguluje (aktivace i represe) >95 genů (např pro DNA methylaci, buněčné dělení, biosyntézu flagella) 1) Regulace biosyntézy flagella zapíná operony kódující komponenty basalní části flagella (vnitřní membrána) následně i další geny 2) Aktivace i jiných genů (nesouvisejících s flagellem) DNA methyltransferasa (regulována b.cyklem) 3) Represe - FtsZ gen - promotor v ori replikace (5 vazebných míst), transkripce nutná pro iniciaci replikace inhibice DNA replikace v swarmer buňce (inhibuje přechod do S-fáze) stalk buňka proteolytická degradace CtrA specifickou proteasou (ClpXP) iniciace replikace? Časová a místní regulace proteolysy swarmer buňka stalk buňka Inhibice replikace FtsZ CtrA transkripční faktor -Syntéza flagella - DNA methylace

7 LOKALISACE CtrA v průběhu buněčného cyklu (mrna přítomna v průběhu celého cyklu) CtrA syntetizován v závislosti na cyklu a začíná se akumulovat v buňce před dělením CtrA aktivita regulována i na posttranslační úrovni fosforylací a proteolýzou Iniciace replikace ~ P ~ P ~ P ~ P Proteolysa 1. FOSFORYLACE Proteolysa 2. SPECIFICKÁ PROTEOLYSA - závislá na C-konci - role ClpP a ClpX proteasového komplexu lokalizovaného na stalk konci buňky Proteolysa

8 Signální kaskáda zodpovědná za fosforylaci CtrA histidine kinasa CckA a histidine fosfotransferasa ChpT -Kromě CtrA aktivuje CpdR faktor nutný pro polární lokalizaci ClpXP (proteasa degradující CtrA) CckA (cell-cycle kinase A) = membránově vázana histidin-kinasa SENSOR -přítomna v průběhu celého b.cyklu - Modulace aktivity Změna lokalisace CckA v průběhu buněčného cyklu (GFP-CckA) swarmer pól Začíná syntéza CtrA (resp. přestává degradace) Fosforylace CtrA biosyntéza flagella

9 ?? Signál aktivující CckA X kinásová aktivita CckA závisí (nepřímo) na fosforylačním stavu dalšího regulátoru DivK součást centrálního check-point mechnismu monitorujícího stav buněčného cyklu - DivK aktivita regulovaná histidine kinasou DivJ a bifunkční histidine kinasou/fosfatasou PleC Swarmer buňka nízká hladina DivJ, PleC tvoří komplex na pólu s flagellem a funguje jako fosfatasa DivK -DivK (defosforylovaný) aktivuje CckA fosforylaci a akumulaci CtrA-P a následně blokuje replikaci? polární lokalizace proteasy ClpXP

10 Během přechodu do fáze stalk buňky polární PleC je nahrazen DivJ kinasou - zvýšení DivK-P, který interaguje s budoucím stalk pólem zvýšení lokální koncentrace DivK-P vede k další stimulaci DivJ aktivity a k přechodu PleC z fosfatázového do kinázového módu zajišťuje fosforylaci DivK v stalk buňce a tím eliminaci CtrA-P což umožní vstup do S-fáze X Zvýšení koncentrace DivK cyclic diguanylate sensor polární lokalizace proteasy ClpXP

11 Později v cyklu, PleC vytváří nový cluster na opačném pólu než je stopka a kolokalizuje s dalším, nově vytvořeným DivK-P clusterem (stále v kinásovém módu) Po kompartmentalizaci na dvě buňky DivK se rozděli na 2 subpopulace DivK ve swarmer buňce oddělen od kinasy DivJ a interaguje s PleC sníží se fosforylace DivK a uvolní se polární DivK komplex což vede ke změně PleC módu z kinasy na fosfatasu DivK defosforylovaný re-akumulace CtrA-P a zastavení v G1 fázi DivK v stalk buňce jsou dohromady s DivJ a zůstanou fosforylované což umožní další cyklus replikace swarmer stalk buňka buňka X Zvýšení koncentrace DivK?

12 LOKALISACE ParA a ParB - ParA, ParB = esenciální, poruchy v segregaci nukleoidů? Orientace oric? Vazba do specifických míst membrány LOKALISACE FtsZ FtsZ transkripce = reprimována CtrA? Replikace = signál pro FtsZ assembly FtsZ = rozdílná stabilita nestabilní v swarmer buňkách

13 Koordinace dynamiky nukleoidu a buněčného dělení FtsZ MipZ PopZ ParB G1-buňky: -1 nukleoid, ori uchycen do starého pólu prostřednictvím vazby ParB-parS nukleoproteinového komplexu s proteinem PopZ. -Regulator dělení MipZ interaguje s ParB tvoří lineární gradient omezující polymeraci FtsZ do nového pólu Vstup do S-fáze: -duplikace ori a segregace kopií 1 zůstává na původním místě, 2 uchycena na opačném pólu pomocí dalšího nově vytvořeného PopZ clusteru. -MipZ se dostává i do druhého pólu - Desintegrace polárního FtsZ komplexu posun FtsZ ring do oblasti nejnižší MipZ koncentrace centrální oblast

14

15 DIFERENCIACE STREPTOMYCES S.griseus, S.coelicolor 1. Myceliární růst (mnohobuněčné mycelium) 2. Tvorba vzdušných hyf 3. Sporulace (fragmentace hyf) Hydrofobní spóry - pouze na pevném médiu -2. a 3. fyziologické změny v kolonii produkce sekundárních metabolitů (antibiotik)

16 Vzdušné hyfy Substrátové hyfy Sporulující vzdušné hyfy

17 FYZIOLOGIE DIFERENCIACE:? Lokalisace a iniciace větvení hyf? Determinace směru růstu vzdušných hyf? Řízení prodlužování hyf Změny metabolismu: 1. Před tvorbou vzdušných hyf povrchové hyfy akumulují zásobní komponenty (glykogen) znaky začínající autolysy 2. Start diferenciace degradace zásobního materiálu (glykogen) zvýšení vnitrobuněčného turgoru zeslabená místa stěny růst větví (hyf) 3. Růst hyf do vzduchu povrchové hyfy sekretují hydrofobní látky hydrofobní povrchová vrstva v ní vzdušné hyfy a spóry SAPs (spore associated proteins) - isolované z vnějšku spór a vzdušných hyf, SapA mrna v místech iniciace vzdušných hyf 4. Zastavení růstu sporulace vyčerpání zásob substrátového mycelia limitace růstu akumulace zásobních komponent ve špičkách hyf pokles turgoru vchlípení membrány septace 5. Oddělení spór po septaci depolymerace glycogenu (inkorporace do stěn spór) růst turgoru oddělení spór

18 FEROMONY: S.griseus A-faktor (2S - isocapryloyl - 3S- hydroxymethyl - γ- butyrlactone) = 10-9 M - nutný pro sporulaci - nutný pro produkci streptomycinu - mutanty Af - defekt ve sporulaci, suprese dodáním A-faktoru aktivace receptoru ArpA AdpA transkripční aktivator aktivace StrR (streptomycin biosynthesis) a dalších genů Model: Část kolonie = hladovění produkce feromonu difuse do dalších částí kolonie - průnik do hyf (lipidický charakter feromonu) interakce s receptorem diferenciace Synchronní diferenciace celé populace AdsA kóduje σ AdsA, hraje roli v časných morfologických změnách SGMPII extracelulární metalloendopeptidasa mutace zpožďuje vývoj vzdušných hyf + další geny kódující extracelulární proteasy AmfS extracelulární peptidický morfogen - peptid 43 AK Amf cluster 5 ORF AmfT (transmembranový protein podobný Ser/Thr kinase), AmfB a AmfA (ABC transporter), AmfR (regulator 2 komponentového regulačního systému)? trankripční aktivátor

19 S.coelicolor A-faktor-like feromon x Afl mutanta sporuluje jiná mutanta nesporulující jiný faktor Velké spektrum feromonů různé chování různých streptomycet ve stejném prostředí speciace Feromony / antibiotika / diferenciace

20 MUTANTY: bld mutanty ( bald = plešaté) - netvoří vzdušné hyfy - často neprodukují antibiotika (kromě některých, např. bldc) bld A, D, G, H projev mutace závisí na zdroji C na manitolu normální vzdušné hyfy x pouze bldh produkuje antibiotika wt bldh Bld A gen kóduje trna pro Leu UUA (kodon TTA je vzácný ve streptomycetach) trna UUA je unikátní gen s TTA kodonem po vnesení do blda mutanty není exprimován, změna TTA cílenou mutagenesí + exprese navození sporulace blda mutanty jinými podmínkami růstu (manitol) - není exprese genu s TTA BldA trna není pro sporulaci na manitolu potřeba geny pro sporulaci neobsahují TTA a nepotřebují BldA trna gen s TTA asi regulační - pro navození diferenciace SIGNÁL (hladovění na AK) změny uvnitř buněk? Změny hladiny guaninových nukleotidů (např. ppgpp) transkripce BldA trna UUA exprese regulačního genu s TTA X Bld A se exprimuje i v mladé kultuře starší kultura hromadění BldA mrna s 5 upraveným koncem + antisense RNA z promotoru uvnitř BldA

21 Sporulačně specifické geny - whi mutanty, σ - faktory σ whig pro přepnutí vzdušné hyfy sporulace (mutanta nesporuluje) nadprodukce časná abortivní sporulace sporulace v substrátových hyfách sporulace v tekutém médiu homology B.subtilis (σ D ), Salmonella (σ F ), Pseudomonas (chemotaxe) Kaskáda regulací: whig whi A,B whi I

22 SAPs (spore associated proteins) SapB = surfactant role v proražení povrchu růst vzdušných hyf produkce záleží na řadě bld genů BldK SIGNÁL 1 S1 S2 S3 S4 S5 SapB odvozen z rams genu (kóduje protein 42 AK dlouhý) post-translačně modifikován (cástečně asi pomocí RamC) - získá strukturu podobnou lantibiotiku (2 cyklické struktury SapB) Podobná Spo0K B.subtilis SIGNÁL 1 = produkce závislá na bld261 akumulace extracelulárně Do buněk prostřednictvím BldK S1 ram cluster kóduje rams, ramc, ramab (komponenty ABC transporteru) a ramr ramr - kóduje regulátor aktivující ramcsab operon (vazba na operon), ramr není transkribován v blda, bldb, bldh a bldd mutantách ramr je aktivován bld kaskádou

23 Vzdušné hyfy na povrchu tenká vláknitá vrstva ( rodlet layer ) poté, co začnou vyrůstat z vodného prostředí tvořena dvojicemi vláken (8-12 nm silná, až 450 nm dlouhá) podobná vrstvě na povrchu vzdušných struktur vláknitých hub - mají na povrchu nerozpustnou vrstvu tvořenou proteiny hydrofobiny (selfassembly ) - mohou být ektrahovány SDS / kys. trifluorooctová (TFA) extrakce SDS/TFA vzdušných hyf Streptomycet směs dvou majoritních homologních proteinů RdlA a RdlB (RODLINS) Rodlins - lokalisovány na vnějším povrchu vzdušných hyf a spór = tvoří nerozpustnou vrstvu geny exprimovány v rostoucích vzdušných hyfách X ne ve spórách kmeny s delecí 1 nebo obou rdl genů nemají porušenu schopnost tvořit hydrofobní vzdušné hyfy X rodlet vrstva je disorganisovaná rdl mutanty nemají normální rodlet vrstvu x jsou pokryty tenkými fibrilami (průměr 4-6 nm). Podobné fibrily nalezeny v TFA extraktech amyloidy 5 proteinů ChpD-H (CHAPLINS - celkem 8 proteinů) exprese Chaplins závisí na σ-faktoru kódovanému bldn krátké ChpE a ChpH sekretovány do média před začátkem tvorby vzdušných hyf - pravděpodobně umožní únik hyf do vzduchu snížením povrchového napětí (podobně jako SapB) dlouhé chaplins ChpA-C nejsou esenciální pro tvorbu vzdušných hyf (asi pomáhají) - delece 5 chaplins (ΔchpABCDH) opožděná morfogenese delece 8 genů (ΔchpABCDEFGH kmen) netvoří vzdušné hyfy chaplins jsou důležité pro tvorbu struktury vzdušných hyf, orientaci do vzduchu a povrchovou hydrofobicitu Exprese rdla a chp genů není detekovatelná v bld mutantách bld kaskáda důležitá pro expresi X aktivace rdl genů vyžaduje další regulaci kmen ΔchpABCDEH tvoří malé množství vzdušných hyf, které ale produkují a lokalisují RdlA stejně jako wt kmen rdl exprese pravděpodobně začíná poté, co hyfa signalisuje opuštění vodného prostředí? existence detekčního (sensing) mechanismu = sky dráha

24 Model tvorby vzdušných hyf Streptomyces coelicolor Rodlins Chaplins Chaplins Sky sensor SapB extracelulární signály vliv na vývoj prostřednictvím bld kaskády indukce tvorby RamR, chaplins ChpE a ChpH a komponent sky dráhy (sensor růstu vzdušných hyf) RamR aktivuje syntézu RamS konverze na SapB (morfogenetický peptid) sekrece prostředníctvím RamAB transporteru -spolus ChpE a H snižuje povrchové napěti a iniciuje růst vzdušných hyf další vývoj regulován sky dráhou (měla by zahrnovat sensor vzdušného růstu) výsledkem je aktivace rodlin a chaplin genů (a dalších) rodlins a chaplins assembly do hydrofobního rodlet obalu na povrchu vzdušných hyf hydrofobicita (brání agregaci vzdušných hyf)

25 Extracelulární komplementace - SapB - i jiné peptidy: STREPTOFACTIN (S.tendae) HYDROPHOBIN (Schizophillum communae) surfactants spíš než signální molekula Bld221 mutanta SapB S. coelicolor růst substrátového mycelia produkce organických kyselin přepnutí na vzdušné hyfy? Přepnutí na alternativní metabolismus = neutralisace média? Re-absorbce extracelulárních kyselin camp mutanta nedochází k neutralisaci média suprese defektu camp nebo pufrováním média