UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOLOGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD. Diplomová práce

Transkript

1 UIVERZITA KARLVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLVÉ KATEDRA BILGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD Diplomová práce Vyhodnocení aktivity potenciálně antifungálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody Vedoucí diplomové práce: Mgr. Marcela Vejsová, PhD. Hradec Králové 2015 Monika Tichá

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové, dne. Podpis: 2

3 Úvodem bych chtěla poděkovat Mgr. Marcele Vejsové, PhD. za vedení diplomové práce, poskytnutí rad a pomoc při zpracování práce. Dále mé poděkování patří Idě Dufkové za pomoc při zpracování experimentální části. 3

4 bsah Seznam zkratek... 7 Abstrakt... 8 Abstract... 9 Zadání diplomové práce cíl práce Úvod Teoretická část becné vlastnosti hub Přehled hlavních taxonů hub Antimykotika Polyeny Antimetabolity Azoly Echinokandiny Allylaminy statní antimykotika Patologické stavy vyvolané houbami Mycetismy Mykotoxikózy Mykoalergie Mykózy Charakteristika testovaných kmenů Candida albicans Candida tropicalis Candida krusei Candida glabrata Trichosporon asahii

5 Aspergillus fumigatus Absidia corymbifera Trichophyton mentagrophytes Laboratorní metody v mykologii Mikroskopické vyšetření Kultivační metody Biochemické metody Průkaz antigenů a protilátek Molekulárně-biologické metody MALDI-TF MS Hodnocení účinnosti antimykotik Experimentální část Pomůcky Přístroje Chemikálie Testovací kmeny kvasinek a vláknitých hub a jejich zkratky Postup Příprava růstového média Příprava suspenzí testovaných kmenů hub Příprava ředící řady testované látky Pipetování do destiček Inkubace Vyhodnocení Testované látky Deriváty pyrazin-2,3-dikarbonitrilu a a pyrazin-2-kaboxamidu Deriváty -benzylpyrazin-2-karboxamidu Deriváty 3-chloropyrazin-2-karboxamidu

6 Deriváty -benzyl-3-chloropyrazin-2-karboxamidu Deriváty -alkyl-3-(alkylamino)pyrazin-2-karboxamidu Deriváty -benzylpyrazin-2-aminu Výsledky Deriváty pyrazin-2,3-dikarbonitrilu a pyrazin-2-karboxamidu Deriváty -benzylpyrazin-2-karboxamidu Deriváty 3-chloropyrazin-2-karboxamidu Deriváty -benzyl-3-chloropyrazin-2-karboxamidu Deriváty -alkyl-3-(alkylamino)pyrazin-2-karboxamidu Deriváty -benzylpyrazin-2-aminu Diskuze Závěr Seznam tabulek Seznam grafů Seznam obrázků Seznam literatury

7 Seznam zkratek AC AF AIDS c CA cfu CG CK CLSI CT DMS DA ELISA GIT HIV ID M MALDI TF MS MIC MPS ah CCLS PZA RPMI TA TM Absidia corymbifera Aspergillus fumigatus Acquired Immune Deficiency Syndrome koncentrace Candida albicans colony forming unit Candida glabrata Candida krusei Clinical Laboratory Standards Institute Candida tropicalis dimethylsufoxid deoxyribonukleová kyselina Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay gastrointestinální trakt Human Immunodeficiency Virus inkubační doba molární hmotnost The matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spektrometry minimální inhibiční koncentrace 3-(-morfolino)propansulfanová kyselina hydroxid sodný The ational Committee for Clinical Laboratory Standards pyrazinamid Roswell Park Memorial Institute medium Trichosporon asahii Trichophyton mentagrophytes 7

8 Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Monika Tichá Školitel: Mgr. Marcela Vejsová, PhD. ázev diplomové práce: Vyhodnocení aktivity potenciálně antifungálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody Cíl práce: Cílem této práce bylo zhodnotit aktivitu potenciálně antifungálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody. Testováno bylo 52 látek syntetizovaných na Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv (Mgr. Janďourek, Mgr. Semelková). Ve všech případech šlo o deriváty pyrazinu, sloučeniny byly rozděleny do šesti skupin. Byla zkoumána citlivost kmenů Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata, Trichosporon asahii, Aspergillus fumigatus, Absidia corymbifera, Trichophyton mentagrophytes. Metody: Byla použita mikrodiční bujónová metoda. Výsledky: Antifungální aktivitu projevilo 24 látek, MIC žádné z nich nebyla nižší než 62,5 µmol.l -1. ejcitlivějším kmenem byl Trichophyton mentagrophytes, naopak nejméně citlivým Candida albicans. ejvíce aktivní skupinou látek byly deriváty - benzylpyrazin-2-aminu. Závěry: Jako výhodné substituenty pro antifungální aktivitu se jevily alkyly s dlouhým uhlovodíkovým řetězcem. Pozitivní vliv měly rovněž atomy chloru, fluoru a trifluoromethyl na benzenovém jádře jako nejvýhodnější bylo vyhodnoceno navázání 2 atomů chloru v poloze 3,4. 8

9 Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Monika Tichá Supervisor: Mgr. Marcela Vejsová, PhD. Title of diploma thesis: Evaluation of activity of potentional antifungal substances through the use of microdilution broth method Background: The aim of this thesis was evaluation of activity of potentional antifungal substances through the use of microdilution broth method. Total of 52 substances were tested. Substances were synthetisized at Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control (Mgr. Jandourek, Mgr. Semelkova). All substances were pyrazine derivates, the substances were divided into six group. Sensitivity of the 8 strains was tested - Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata, Trichosporon asahii, Aspergillus fumigatus, Absidia corymbifera, Trichophyton mentagrophytes. Methods: Microdilution broth method was used. Results: Total of 24 substances displayed antifungal effect, the lowest MIC was 62,5 µmol.l -1. The most sensitive strain was Trichophyton mentagrophytes, the least sensitive was Candida albicans. Derivates of -benzylpyrazine-2-amine were the most active group of the substances. Conclusion: Alkyls with long hydrocarbon chain appeared to be profitable substituents for the antifungal activity. Chlorine, fluorine and trifluoromethyl benzene atoms had also shown positive influence. Binding 2 atoms of chlorine in position 3,4 was evaluated as the most advantageous. 9

10 Zadání diplomové práce cíl práce ázev práce: Vyhodnocení aktivity potenciálně antifungálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody ázev práce v anglickém jazyce: Evaluation of activity of potentional antifungal substances through the use of microdilution broth method Zásady pro vypracování: 1. Rešerše literatury 2. Zvládnutí mikrobiologických technik v mykologické laboratoři 3. Vypracování postupu vyhodnocení antifungální aktivity in vitro pomocí mikrodiluční bujónové metody 4. Vlastní experimenty 5. Zpracování výsledků 6. Vyhodnocení výsledků, jejich interpretace a diskuze s využitím teoretických a praktických znalostí dané problematiky 10

11 1. Úvod V posledních desetiletích se zvýšil počet houbových infekcí vzhledem k nárůstu jedinců nakažených virem HIV, pacientů, kteří podstoupili imunosupresivní léčbu jako přípravu na transplantaci orgánů a kostní dřeně nebo pacientů s rakovinou léčených cytotoxickými látkami. Candida albicans je nejčastějším patogenem, následována je dalšími druhy kandid (Candida glabrata, Candida tropicalis) a dalšími kvasinkami (např. Cryptococcus neoformans) a plísněmi (např. Aspergillus fumigatus, Microsporum canis). Tyto mikromycety jsou odpovědné za nejrůznější formy onemocnění od povrchových infekcí sliznic a kůže po život ohrožující systémové infekce. Léčba lidských chorob závisí na dostupnosti antimykotik (Sanglard et al., 2009). Zvýšená frekvence houbových infekcí spolu s vývojem rezistence mikromycet na současná antimykotika vyvolávají poptávku po nových antifungálních látkách. Tato práce se zabývá testováním potenciálně antifungálních látek a určení jejich minimální inhibiční koncentrace in vitro pomocí mikrodiluční bujónové metody na 8 kmenech hub. Tyto kmeny byly zvoleny proto, že jde o nejčastější původce mykotických infekcí v naší geografické oblasti. Celkem bylo otestováno 52 látek, syntetizovaných na Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv Farmaceutické fakulty v Hradci Králové, ve všech případech šlo o deriváty pyrazinu. Určení MIC je prvním krokem při vývoji nových antimykotik. Účinná látka se automaticky nerovná novému léčivu. Dále následuje rozsáhlé preklinické a klinické hodnocení bezpečnosti, kvality a účinnosti látky. 11

12 2. Teoretická část 2.1. becné vlastnosti hub Říše hub (Fungi) tvoří samostatnou říši. Pro houby mikroskopických rozměrů používáme označení mikromycety. Houby představují širokou a rozmanitou skupinu heterotrofních organismů. Jde o jednobuněčné i vícebuněčné eukaryota, většina z nich se vyskytuje v půdě a rozkládající se organické hmotě. Jejich buňka neobsahuje chlorofyl, nejsou tedy schopné fotosyntézy. Převážně jde o saprofyty, malé procento (asi 0,5 %) hub je adaptováno k parazitismu. Hlavním sterolem plazmatické membrány je ergosterol. Buněčná stěna většiny hub obsahuje chitin a další cukry, např. chitosan, mannany a glukany. Řada z nich je pro člověka prospěšná. Houby se využívají k výrobě léků, organických látek, potravin. Houby stopkovýtrusé (Basidiomycetes) vytvářejí nápadné plodnice a pěstují se ke konzumaci. ěkteré druhy však mohou způsobovat alimentární otravy (Votava et al., 2003; Buchta et al., 1998). Houby mohou být rozděleny do tří hlavních skupin: A) Plísně Plísně jsou vícebuněčné vláknité houby. Jejich základní stavební jednotkou je vlákno neboli hyfa. Hyfy mohou být rozděleny septy, u nižších hub toto členění obvykle chybí. Soubor hyf tvoří mycelium neboli podhoubí. Plísně se rozmnožují pomocí spor, které jsou výsledkem sexuálního procesu (zahrnuje meiózu, které předchází splynutí dvou haploidních buněk). Spory mohou vznikat i asexuálním procesem (zahrnuje pouze mitózu). Ty jsou označovány jako konidie. Houby mohou střídat pohlavní i nepohlavní rozmnožování. Skupina fungi imperfecti neboli deuteromycety označuje skupinu rodů, u nichž nebyla pohlavní stádia zatím objevena. B) Kvasinky Kvasinky jsou převážně jednobuněčné organismy. Jejich základní stavební jednotkou je blastospora, což je oválná nebo kulatá buňka. Většina kvasinek se množí asexuálním procesem nazývaným pučení buňka vytvoří výčnělek, který se zvětšuje a nakonec se oddělí od mateřské buňky. Pokud se dceřiné buňky protahují a neoddělují od mateřské buňky, hovoříme o tvorbě 12

13 pseudomycelia. ěkteré kvasinky mohou tvořit pravé mycelium. Malá skupina kvasinek se rozmnožuje dělením. C) Dimorfní houby Jde o skupinu hub, které jsou schopny růst ve formě vláknitého mycelia i ve formě kvasinek v závislosti na podmínkách prostředí (Votava et al., 2003; Greenwood et al., 2013). Existuje minimálně druhů hub, z nichž méně než 500 vyvolává infekce u lidí či zvířat. ěkteré houby, např. Histoplasma capsulatum vyvolávají infekce u všech exponovaných osob. Drtivá většina hub však patří mezi oportunní patogeny, obvykle nenapadají zdravý organismus a onemocnění vyvolávají jen u oslabených jedinců. ěkteré houbové infekce jsou rozšířeny po celém světě, jiné jsou endemické pro určitou geografickou oblast. Rovněž existují jedovaté druhy hub, které jsou po požití plodnic pro člověka toxické. ebezpečné jsou také sekundární metabolity hub, tzv. mykotoxiny, které se do těla dostávají po konzumaci potravin napadených houbami. Spory hub mohou vyvolat alergickou reakci (Greenwood et al., 2013). Ke kultivaci se využívá Sabouraudův agar s 2-4 % glukosy. Přidáním antibakteriálních látek se vyhneme růstu doprovodné bakteriální flóry obsažené v klinickém materiálu. Dále je možné obohatit agar cykloheximidem, který potlačuje růst nepatogenních plísní a thyminem, který podnítí růst a pigmentaci některých vláknitých hub. Při teplotě C lze spolehlivě kultivovat většinu mikromycet. U dimorfních hub je vhodná i kultivace při 22 C a 37 C. Biochemická aktivita je široká a často se využívá při identifikaci mikromycet, především u kvasinek. Mikromycety produkují řadu enzymů, např. elastázy, proteázy, lipázy (Votava et al., 2003). 13

14 2.2. Přehled hlavních taxonů hub Říše: Fungi houby ddělení: Chytridiomycota chytridiomycety Třída: Chytridiomycetes Řád: Chytridiales Řád: Spizellomycetales Řád: Blastocladiales Řád: Monoblepharidales ddělení: Eumycota vlastní houby Pododdělení: Zygomycotina Třída: Zygomycetes zygomycety Řád: Mucorales Řád: Endogonales Řád: Glomales Řád: Entomophthorales Řád: Zoopagales Řád: Dimargaritales Řád: Kickxellales Třída: Trichomycetes trichomycety Řád: Harpellales Řád: Asellariales Řád: Eccrinales Řád: Amoebidiales Pododdělení: Ascomycotina vřeckovýtrusé houby Třída: Hemiascomycetes Řád: Saccharomycetales Řád: Schizosaccharomycetales Řád: Protomycetales Řád: Taphrinales Třída: Ascomycetes Řád: Eurotiales Řád: nygenales Řád: Microascales 14

15 Řád: phiostomatales Řád: Elaphomycetales Řád: Laboulbeniales Řád: Erysiphales Řád: Pezizales Řád: Leotiales Řád: Rhytismatales Řád: Gyalectales Řád: stropales Řád: Caliciales Řád: Lecanorales Řád: Lichinales Řád: Hypocreales Řád: Phyllachorales Řád: Diaporthales Řád: Sordariales Řád: Xylariales Řád: Diatrypales Řád: Arthoniales Řád: Dothideales Řád: Pyrenulales Řád: Verrucariales Řád: Patellariales Řád: Meliolales Pomocné pododdělení: Deuteromycotina Pomocná třída: Blastomycetes Pomocná třída: Hyphomycetes Pomocná třída: Coelomycetes Pomocná třída: Agonomycetes Pododdělení: Basidiomycotina stopkovýtrusé houby Třída: Heterobasidiomycetes Řád: Uredinales Řád: Septobasidiales Řád: Atractiellales 15

16 Řád: Ustilaginales Řád: Exobasidiales Řád: Cryptobasidiales Řád: Graphiolales Řád: Tilletiales Řád: Filobasidiales Řád: Tremellales Řád: Auriculariales Řád: Tulasnellales Řád: Dacrymycetales Třída: Homobasidiomycetes Podtřída: Hymenomycetidae - houby rouškaté Řád: Aphyllophorales Řád: Cantharellales Řád: Polyporales Řád: Russulales Řád: Hymenochaetales Řád: Boletales Řád: Agaricales Řád: Hymenogastrales Řád: Thelephorales Podtřída: Gasteromycetidae houby břichatkovité Řád: Lycoperdales Řád: Geastrales Řád: Sclerodermatales Řád: Melanogastrales Řád: Gastrosporiales Řád: Gautieriales Řád: Tulostomatales Řád: idulariales Řád: Phallales (Váňa, 1996) 16

17 2.3. Antimykotika Antimykotika se využívají k léčbě infekcí vyvolaných houbami. Dle léčebného účinku dělíme antimykotika na dvě skupiny lokální a systémová. Dle chemického složení rozlišujeme 5 skupin polyeny, antimetabolity, azoly, echinokandiny a ostatní (Beneš, 2009). Výzkum antifungálních látek značně zaostává za výzkumem látek antibakteriálních (Buchta et al., 1998) Polyeny Polyeny jsou vysoce účinná antimykotika s širokým spektrem účinku, zároveň jde ale o poměrně toxické látky se závažnými nežádoucími účinky. Jejich mechanismus účinku spočívá ve vazbě na ergosterol, hlavní složku buněčné membrány, čímž zničí její celistvost a permeabilitu. Zároveň vyvolávají tvorbu volných kyslíkatých radikálů. Mezi polyenová antimykotika řadíme amphotericin B, nystatin a natamycin. Amphotericin B se podává při léčbě systémových a orgánových mykóz, natamycin a nystatin lze použít pouze pro lokální terapii (Buchta et al., 1998; Beneš, 2009; Votava, 2005) Antimetabolity Mezi antimetabolity v současnosti řadíme pouze jednoho zástupce a to flucytosin. Jde o fluorovaný derivát pyrimidinu. Aktivně proniká do buněk hub a teprve tam se přeměňuje na aktivní metabolity a blokuje proteosyntézu a syntézu DA. Má úzké spektrum účinku, používá se při léčbě kandidóz, kryptokokóz, částečně účinkuje na aspergily, často se používá v kombinaci s amphotericinem B. Rychle na něj vzniká sekundární rezistence (Beneš, 2009; Votava, 2005) Azoly Azoly dělíme na imidazoly a triazoly. Molekula starších imidazolů je tvořena dvěma atomy dusíku v pětičlenném kruhu. Triazoly jsou novější antimykotika a jejich molekula je charakterizována třemi atomy dusíku. Mají širší spektrum účinku a zároveň méně nežádoucích účinků, protože jejich působení je selektivnější. Azoly inhibují syntézu ergosterolu, což způsobí smrt buňky. K nežádoucím účinkům patří ovlivňování syntézy steroidních hormonů, jaterní poškození hrozí při léčbě vysokými dávkami především imidazolů. 17

18 Do této skupiny řadíme tyto přípravky: ketokonazol, flukonazol, intrakonazol, vorikonazol, posakonazol. K lokální aplikaci se používají klotrimazol, ekonazol, ketokonazol, bifonazol, oxikonazol a flutrimazol (Beneš, 2009) Echinokandiny V praxi se začaly používat až po roce Chemicky je řadíme mezi lipopeptidy. Inhibují enzym β-(1,3)-glukansyntetázu, což způsobí nedostatek glukanu v buněčné stěně buňky a následně lýzu buňky. Spektrum účinku je široké, neúčinkují však na kryptokoky a zygomycety. Mezi zástupce této skupiny řadíme kaspofungin, mikafungin a anidulafungin (Beneš, 2009) Allylaminy Využívají se pro terapii kožních a slizničních mykóz, mají nízkou toxicitu. Mechanismus účinku je založen na inhibici enzymu skvalenepoxidázy, což způsobí nedostatek ergosterolu a hromadění skvalenu. Jediným zástupcem registrovaným v ČR je terbinafin (Beneš, 2009) statní antimykotika Do této skupiny řadíme griseofulvin, který mění funkci intracelulárních mikrotubulů a tím zabraňuje tvorbě mitotického vřeténka. Mezi antimykotika pro topické použití řadíme amorolfin, ciklopiroxolamin či ciklopirox (Beneš, 2009). 18

19 2.4. Patologické stavy vyvolané houbami Mycetismy Mycetismus vzniká po požití plodnic vyšších toxických hub, většina jedovatých hub patří mezi stopkovýtrusé (Basidomycetes). ejčastější druhy vyvolávající otravy v naší oblasti jsou muchomůrky (zelená, tygrovaná, červená), závojenka olovová a hřib satan (Buchta et al., 1998). Rozlišujeme dvě skupiny toxinů: A) Cytotoxiny Cytotoxiny jsou méně nebezpečnou skupinou. ejvíce prozkoumaným cytotoxinem této skupiny je muskarin, který stimuluje parasympatikus. Je obsažen v muchomůrce červené a příznaky otravy se objevují již po několika minutách slzení, slinění, zvracení, neostré vidění, bolesti hlavy. Smrtelné otravy jsou minimální (Buchta et al., 1998). B) eurotoxiny Muchomůrka zelená obsahuje phallotoxiny, což jsou cyklické oktapeptidy, které způsobují potíže gastrointestinálního traktu a amanitotoxiny, které po chemické stránce řadíme mezi cyklické heptapeptidy způsobující nezvratné poškození somatických buněk inhibicí proteosyntézy (Buchta et al., 1998). Letální dávka je asi 50 g čerstvé plodnice. V České republice se ročně otráví houbařů, z nichž zemře 25 %. První symptomy otravy (zvracení, průjmy) se projeví po šesti až dvanácti hodinách, později dochází k poškození jaterních buněk a ledvinné nedostatečnosti. Bez léčby nebo po konzumaci větší dávky dochází ke smrti za 4 7 dnů (Dvořák, 2011) Mykotoxikózy Požití mykotoxinů způsobuje onemocnění nazývaná mykotoxikózy. Do těla se mykotoxiny obvykle dostávají kontaminovanou potravou. Akutní primární mykotoxikózy vznikají následkem požití velkých dávek mykotoxinů a mohou končit až smrtí, chronické primární mykotoxikózy jsou způsobeny požíváním menších či středně vysokých dávek a sekundární onemocnění jsou vyvolány dlouhodobým požíváním velmi nízkých dávek mykotoxinů. 19

20 Mykotoxiny jsou nízkomolekulární látky s různou chemickou strukturou poškozující lidský organismus. Jde o produkty sekundárního metabolismu hub. Zástupci rodů produkující nejvýznamnější mykotoxiny jsou Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Myrothecium, Penicillium, Phoma a Stachybotrys. Mykotoxiny představují riziko nejenom pro člověka, ale i pro zvířata a kulturní rostliny, čímž způsobují značné ekonomické škody (Votava et al., 2003) Účinky mykotoxinů Akutní a chronická toxicita se liší podle struktury toxinu, aflatoxiny jsou hepatotoxické, citrinin neurotoxický, citreoviridin kardiortoxický, další mykotoxiny mohou vyvolávat třes nebo zvracení. Cytotoxicita se projevuje zástavou mitózy a růstu buněk (aflatoxiny a cytochalaziny). Mykotoxiny mají rovněž imunosupresivní účinky (mykotoxiny produkované rodem Fusarium, aflatoxiny, ochratoxin A). Teratogenní účinky byly prokázány např. u aflatoxinu B, carininu, ochratoxinu A, mutagenní účinky má např. aflatoxin B, sterigmatocystin nebo versicolorin A (Votava et al., 2003) ejvýznamnější mykotoxiny ejvýznamnější mykotoxiny, jejich producenti a účinky jsou shrnuty v následující tabulce. Tabulka 1. ejvýznamnější mykotoxiny (Votava et al., 2003) Mykotoxin Producenti Účinky Aflatoxiny (B1, B2, G1, G2) Asperigillus flavus, Aspergillus parasiticus Sterigmatocystin rod Aspergillus (A. flavus, A, nidulellus, A. bipolaris, A. versicolor) chratoxin A Aspergillus ochraceus, A. marinus, A. ostianus, Penicillium chrysogenum, P. purpurescens apod. Citrinin Penicillium citrinum, P. canescens, P. expansum, P. implicatum, P. odoratum a další Trichoteceny Rody Cephalosporium, Cylindrocarpon, Fusarium, Myrothecium, Stachybotrys, 20 Hepatokarcinogení, mutagenní Poškozuje játra a ledviny, zároveň prokázány protirakovinné a antibiotické účinky eurotoxické, imunosupresivní, teratogenní, cytotoxické, karcinogenní eurotoxické, poškozuje metabolismus jater, karcinogenní, mutagenní Inhibice proteosyntézy vyšších živočichů

21 Patulin Kyselina penicilová Kyseliny mykofenolová Zearalenon Cytochalaziny Trichoderma, Trichothecium Rody Aspergillus, Byssochlamys, Paecilomyces, Penicillium Rody Aspergillus, Paeclomyces, Penicillium Penicillium stolonifer, P. roqueforti, P. viridicatum Rod Fusarium, kontaminuje hlavně obilniny Rody Metarhizium, Zygosporum Rubrotoxiny Penicillium rubrum, P. purpurogenum Antrachinony Penicillium islandicum, rody Aspergillus, Cladosporium, Phoma a další Antibiotický a antimykotický efekt, zároveň ale cytotoxicita, karcinogenita a antimitotický účinek proti savčím buňkám Protinádorový, protibakteriální, protivirový, na druhé straně účinek cytotoxický Inhibuje syntézu purinů de novo, mutagenní a protinádorová aktivita Anabolické účinky (podpora růstu dobytka), antibakteriální a mutagenní účinky egativní vliv na buněčné dělení, fagocytózu, tvorbu mikrofibril a mikrotubulů Interferencí s adenosyltrifosfatasou mohou způsobit škodlivé změny v permeabilitě buněčné membrány Cytotoxické, hepatotoxické, karcinogenní, mutagenní Mykoalergie Výskyt alergie na plísně v populaci se pohybuje od 2 do 18 %. Alergii může vyvolat více než 80 rodů hub. Jde o hypersensitivní reakci imunitního systému na antigen houbový alergen, nejčastěji se vyskytující se na sporách. K nejvýznamnějším plísním vyskytujících se v budovách patří rody Aspergillus, Penicillium, Alternaria a Cladosporium, mezi venkovní plísně významné v našich podmínkách řadíme rody Cladosporium a Alternaria. Rozhodujícím faktorem pro rozvoj mykoalergie je množství spor ve vzduchu. Počet spor ovlivňuje střídání dne a noci, proudění vzduchu, počasí, roční období, lokalita. Rozlišujeme čtyři skupiny mykoalergií: alergická rýma a astma, chronická bronchitida, extrinzní alergická alveolitida (hypersenzitivní pneumonie) a syndrom toxického prachu organického původu (Kalhotka, 2014) Mykózy Mykotická onemocnění jsou vyvolaná mikromycetami. Do těla se houbová infekce dostává inhalací houby, většinou vdechnutím konidií, kontaktem s nakaženým 21

22 člověkem nebo s nosičem, prostřednictvím infikovaných předmětů nebo poraněním a narušením kůže a sliznice, což jsou přirozené ochranné bariéry (Buchta et al. 1998). Mykózy můžeme dělit podle místa infekce na povrchové (superficiální), kožní (kutánní), podkožní (subkutánní) a hluboké (orgánové). Podle rozsahu infekce rozeznáváme mykózy lokalizované, kdy je postižen jeden orgán nebo určitá anatomická lokalita a infekce systémové (diseminované), kdy jsou zasaženy dva a více orgánů (Buchta et al., 1998) Dermtofytózy Dermatofytózy jsou kožní mykózy vyvoláné keratinofilními houbami, které jsou schopny využívat keratin. Zasaženy plísněmi jsou vlasy, nehty, stratum corneum. Původci jsou druhy rodu Epidermophyton, Microsporum a Trichophyton. ěkteré druhy jsou rozšířeny celosvětově, jiné se vyskytují pouze v určitých geografických oblastech. Rozlišujeme dermatofytózy zoofilní, antropofilní a geofilní, podle toho, zda je zdrojem nákazy zvíře, člověk nebo půda. Tímto onemocněním je postiženo asi % lidské populace, nejčastěji postiženou anatomickou lokalitou jsou nohy, třísla, nehty a kštice. Rizikovými faktory pro rozvoj nemoci je nošení nevětrané, uzavřené obuvi, kontakt s kontaminovanými předměty a infikovanými pacienty. Klinickými příznaky jsou značně se lišící léze v závislosti na místě infekce a druhu houby. ěkdy se vyskytují pouze suchá místa, většinou se však objevuje podráždění, otok a puchýřky. Při zasažení nehtů se nehty stávají bezbarvé, ztenčené a drolí se (Greenwood, 2013; Buchta et al., 1998; Beneš, 2009) Pityriasis versicolor Pityriasis versicolor je povrchová infekce kůže, vyvolaná mikromycetou Malasseziafurfur, což je lipofilní kvasinka přirozené kožní mikroflóry. Infekce je charakteristická bílými až světle hnědými skvrnami na horních částích trupu, končetin a na krku. Skvrny nesvědí a ve většině případů jsou nezánětlivé (Buchta el al., 1998; Beneš, 2009) Kryptokokóza Kryptokokóza je nejčastěji vyvolána kvasinkou Cryptococcus neoformans, vzácně druhem C. gatii. Kryptokoky se často vyskytují v ptačím trusu divokých i domácích ptáků. Sporadicky se vyskytuje po celém světě, nejčastěji jsou jí postiženi pacienti s AIDS. Schopnost tvořit pouzdra, růst při teplotě 37 C a vyšší a schopnost tvořit 22

23 melanin jsou hlavními faktory patogenity. Primárně zasahuje plíce, plicní kryptokokóza nemá jasný klinický obraz, může probíhat i asymptomaticky, často probíhá chronicky. Kryptokoková meningitida má rovněž většinou chronický průběh a projevuje se bolestmi hlavy, horečkou, případně poruchou vědomí. Mimo postižení plic a centrální nervové soustavy může kryptokokóza zasáhnout oko, kůži nebo vnitřní orgány (Greenwood, 2013; Beneš, 2009) Kandidové infekce Kandidové infekce lze rozdělit na povrchové, při kterých je postižena kůže, nehty a sliznice úst a vagíny a na systémové s orgánovými manifestacemi. Původcem onemocnění je rod Candida, nejčastějším druhem je C. albicans, dále C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr, C. guilliermondii a další. Vyskytují se v půdě, zvířatech, potravinách, na neživých předmětech, v malém počtu jsou součástí přirozené mikroflóry člověka (především GIT a kůže) u asi 20 % populace. Míra osídlení má tendenci se zvyšovat s věkem, ve vagíně je vyšší během těhotenství. K infekci dochází při přerůstání kvasinky, čímž dojde ke změnám v běžné mikrobiální flóře, nebo při nižší odolnosti pacienta k infekci. Ve většině případů jde o endogenní infekci, méně často se objevuje přenos z člověka na člověka. slabení a imunokompromitovaní jedinci, např. pacienti s diabetes mellitus, nakažení HIV nebo pacienti po transplantaci kmenových buněk jsou ke vzniku infekce náchylnější (Greenwood, 2013; Beneš, 2009). Slizniční a kožní formy rofaryngeální kandidóza se nejčastěji objevuje v raném dětství nebo naopak ve stáří, ohroženi jsou pacienti infikovaní HIV nebo léčení širokospektrálními antibiotiky. ejčastější formou je soor, kdy se na bukání sliznici objevují mapovité, bělavé povlaky, které lze snadno setřít. Pokud nejsou léčeny, šíří se do orofaryngeální oblasti. Rozsáhlý nález nebo rozšíření do jícnu způsobuje potíže s příjmem potravy (Beneš, 2009). Kandidová ezofagitida může vznikat jak samostatně, tak propagací orofaryngeální kandidózy, zejména u osob postižených HIV nebo u pacientů s agresivní léčbou hematologických malignit. Projevuje se odynofagií, retrosternální bolestí a horečkou, může se objevovat zvracení a hubnutí. Charakteristický je endoskopický obraz bílých plaků (Beneš, 2009). 23

24 Kandidová vaginitida se nejčastěji vyskytuje u těhotných, diabetiček a u pacientek léčených širokospektrálními antibiotiky. Asi % žen onemocní touto infekcí alespoň jednou v životě. Infekce se projevuje pruritem, palením vulvy, dysurií, tvarohovým výtokem, erytémem a otokem vulvy (Beneš, 2009). Infekce kůže a nehtů vyvolaná kandidami jsou méně časté než dermatofytózy. Léze vznikají na teplých místech (Greenwood, 2013). Kandidová paronychie je častá u diabetiků. Kolem nehtů a mezi prsty rukou se vyskytují ostře ohraničená červená ložiska. Kandidová onychomykóza zasahuje nehty. Plenková kandidová dermatitida je častá u kojenců perianálně a perigenitálně. Kandidová balanitida se projevuje ostře ohraničenými červenými ložisky na žaludu a vnitřním listu předkožky, většinou s bělavými povlaky. Ložiska svědí a pálí (Beneš, 2009). Systémové a orgánové formy Jsou problémem především u pacientů s neutropenií, u pacientů po transplantaci kmenových buněk a jater a pacientů hospitalizovaných na jednotce intenzivní péče. Rizikovými faktory pro vznik infekce je nízká porodní váha, užívání širokospektrálních antibiotik, hemodialýza, imunosuprese. Infekce může být lokalizovaná v kterékoliv části těla, např. v močových cestách, játrech, srdci, mozkových blánách. Může se rozvinout v diseminovanou kandidózu a sepsi. Infekce se může projevovat horečkou, exantémem, retinálními infiltráty na očním fundu a různými orgánově specifickými příznaky (Greenwood, 2013) Aspergilóza Aspergilóza je vyvolaná všeobecně rozšířeným rodem Aspergillus, který se vyskytuje v půdě, ve vzduchu, ve vodě, v prachu i v potravinách. ejvýznamnějšími druhy vyvolávající lidské infekce jsou A. fumigatus, A. flavus, A. terreus, A. niger a A. nidulans. K nákaze dochází po inhalaci konidií aspergila. ejbouřlivěji onemocnění probíhá u imunokompromitovaných pacientů, u kterých se může vyvinout v život ohrožující infekci plic a dutin, následuje diseminace do ostatních orgánů. Spory mohou vyvolat i alergie. Aspergily jsou pro člověka nebezpečné také produkcí mykotoxinů (Greenwood, 2013; Beneš, 2009). Invazivní aspergilóza Tato forma se objevuje u imunodeficientních pacientů, často u osob s prolongovanou neutropenií. V 70 % jsou postiženy plíce, velmi častá je hematogenní 24

25 diseminace s postižením centrálního nervového systému, kůže a jiných orgánů. Prognóza není příznivá (Greenwood, 2013). Aspergilom Houba kolonizuje již existující dutiny v plicích a vytváří kulatý útvar z mycelia. nemocnění je nejčastěji asymptomatické nebo se objevuje mírný kašel a produkce sputa, příležitostně se projevuje hemoptýzou. ejčastějším řešením je chirurgické odstranění útvaru (Greenwood, 2013). Sinusitida Aspergily mohou kolonizovat vedlejší nosní dutiny. Infekce se může rozšířit do očnice a do mozku. Rozlišujeme akutní a chronickou sinusitidu (Greenwood, 2013). Alergická bronchopulmonární aspergilóza Aspergily kolonizují preformované dutiny dýchacích cest a mohou u pacientů vyvolat alergickou reakci na mykotické antigeny. Projevuje se astmatickými záchvaty. Dochází ke vzniku plicních infiltrátů, zvyšuje se množství eozinofilů a hladina IgE (Beneš, 2009) Zygomykóza Je známá také pod názvem mukormykóza. Jde o relativně vzácné onemocnění vyvolávané zástupci řádu Mucorales, např. Rhizomucor, Rhizopus, Absida, Mucor. Jde o všudypřítomné houby vyskytující se především v půdě a rozkládajícím se organickém materiálu. Infekce vzniká nejčastěji po inhalaci spor, vzácně po poranění kůže. hroženi jsou hlavně pacienti s neutropenií, diabetes mellitus (zejména v ketoacidóze), leukémií nebo lymfomem. ejznámější formou je rhinocerebralní mukormykóza, při které dochází k rychlé a rozsáhlé destrukci tkáně. ejčastěji vzniká v nosní sliznici a šíří se do vedlejších nosních dutin, očnice a mozku. eléčené stavy bývají fatální, během posledních let se však prognóza zlepšila. Známá je také plicní mukormykóza, kutánní, gastrointestinální a diseminovaná forma (Greenwood, 2013; Buchta et al., 1998; Beneš, 2009) Pneumocystóza Pneumocystózu vyvolává oportunní patogen Pneumocystis jiroveci, který byl původně zařazen mezi prvoky. Člověk se infikuje pravděpodobně inhalací nebo kontaktem s nakaženým. Většina infikovaných nemá žádné příznaky a k rozvoji infekce 25

26 dochází až po zhoršení funkce buněčné imunity. Pneumocystóza se vyskytuje u imunualterovaných a oslabených jedinců. nemocnění probíhá jako atypická pneumonie s nespecifickými příznaky. bvykle se objevuje horečka, neproduktivní kašel, dušnost. Z plic se pneumocystóza se může rozšířit do lymfatických uzlin, jater, sleziny, kostní dřeně, střeva. Extrapulmonární formy jsou mimořádně vzácné (Greenwood, 2013; Buchta et al., 1998; Beneš, 2009). 26

27 2.5. Charakteristika testovaných kmenů Candida albicans Je nejvíce patogenním druhem kandid. Může tvořit oválné blastospory o průměru 3-6 µm, pseudohyfy, které vznikají pučením dceřiných buněk a které zůstávají spojeny s buňkou mateřskou, hyfy, kulaté chlamydospory větší než blastospory i zárodečné klíčky, což jsou tenké trubičkovité útvary pučící z blastospor bez zaškrcení v místě, kde opouštějí mateřskou buňku. Barví se grampozitivně. a agaru se kultivuje 24 hodin, roste v drobných koloniích, na kterých se později vytvářejí kratičké výběžky a voní po chlebu. Kolonie rostoucí 1 den na Sabouraudově agaru se 2 % glukózy nebo maltózy jsou velké 1 mm, neprůhledné, krémově zbarvené. Využívá glukózu, je rezistentní vůči nižšímu ph. Za faktor virulence je považovaná schopnost klíčení ve tkáních, tvoření proteáz, schopnost měnit povrchové struktury. Rizikové faktory pro vznik onemocnění jsou například věk, podávání širokospektrálních antibiotik, hormonální změny (např. v těhotenství), dlouhodobé zavedení kanyl a katétrů. Přirozeně se v malém množství vyskytují v pochvě a zažívacím traktu. ejčastější kandidózou je moučnivka, druhou nejčastější je vaginální kandidóza. Časté je perianální postižení kůže a kvasná dyspepsie. C. albicans způsobuje rovněž infekci nehtů. Mezi systémové kandidózy řadíme cystitidu, pyelonefritidu, meningitidu či endokarditidu, jsou však vzácné. K lokální léčbě se nejčastěji užívají imidazoly (klotrimazol, bifonazol), k léčbě systémové kandidózy se využívají triazolové deriváty (flukonazol, itrakonazol) a amfotericin B. K diagnostice se využívá mikroskopie a kultivace, výhodné je použití chromogenních agarů (Votava et al., 2003). br. 1. Candida albicans, makroskopický vzhled CHRMagar 27

28 br. 2. Candida albicans, mikroskopický obraz Zdroj obrázků Leading international fungal education Candida tropicalis Buňky jsou kulovité nebo mírně oválné, mezi nimi jsou i buňky cylindrické a protáhnuté. Vytváří pseudomycelium, pravé mycelium vytváří zřídka. Kolonie jsou měkké, krémovité, hladké i kučeravé. Blastospory jsou seřazeny v krátkých řetízcích nebo se vyskytují jednotlivě. d C. albicans se odlišuje tím, že C. tropicalis netvoří chlamydospory a zkvašuje sacharózu, i když existují izoláty, které tuto schopnost nemají. Jde o všeobecný komenzál vyskytující se v ústech, v trávícím ústrojí, plicích, vagíně a na pokožce. Candida tropicalis způsobuje asi čtvrtinu případů systémových kandidóz. Vyvolává infekci střev a respiračního traktu a kolpitidu (Kalhotka, 2014; Votava et al., 2003) br. 3. Candida tropicalis, makroskopický vzhled - CHRMagar 28

29 br. 4. Candida tropicalis, mikroskopický obraz Zdroj obrázků Leading international fungal education Candida krusei Candida krusei je významným patogenem u pacientů s hematologickými malignitami a u pacientů po transplantaci kostní dřeně a po krevní transfúzi. Je primárně rezistentní k flukonazolu. Blastospory jsou elipsoidního až válcovitého tvaru. Snadno vytváří pseudomycelium s protáhlými konidiemi. Kolonie jsou matné a zploštělé, v barvě šedo-béžové. Charakteristicky voní po acetonu. Často kontaminuje potraviny jako je zelená kapusta, víno a lisované pekařské droždí (Jílek et al., 2002; Pfaller et al., 2007; Kocková-Kratochvílová a ndrušová, web Miniatlas mikroorganismů). br. 5. Candida krusei, makroskopický vzhled CHRMagar 29

30 br. 6. Candida krusei, mikroskopický obraz Zdroj obrázků Leading international fungal education Candida glabrata Do nedávna byla Candida glabrata považována za nepatogenní druh přirozené mikroflóry člověka. S hojnějším používáním imunosupresiv a širokospektrálních antibiotik se však množství infekcí vyvolaných tímto druhem významně zvýšilo. yní je Candida glabrata považována za druhého nebo třetího (v závislosti na typu infekce) nejčastějšího původce kandidóz. Vytváří blastospory o velikosti 1-4 µm. a Sabouradově agaru s glukózou vytváří lesklé, mírně vyklenuté, hladké kolonie bělavé až krémové barvy. Má haploidní genom. Typická je časná sekundární rezistence k flukonazolu (Votava et al., 2003; Jílek et al., 2002; Fidel et al., 1991). br. 7. Candida glabrata, makroskopický vzhled CHRMagar Zdroj obrázků Leading international fungal education

31 br. 8. Candida glabrata, mikroskopický obraz Zdroj obrázku Wikipedia Trichosporon asahii Trichosporon je rod řazený mezi kvasinkové mikroorganismy. Kolonie jsou bílé až béžové barvy. Povrch kolonií je semišový s radiálními rýhami a nepravidelnými záhyby. Tvoří hyalinní, článkované hyfy. Arthrokonidie mají tvar barelu. Trichosporon asahii zapříčiňuje bílou piedru v tropech a subtropech, v mírném pásu postihuje nehty a kůži a může působit jako původce disseminovaných infekcí imunodeficitních pacientů (Votava et al., 2003; Klaban, 2011; Mycology online). br. 9. Trichosporon asahii, makroskopický vzhled 31

32 br. 10. Trichosporon asahii, mikroskopický obraz Zdroj obrázků Mycology online Aspergillus fumigatus Kolonie jsou zrnité či vatovité, často mívají světlý okraj. Povrch bývá pigmentován do různých odstínů zelené. Rychle rostou. Konidie jsou uspořádány do řetízků, mají elipsoidní až kulovitý tvar, jsou jemně bradavičité. Řetízky konidií vyrůstají z fialid na horní polovině hlavice a směřují jedním směrem, takže připomínají sčesanou hlavu. Mycelium je hyalinní, hyfy se větví v ostrém úhlu. Je významným producentem mykotoxinů a významným oportunním patogenem, vyvolává např. invazivní plicní aspergilózu u hematoonkologických pacientů. Při léčbě se využívá vorikonazol nebo amfotericin B (Votava et al., 2003; Votava et al., 2010). br. 11. Aspergillus fumigatus, makroskopický vzhled 32

33 br. 12. Aspergillus fumigatus, mikroskopický obraz Zdroj obrázků Fungi myspecies Absidia corymbifera Vytváří bílé, později šedé kolonie. Je termofilní a termotolerantní může růst v rozmezí teplot C. Větvené sporangiofory vycházejí z vrcholků stolonů. Stolony jsou k podkladu připevněny malými rhizoidy. Kolumela je polokulovitá s velkou apofýzou, spory jsou oválné. ení častým původcem infekcí, obvykle figuruje pouze jako kontaminant klinického materiálu. Přesto může způsobovat mykotické infekce dýchacích orgánů i záněty ucha. Patogenní je i pro zvířata (Klaban, 2011; Votava et al., 2010). br. 13. Absidia corymbifera, makroskopický vzhled Zdroj obrázku Fun with mikrobiology

34 br. 14. Absidia corymbifera, mikroskopický obraz Zdroj obrázku Mycology online Trichophyton mentagrophytes Jde o běžného dermatofyta. Je jedním z hlavních původců povrchových mykóz. Vlákna jsou větvená a septovaná, s velkým počtem mikrokonidií, makrokonidie mají doutníkový tvar. Jde o zoofilní, rychle rostoucí (1-2 týdny) druh. Rozlišujeme 2 poddruhy T. mentagrophytes var. granulosum (vytváří kolonie s okrovou spodinou) a T. mentagrophytes var. mentagrophytes (jeho kolonie jsou bělavé až nažloutlé, jemně granulované a vláknité. Ke kultivaci se většinou používá Sabouraudův glukózový agar, často obohacený thiaminem (Votava et al., 2003; Votava et al., 2010). br. 15. Trichophyton mentagrophytes, makroskopický vzhled Zdroj obrázku Wikipedia

35 br. 16. Trichophyton mentagrophytes, mikroskopický obraz Zdroj Mycology online - s.html 35

36 2.6. Laboratorní metody v mykologii Důležitou zásadou při práci v mykologické laboratoři je omezení pohybu vzduchu v místnosti z důvodu snížení rizika vzniku inhalační laboratorní nákazy. Samozřejmostí je opatrnost při manipulaci s kulturami mikromycet. Za etiologické agens lze stoprocentně považovat jen ty kmeny, které byly od stejného pacienta izolovány opakovaně. K vyšetření se používají nejrůznější druhy materiálu sputum, krev, hnis, punktáty, šupiny kůže, vlasy, nehty, výtěry na tampónech (Votava et al., 2000) Mikroskopické vyšetření Výhodou je především to, že jde o levnou, jednoduchou a rychlou metodu, která umožňuje rozlišit, zda se jedná o mykózu, případně stanovit předběžnou diagnózu, na jejímž základě může být zahájena terapie. Louhové preparáty Využívají se k přípravě preparátů z částeček šupin, kůže, nehtů nebo chlupů. Materiál na podložním sklíčku se zakápne 10-40% draselným louhem, přikryje krycím sklíčkem a louh se nechá minut působit. Dojde k projasnění preparátu, které umožní rozeznání struktur mikromycet. Preparáty s inkoustem Parker Mají stejnou úlohu jako preparáty louhové. Používá se inkoustové barvivo, díky kterému lze snadněji odlišit probarvené mykotické elementy a artefakty. Preparáty s Lugolovým roztokem Připravují se smícháním materiálu (především tekutého sputum, punktáty, mozkomíšní mok) s Lugolovým roztokem v poměru 1:1 na podložním sklíčku. Jsou vhodné zejména pro průkaz rychle rostoucích vláknitých hub. Bakteriologické a histologické barvící techniky Barvení podle Grama (kvasinky se barví grampozitivně) nebo Giemsy je výhodné především k odlišení kvasinek v tekutém materiálu. K barvení lze použít i Schiffovo činidlo, hematoxylin nebo stříbření podle Grocotta. Fluorescenční metoda s Ryluxem nebo Blancophorem Tyto fluorescenční látky, které se specificky vážou na chitin ve stěně mikromycet lze použít k vyšetření různých druhů materiálu šupiny kůže, nehtů, vlasů, nátěrů na skle. Barvící roztok je složený z 1 g Ryluxu (nebo 0,1 g Blancophoru), 100 ml 2% 36

37 vodného roztoku ah a 10 ml diethylsulfoxidu. Po patnácti minutách je materiál prohlížen ve fluorescenčním mikroskopu v modrém světle přes oranžový filtr. Stěny blastospor nebo mykotických vláken pak září žlutozeleně na tmavém pozadí (Votava et al., 2000) Kultivační metody Výhodné je vytvořit sestavu více druhů kultivačních médií, neboť platí pravidlo, že čím více je naočkovaných půd, tím je vyšší šance záchytu původce infekce. Důležité je zamezit přerůstání kultur bakteriemi, které se mohou ve vyšetřovaném materiálu vyskytovat. Toho lze dosáhnout přidáním antibakteriálních látek do kultivačního média, často se používá chloramfenikol či kombinace chloramfenikolu s gentamycinem nebo penicilinu se streptomycinem. Pokud ani to není dostačující, volí se kombinace amikacinu a vankomycinu. Základní diagnostickou půdou je Sabouraudův agar s 2-4 % glukózy a antibiotiky. V některých případech očkujeme i na krevní agar a další speciální média. Pro odlišení druhů kandid je vhodné kultivovat na chromogenní agar, kde kolonie jednotlivých druhů rostou odlišně barevně. Czapek-Doxův agar je vhodný pro určení plísní z rodů Aspergillus, Penicillium, Scopulariopsis a dalších. a tomto médiu snadno vytváří spory a vytváří typické pigmenty. Primokultivace kožních vzorků v případě podezření na dermatofyty probíhá ve zkumavkách s šikmo nalitým agarem, který vysychá pomaleji než agar nalitý v Petriho miskách. Tím se vyhneme vysychání kultur při dlouhodobé kultivaci (Votava et al., 2010; Jílek et al., 2002; Votava et al., 2000) Biochemické metody Dusíkaté a cukrové auxanogramy a zymogramy využívají k určení mikromycet jejich biochemickou aktivitu. Auxanogramy testují asimilaci, to znamená, že sledují využívání dusíkatých a cukerných látek k růstu jako zdrojů uhlíku. Provádí se na agarových plotnách přelitých suspenzí testovaného kmene, na ně se aplikuje cukr ve formě napuštěného papírového disku nebo tablety. Pokud jsou houby schopné látku asimilovat, objeví se kolem disku (tablety) růst. Zastoupení utilizovaných cukrů je pro jednotlivé druhy kvasinek charakteristické (odečítáme dle interpretačních tabulek). Zymogram neboli test fermentace cukrů se provádí ve zkumavkách nebo mikrotitračních destičkách. Jednotlivé zkumavky/jamky obsahující lyofylizovaný cukr a acidobazický indikátor zakápneme suspenzí vyšetřovaného kmene kvasinky a 37

38 zakápneme parafínovým olejem, abychom zajistili anaerobní prostředí. V případě fermentace daného cukru, změní půda v dané zkumavce/jamce barvu. Zastoupení fermentovaných cukrů je pro jednotlivé druhy kvasinek charakteristické (Jílek et al., 2002; Votava et al., 2000) Průkaz antigenů a protilátek Využívají se imunologické metody jako je ELISA, aglutinace, vazba na komplement, dvojitá imunodifúze, imunoelektroforéza, kožní testy pro průkaz alergie u dermatofytů. Jako nepřímé metody označujeme průkaz protilátek, jako přímé průkaz houbových antigenů jako je např. galaktomannan, mannan nebo β-d-glukan) (Kalhotka, 2014; Votava et al., 2010) Molekulárně-biologické metody Molekulárně-biologické metody dokážou houbu zachytit, případně identifikovat na základě její sekvence DA. Tyto metody mají vysokou citlivost, jejich nevýhodou je však vysoká cena. ejčastěji se používá polymerázová řetězová reakce, sekvenování DA a fluorescenční in situ hybridizace (Votava et al., 2010) MALDI-TF MS The matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spektrometry, česky hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem, je rychlý, přesný, a nákladově efektivní způsob mikrobiální charakterizace a identifikace na úrovni rodů a druhů. Je to metoda, pomocí které lze identifikovat druh houby během několika minut z kolonie narostlé na agarové plotně. Metoda je založena na ionizaci vzorku laserovým paprskem, urychlené ionty vstupují do analyzátoru doby letu TF, kde jsou rozděleny na základě poměru hmotnosti a náboje. Výsledkem je vznik hmotnostního spektra, charakteristického pro daný rod/druh (Kačalová, 2011) Hodnocení účinnosti antimykotik Diskový difúzní test Je kvalitativním testem, jeho hodnota je orientační. Vhodnou testovací půdou je Mueller-Hintonové agar se 2 % glukosy a 0,5 g/l methylenové modři. Plotnu přelijeme inokulem testovaného kmenu o hustotě 0,5 stupně McFarlanda nebo ji naočkujeme 38

39 tampónem. a misku položíme papírové disky napuštěné antimykotikem o definované koncentraci. Inkubujeme 24 h při 35 C. ásledně odečítáme posuvným měřítkem průměry vytvořených inhibičních zón. Pokud je průměr zóny větší nebo stejný než průměr zóny referenčního citlivého kmene, je mikrob hodnocen jako citlivý k danému antimykotiku. Hodnotí se 80 % inhibice, to znamená, že za citlivý kmen považujeme i případ, kdy jsou uvnitř zóny přítomny kolonie, ale jen drobné a v menším počtu než vně zóny (o 80 %) (Votava et al., 2010; Votava et al., 2000) Diluční metody Pomocí dilučních metod lze určit MIC minimální inhibiční koncentraci, což je nejnižší koncentrace antimykotické látky, která ještě zastaví růst houby. Jde tedy o kvantitativní metody. Rozlišujeme agarovou diluční metodu a metodu bujónovou mikrodiluční. Agarová diluční metoda je standardizovaná a využívá se k hodnocení účinnosti nových antimykotických látek. Lze snadno odhadnout kontaminaci nebo přítomnost smíšených kultur. a druhou stranu jde o metodu drahou a pracnou. bvykle se testuje koncentrací jedné látky, je tedy nutno připravit agarů s různou koncentrací antimykotika (ředící řada). a plotnu s danou koncentrací antimykotika naočkujeme inokulum vyšetřovaného kmene a po kultivaci sledujeme zástavu růstu. Mikrodiluční bujónová metoda se provádí v mikrotitračních destičkách. Jamky obsahují testovanou látku v ředící (obvykle dvojkové) řadě v médiu. Do jamek očkujeme inokulum vyšetřovaného kmene, kultivujeme a druhý den odečítáme MIC jamku s nejnižší koncentrací, ve které došlo k 80% zástavě růstu houby (Votava et. al, 2000; Votava et al., 2010) E-test E-test je komerční metoda využívající papírový proužek napuštěný antimykotikem, koncentrace antimykotika se zvyšuje od jednoho konce k druhému a na agaru tvoří koncentrační gradient. Tento proužek položíme na plotnu naočkovanou houbou a sledujeme vznik inhibiční zóny, která má vejčitý tvar. Hodnotu MIC odečítáme na proužku v místě, kde okraj inhibiční zóny protíná proužek (Votava et al., 2010; Votava et al., 2000). 39

40 3. Experimentální část Testování látek mikrodiluční bujónová metoda 3.1. Pomůcky Sterilní mikrotitrační destičky s víčky, mikropipety, sterilní špičky, dvanáctijamkový rezervoár na médium, sterilní zkumavky, stojánky na zkumavky, očkovací kličky, Bürkerovy komůrky 3.2. Přístroje Laminární box, ESC clas II, type AV Termostat, Binder Mikroskop, lympus Vortex, JS MS 2 minishaker 3.3. Chemikálie RPMI 1640 MPS 3-(-morfolino)propansulfanová kyselina Glukóza DMS dimethylsufoxid ah Sterilní voda Testované látky Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Dodavatelem chemikálií je SIGMA-Aldrich Testovací kmeny kvasinek a vláknitých hub a jejich zkratky Candida albicans CA ATCC Candida tropicalis CT 156 Candida krusei CK E28 Candida glabrata CG 20/I Trichosporon asahii TA 1188 Aspergillus fumigatus AF 231 Absidia corymbifera AC 272 Trichophyton mentagrophytes TM

41 3.5. Postup Příprava růstového média K 4 dílům MPS s 2 % glukózy přidáme 1 díl RPMI Celkový objem připravujeme podle předpokládané spotřeby. Přidáním několika kapek ah změníme ph do rozmezí 6,5 7, Příprava suspenzí testovaných kmenů hub Do 8 sterilních zkumavek popsaných zkratkami testovaných kmenů napipetujeme 3 ml sterilní vody. Ve zkumavce se sterilní vodou resuspendujeme část kolonie kvasinek nebo vláknitých hub narostlých na Sabouraudově glukózovém agaru, rozmícháme na vortexu a 12 µl suspenze napipetujeme do Bürkerovy komůrky. Určíme počet buněk na 100 čtverců při zvětšení 200x. Vhodná hustota inokula kvasinek je 1,0 2,5 x 10 5 cfu/ml. To odpovídá cfu/50 čtverců při kontrole v Bürkerově komůrce. Vhodná hustota inokula vláknitých hub je asi 100 buněk na 100 čtverců. Takto připravená inokula můžeme uchovávat v lednici asi týden Příprava ředící řady testované látky avážku rozpustíme v objemu DMS, který vypočítáme podle vzorce níže a promícháme na vortexu. V(DMS) = m 10 6 (převod na µl) c M 100 (zakoncentrování) m..navážka (g) c..1. testovaná koncentrace = 500 µmol.l -1 = 0,0005 mol.l -1 M..molární hmotnost Aby 1. testovaná koncentrace byla 500 µmol.l -1, musíme připravit látku 100x koncentrovanější. (K 1,98 ml růstového média v jamce přidáváme jen 20 µl (1 %) látky rozpuštěné v DMS, protože koncentrace DMS v jamce nesmí přesáhnout 1 %.) Pokud se látka nerozpustí nebo se vysráží, přidáme 2., případně 3. ekvivalent DMS. Tím se posouvá 1. testovaná koncentrace o 1 ředění. (Po přidání 2. ekvivalentu rozpouštědla je 1. testovaná koncentrace 250 µmol.l -1.) Do sterilní zkumavky označené 1 napipetujeme 1,98 ml růstového média a 20 µl rozpuštěné testované látky a promícháme na vortexu. Pokud se látka v růstovém médiu vysrážela, přidáme 2., případně 3. ekvivalent růstového média. (Po přidání 2. 41

42 ekvivalentu rozpouštědla je 1. testovaná koncentrace 250 µmol.l -1 ). Takto získaný pracovní roztok 1. testované koncentrace přemístíme do 1. jamky dvanáctijamkového rezervoáru. Do 10 sterilních zkumavek označených 2-11 napipeujeme 0,3 ml DMS, do zkumavky označené 2 přidáme 0,3 ml látky rozpuštěné v DMS, promícháme a 0,3 ml přeneseme do zkumavky označené 3, promícháme a 0,3 ml přeneseme do zkumavky označené 4. Takto pokračujeme až po zkumavku 11. Do jamek 2 12 dvanáctijamkového rezervoáru napipetujeme 1,98 ml růstového média. Do jamky 2 přidáme 20 µl naředěné testované látky ze zkumavky 2. Takto pokračujeme po jamku 11 (do jamky 3 přidáme 20 µl ze zkumavky 3, do jamky 4 ze zkumavky 4 atd.). Do jamky 12 přidáme 20 µl DMS, které slouží jako kontrola. Tím získáme pracovní roztoky všech koncentrací. Tabulka 2. Koncentrace látky v jamkovém rezervoáru Jamka rezervoáru Koncentrace (µmol.l -1 ) ,5 31,25 15,625 7,813 3,906 1,953 0,977 0, Pipetování do destiček Dvanáctikanálovou pipetou napipetujeme 200 µl příslušného pracovního roztoku do řádků A, B, C, D, E, G a H. Řádek F zůstane prázdný. Do druhé destičky napipetujeme tolik řádků, kolik máme testovaných látek, protože kmen Trichophyton mentagrophytes se inkubuje na samostatné destičce. Do každé jamky řádku A pipetujeme 10 µl suspenze CA, do řádku B 10 µl suspenze CT, do řádku C 10 µl suspenze CK, do řádku D 10 µl suspenze CG, do řádku E 10 µl suspenze TB, do řádku G 10 µl suspenze AF, do řádku H 10 µl suspenze AC. Do všech jamek druhé destičky napipetujeme 10 µl suspenze TM. Rozmístění kmenů a koncentrací je popsáno v přiloženém obrázku. 42

43 br. 17. Mikrotitrační destička Inkubace Destičky přiklopené víčkem inkubujeme v termostatu při 35 C první destičku 48 hodin, druhou destičku s TM 120 hodin Vyhodnocení První destičku odečítáme po 24 a 48 hodinách, druhou destičku po 72 a 120 hodinách. Jamka, ve které dojde k 80% potlačení růstu, odpovídá koncentraci látky inhibující růst kvasinky. U vláknitých mikromycet hodnotíme jamku s 50% inhibicí růstu Testované látky K pokusu byly použity látky syntetizované na Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv (Mgr. Lucia Semelková, Mgr. ndřej Janďourek). Celkem bylo testováno 52 sloučenin. Chemické vzorce a názvy látek byly vytvořeny v programu ChemSketch. 43