VOLNÉ ŘETĚZCE IMUNOGLOBULINU V SÉRU

Transkript

1 Oddělení laboratorní medicíny Nemocnice Šternberk Jívavská 20, 78516, Sternberk, Czech Republic Zelená linka Tel Fax Charakteristika analýzy: Identifikace: VOLNÉ ŘETĚZCE IMUNOGLOBULINU V SÉRU Využití: podezření na monoklonální gamapatii (M-peak, atypický nález v biopsii kostní dřeně, klinické podezření), nahrazení vyšetření B-J proteinu v moči, monitorování pacientů léčených nebo sledovaných pro monoklonální gamapatii, rychlý odhad responderů terapie, odhad přítomnosti residuální nemoci a kompletní odpovědi na terapii, riziková stratifikace pro progresi MGUS. Vyšetření má nejvyšší diagnostickou efektivitu. Referenční mez: význam má především index /. Pro ilustraci jsou uvedeny i normální hodnoty obou řetězců. FLC : 3,30-19,40 mg/l (průměr 7,30) FLC : 5,70 26,30 mg/l (průměr 12,70) Index FLC / : 0,26-1,65 (průměr 0,60) Doporučený způsob odběru materiálu: uzavřený systém, sérum. Klinická data: Monoklonální gamapatie (dále jen MG) jsou maligní nebo potenciálně maligní proliferativní onemocnění B-lymfoidní řady, provázena téměř bezvýjimečně syntézou a sekrecí monoklonálních, chemicky i fyzikálně homogenních imunoglobulinů nebo jejich strukturních komponent, nejčastěji lehkých řetězců (které pak mohou být vzhledem ke své nízké relativní molekulární hmotnosti - vylučovány do moči jako Bence Jonesova bílkovina ), zřídka i těžkých řetězců nebo ještě menších fragmentů imunoglobulinové molekuly). Monoklonální produkt nádorové buňky je u každého nemocného s MG individuálně specifický. Je to dáno jednak biologickou, protilátkovou specifitou, která byla geneticky zakotvená v proliferující imunokompetentní buňce, jednak změnami v primární struktuře (delece nebo naopak inzerce několika aminokyselin), méně často i v sekundární struktuře (větvení jednoduchého polypeptidového řetězce). Ke změnám může docházet ve všech částech původní imunoglobulinové molekuly, nejčastěji však ve variabilních částech jak lehkých, tak i těžkých řetězců. Intenzita denní syntézy se u jednotlivých nemocných může pohybovat v relativně širokém rozsahu ( pg/d/buňku), nejčastěji v rozsahu pg/d/buňku a u téhož nemocného zůstává v průběhu onemocnění poměrně stálá. Změny koncentrace monoklonálního proteinu v séru, případně rozsah exkrece volných monoklonálních lehkých řetězců do moči mohou proto být u téhož nemocného v určité míře (viz dále) indikátorem počtu produkujících nádorových buněk (tumor burden), resp. jejich změn při léčbě. V klinické praxi naráží využití obou možností na určité překážky. Stanovení koncentrace monoklonálního imunoglobulinového proteinu v séru lze provést denzitometrickým hodnocením jako migrační zóny v elektroforeogramu (pokud je přítomná). Prvním předpokladem správnosti denzitometrie je opticky kvalitní přístroj s vysokou linearitou měření; výsledek i pak ovlivní migrační pozadí zóny, tj. souběžná migrace jiných, fyziologických plazmatických bílkovin (nejčastěji IgG a transferinu).

2 Správnost denzitimetrického stanovení se snižuje při vysokých koncentracích monoklonálního proteinu v séru: při denaturaci elektroforeticky rozdělených bílkovin, která je nezbytným předpokladem navázání anionických barviv, vzniká na povrchu zóny špatně propustná vrstva denaturované bílkoviny, která zpomaluje průnik denaturačního činidla a následnou vazbu barviva ve vnitřních vrstvách zóny. Čím je koncentrace bílkoviny větší a čím je její migrace více homogenní, (platí to především pro monoklonální imunoglobuliny IgG a hlavně IgM), tím je následné falešné podhodnocení větší. Dalším nedostatkem denzitometrického stanovení je skutečnost, že stejné koncentrace monoklonálních imunoglobulinů se barví v jednotlivých třídách rozdílně podle obsahu nepolypeptidových (sacharidových) složek v jejich molekulách. S ještě většími problémy je spojeno imunochemické stanovení monoklonálních proteinů v séru (imunonefelometrie a imunoturbidimetrie). Antiséra proti těžkým řetězcům reagují jednak s residuálním fyziologickým imunoglobulinem (toto nadhodnocení nebývá v klinické praxi často příliš významné), mohou však špatně reagovat s individuálně jedinečnými antigenními epitopy monoklonálního proteinu s následným falešným nadhodnocením výsledku. Volné lehké řetězce v krvi patří mezi tzv. volně filtrovatelné plazmatické bílkoviny (Engliš 1993); jejich koncentrace v plazmě a v glomerulárním ultrafiltrátu se prakticky neliší. Vzestup jejich koncentrace v krvi se však neprojeví vzestupem jejich renální exkrece, pokud není překročena jejich maximální tubulární resorpce. Při intenzivní resorpci lehkých řetězců začíná váznout jejich degradace v cytosolu tubulárních buněk, které postupně zanikají, filtrát začíná pronikat do intersticia, kde vyvolává sterilní zánět, který vede k zániku nefronu a postupnému snižování filtrační plochy v ledvinách s následnou retencí lehkých řetězců v plazmě a vystupňováním procesu deteriorace ve zbývajících ještě funkčních nefronech. Denní exkrece volných monoklonálních lehkých řetězců proto nemůže být spolehlivým parametrem intenzity jejich syntézy v nádorových buňkách, i když jejich průkaz v moči je vždy významným indikátorem hlubší nádorové dediferenciace proliferujicího klonu a horší prognózy onemocnění. S postupným zvyšováním analytické senzitivity metod k průkazu volných lehkých řetězců v moči, resp. plazmě (termoprecipitační reakce, elektroforéza s vyšší rozlišovací schopností, imunofixace, isoelektrická fokusace s imunoblottingem a detekcí koloidním stříbrem aj.), se stávalo zřejmým, že převážná většina (až 85 %) MG je provázena zvýšenou syntézou volných monoklonálních lehkých řetězců; bylo rovněž zřejmé, že koncentrace volných monoklonálních lehkých řetězců v plazmě pokud by byla imunochemicky stanovena s dostatečnou analytickou specifitou (viz dále) by byla velmi vhodným indikátorem počtu proliferujích nádorových buněk, lepším než denzitometrické stanovení koncentrace monoklonálních imunoglobulinů a stanovení renální exkrece volných monoklonálních lehkých řetězců. Realizace takového předpokladu však dlouho vázla na přípravě vhodných antisér proti volným lehkým řetezcům: volné i v imunoglobulinových molekulách vázané lehké řetězce jsou za fyziologických i patologických okolností u téhož jedince v celém rozsahu antigenně identické. Některé epitopy lehkých řetězců, především v jejich konstantní části, nejsou v molekulách imunoglobulinů povrchově exponované (hidden antigenic determinants, skryté epitopy) a nemohou proto reagovat s jim odpovídajícími protilátkami. Pokud chceme imunochemicky stanovit jen volné lehké řetězce (mono- nebo polyklonální), musí antisérum reagovat pouze se skrytými epitopy, které jsou u volných lehkých řetězců povrchově exponovány. Řada antisér proti skrytým epitopům, která byla dosud komerčně dostupná, tuto podmínku beze zbytku nesplňovala. Protože koncentrace vázaných lehkých řetězců vždy řádově převyšuje koncentraci volných, byly koncentrace volných lehkých řetězců stanovované pomocí antisér s nedokonalou specifitou v důsledku zkřížené imunoreaktivity

3 často falešně nadhodnocené. Druhým vážným handicapem těchto sér byla jejich nízká avidita, v praxi neschopnost stanovit nízké koncentrace volných lehkých řetězců v oblasti jejich fyziologických koncentrací. Metody, které s takovými antiséry pracovaly (RIA, ELISA) nejsou nejoptimálnějším řešením v rutinním provozu, vyžadují obvykle práci v sériích, dosti často s pozdní dostupností výsledku.teprve nedávno (Bradwell a spol.2000) byly vhodným výběrem antigenů a postupnými vysycovacími operacemi připravena antiséra s vysokou aviditou, která umožňují stanovení velmi nízkých koncentrací volných lehkých řetězců a s vyhovující specifitou, která vylučuje zkříženou reaktivitu s vázanými lehkými řetězci. Na bázi těchto antisér pak bylo možno připravit imunoprecipitační metody, aplikovatelné na řadu běžně používaných automatických analyzátorů. Během relativně krátké doby pak byly získány výsledky, které přesvědčivě prokazují nesporný přínos a výhody, které moderní stanovení volných lehkých řetězců v plazmě přináší v diagnostice, monitorování vývoje a sledování efektu léčby u nemocných s MG. Molekuly imunoglobulinů se skládají ze dvou identických těžkých řetězců (α, δ, ε, γ, µ), které definují třídy imunoglobulinů a současně dvou identických lehkých řetězců ( a nebo ). Každý lehký řetězec je kovalentně vázán na těžký řetězec. U zdravých osob existuje většina lehkých řetězců ve vázané formě na těžké řetězce. Malé množství lehkých řetězců v séru (FLC) však existuje i u zdravých osob díky jejich nadprodukci a sekreci plasmocyty. Molekulární hmotnost FLC se pohybuje kolem 22.5kD; FLC se vyskytují především jako monomer. FLC se naopak vyskytují v jako kovalentně vázaný dimer a jejich molekulární hmotnost se pohybuje kolem 45kD. Tyto hmotnosti vedou k rozdílné glomerulární filtraci pro FLC - i ; proto se liší poměr / v séru (1:1,6) od jeho vazebného poměru / (2:1). Hodnoty FLC v moči bývají nízké (< 24 mg/l pro -FLC; < 20 mg/l pro -FLC). Pokud má pacient v pořádku ledviny, reabsorbují tubulární buňky selektivně všechny FLC; v moči se objevují pouze FLC, které jsou ledvinami sekretovány. Přítomnost vyšších hodnot FLC v moči může být způsobena postižením ledvin nebo maligním lymfoproliferativním onemocněním např. mnohotným myelomem. Monoklonální močové FLC, které jsou spojené s malignitou lymfoidního systému se nazývají Bence- Jonesova bílkovina. Zvýšené hodnoty polyklonálních FLC v séru bývají spojeny s autoimunitními onemocněními (např. SLE). Zvýšené hodnoty FLC bývají také spojeny s maligní proliferací plasmocytů (např. mnohotný myelom - MM) v tomto případě jsou však FLC monoklonální. V poslední době se objevují informace o novém imunochemickém testu pro ultrasenzitivní detekci FLC v séru (2-3 mg/l). Pro srovnání imunofixace spolehlivě detekuje hodnoty mg/l, elektroforéza hodnoty kolem mg/l. Pro detekci myelomu je v diagnostice mimo odhadu přítomnosti paraproteinu doporučováno ještě měření volných řetězců imunoglobulinů v moči.. Jde však o vyšetření, které může být zatíženo podstatnou chybou. V poslední době se naopak dostává do popředí jako zajímavá alternativa stanovení volných řetězců v séru, které vykazuje významně vyšší diagnostickou efektivitu než elektroforetické vyšetření s odhadem přítomnosti paraproteinu. V minulosti existovala řada problémů s vývojem vhodných protilátek a sestavení metodik na jejich analýzu (volné řetězce se totiž vyskytují v séru v nižší koncentraci než lehké řetězce

4 vázané na intaktní imunoglobuliny). Nedávno byly publikovány údaje o využití vhodných protilátek, které umožnily sestavení diagnostické soupravy na stanovení volných lehkých řetězců v séru. S oblibou se především využívá měření indexu FLC /, který je vhodný pro rozlišení mezi monoklonální a polyklonální etiologií zvýšení FLC. Zvýšená syntéza nebo snížená eliminace těchto řetězců vedou ke zvýšení kappa i lambda řetězců, přičemž poměr / se nemění. U osob s renálním selháváním se poločas prodlužuje z několika hodin až na několik dnů a koncentrace rostou 20x i víc; nicméně se poměr nemění (pouze mírně roste FLC /, nejvyšší hodnoty jsou v terminálním renálním selhání). Senzitivita se v tomto intervalu pohybuje pro diagnostiku MM kolem 97% (95 % CI ), specifičnost 100% (95% CI ), PPV+ 100% (99-100), NPV- 99% (97-100). Výhody stanovení volných lehkých řetězců imunoglobulinů v séru: - Senzitivní vyšetření, které dokáže identifikovat všechny pacienty, kteří produkují monoklonální lehké řetězce. Je 100x více senzitivní než vyšetření pomocí elektroforézy séra. - Stanovení indexu FLC / pro další monitorování nemocných. - Vysoká specifičnost s minimální interferencí intaktních imunoglobulinů. - Snadná interpretace. - Diferenciální diagnóza symptomatických nemocných: toto stanovení lze využít u jedinců s bolestmi skeletu, opakovanými frakturami v anamnéze, nejasným renálním postižením, nejasnými výsledky biopsie kostní dřeně. - Koncentrace lehkých řetězců v séru mají vztah ke klasifikaci choroby a pomáhají v odhadu reziduální choroby po terapii. - Odhad velikosti tumoru: koncentrace volných lehkých řetězců souvisí se změnou masy tumoru během terapie. - Odhad prognózy a progrese choroby: pacienti v remisi mají zvýšené hodnoty lehkých řetězců při jinak normálním nálezu mají zvýšené riziko časného relapsu choroby. - Hodnocení úspěšnosti terapie: koncentrace lehkých řetězců pomáhají při odhadu efektu terapie u pacientů s AL amyloidózou či nonsekrečního mnohotného myelomu. - Detekce recidivy tumoru: volné řetězce jsou užitečné pro detekci recidivy choroby a jsou více senzitivní než jiné testy u pacientů s AL amyloidózou a nesekrečním mnohotným myelomem. Další diagnostické přístupy pro diagnostiku MM, jejich nevýhody: - Celková bílkovina v moči: nízká senzitivita pro volné řetězce - Elektroforéza séra i moče: nedokáže detekovat lehké řetězce v nízkých koncentracích, je založena na subjektivní interpretaci. - Elektroforéza s imunofixací, sérum či moč: nejde o kvantitativní stanovení, vyšetření má nízkou senzitivitu pro nízké koncentrace lehkých řetězců v séru (< 150 mg/l) - Kapilární elektroforéza: má nižší senzitivitu než imunofixace - Stanovení celkových / řetězců na automatickém analyzátoru: má nízkou senzitivitu Pro ilustraci uvádíme ještě referenční hodnoty pro moč; v tomto případě se ale podobné vyšetření nedoporučuje pro řadu možných chyb (viz dále): FLC : 0,39 15,1 mg/l (ranní moč) FLC : 0,81-10,0 mg/l (ranní moč) Index FLC / : 2,04-10,4

5 Indikace vyšetření FLC v séru (společně s imunofixací proteinů v séru): - podezření na monoklonální gamapatii (M-peak, atypický nález v biopsii kostní dřeně, klinické podezření). - nahrazení vyšetření B-J proteinu v moči. - monitorování pacientů léčených nebo sledovaných pro monoklonální gamapatii. - rychlý odhad responderů terapie. - odhad přítomnosti residuální nemoci a kompletní odpovědi na terapii. - riziková stratifikace pro progresi MGUS Proč neprovádět nebo omezit provádění vyšetření FLC v moči? - problémy se sběrem moče. - různé objemy moče u různých pacientů s rizikem naředění u polyurických pacientů. - problém se sběrem moče u pacientů s bolestmi skeletu a frakturami. - obtíže s interpretací u pacientů s těžkou proteinurií. - porucha renální funkcí znehodnocuje analýzu. Správnost a současná standardizace stanovení Mezinárodní standard (např. typu CRM470) pro stanovení volných lehkých řetězců v séru nebyl dosud připraven, vzhledem ke skutečnosti, že každý monoklonální lehký řetězec je antigenně individuálně specifický, je příprava odpovídajícího standardu velmi obtížná. Producenti antisér ke stanovení volných lehkých řetězců v séru (Binding Site) proto připravují primární, sekundární a pracovní referenční materiály na bázi polyklonálních lehkých řetězců, jako referenční metoda byla použita imunonefelometrie (Bradwell a spol. 2001). Automatizované imunochemické stanovení volných lehkých řetězců v séru umožňují v současné době systémy Binding Site Minineph, Dade-Behring BN II a Prospec Tang a spol. 2000), Immunotech (Beckman-Coulter) Immage ( Harris a spol. 2000), Olympus AU 400, 640, 2700 a 5400 ( Showell a spol a Roche Hitachi 911, 912, 917 a Modular P800 ( Overton a spol. 2003, Showell a spol ).Nejvyšší analytická senzitivita (1,2 mg/l pro κ i λ řetězce) a přesnost (CV % 0,7-2,0 % v sérii, 1,4-3,8 % mezi sériemi) jsou udávány pro systémy Olympus, největší rozsah stanovitelných koncentrací (5,9-190 mg/l pro řetězce κ, 8,0-270 mg/l pro řetězce λ) pro systémy Dade-Behring a Imunotech. Rozdíly v jednotlivých parametrech stanovení však nejsou u všech systémů významně rozdílné. V současné době neexistuje mezinárodní resp. národní systém externí kontroly stanovení volných lehkých řetězců v séru, k interní kontrole lze použít systém IMMPROVE fy Binding Site. Poznámky k jednotlivým onemocněním a jejich nejnovější klasifikace: MM: druhá nejčastější hematologická malignita po non-hodgkinském lymfomu. V Kavkazské populaci má incidenci přibližně 40/ za rok, výskyt se zvyšuje s věkem a má lehkou mužskou predominanci. Diagnóza je založena na přítomnosti nadbytku monoklonálních plasmocytů v kostní dřeni, monoklonálních imunoglobulinů v séru a moči a spojeném orgánovém postižení. (anémie, kostní léze s hyperkalcémií, renální insuficience, atp.). V kostní dřeni se normálně vyskytuje okolo 1% plasmocytů, přičemž u pacientů s myelomem je jich až 30-90% (> 10%). Až u 97 % všech nemocných plasmocytomem lze při diagnóze nebo v pozdějším vývoji prokázat v séru nebo v moči monoklonální imunoglobulin nebo jeho strukturní komponenty (lehké, těžké řetězce, jejich fragmenty). U 82 % lze elektroforézou s dostatečnou rozlišovací schopností a imunofixací prokázat přítomnost kompletní molekuly monoklonálního imunoglobulinu (tj. molekuly se dvěma

6 lehkými a dvěma těžkými polypeptidovými řetězci); z toho asi v polovině lze buď současně při diagnóze nebo v dalším průběhu onemocnění v séru a/nebo v moči (BJB) současně prokázat volné monoklonální lehké řetězce, zcela identické s lehkými řetězci v intaktní monoklonální imunoglobulinové molekule. Asi u 15 % nemocných plasmocytomem produkují nádorové buňky pouze volné monoklonální lehké řetězce (plasmocytom s lehkými řetězci, light chain multiple myeloma, light chain disease, dříve též mikromolekulární paraproteinémie, Bence-Jones myelom). U 3-4 % nemocných plasmocytomem nelze v séru ani v moči jak elektroforézou, imunofixací, tak i ještě citlivějšími metodami (imunoblotting, stanovení volných lehkých řetězců v séru) přítomnost monoklonálního proteinu zjistit (nesekretorický plasmocytom, nonsecretory plasmocytoma). U těchto nemocných nacházíme vždy zvýšené hodnoty lehkých řetězců v moči i séru. Vyšetření v séru je lepším ukazatelem residuální nemoci než stanovení v moči. Nesecernující plasmocytom (myelom): jde asi o 1-5 % ze všech mnohotných myelomů. Onemocnění je typické chyběním monoklonálních imunoglobulinů v séru i moči (stanovení elektroforeticky). Imunohistochemicky lze monoklonální proteiny nalézt v kostní dřeni. Diagnóza je založena na stanovení lehkých řetězců v séru, pomocí kterého lze odhadovat i časnou odpověď na terapii. V dosavadní praxi byly takto označovány plasmocytomy, u nichž v séru a/nebo v moči nelze při elektroforéze a imunofixaci prokázat přítomnost monoklonálních proteinů (intaktních, kompletních molekul imunoglobulinů nebo jen volných lehkých řetězců). V % takových případů však lze s použitím imunohistologických metod prokázat monoklonální protein v cytosolu nádorových plazmatických buněk; s použitím zvláště citlivých metod (isoelektrická fokusace s imunoblottingem a barvením koloidním stříbrem) lze v těchto případech často prokázat stopová množství monoklonálních proteinů v séru, častěji kompletních imunoglobulinových molekul než lehkých řetězců, které při svém krátkém biologickém poločase jsou rychle filtrovány v ledvině a resorbovány v tubulech. S použitím kvantitativních imunoprecipitačních metod lze u 68 % nesecernujících plasmocytomů prokázat v séru buď patologickou koncentraci monoklonálního lehkého řetězce a/nebo indexu κ/λ (Drayson a spol. 2001). Paradoxní někdy je, že zjištěná koncentrace je tak vysoká (i více než 200 mg/l), že by ji mělo být možné prokázat i imunofixací. Příčinou může být skutečnost, že monoklonální volné lehké řetězce u nesecernujících plasmocytomů v séru vytvářejí někdy polymery, které se chovají jako polyantigeny a vyvolávají falešné zvýšení výsledků; navíc polymerní formy imunoglobulinů i lehkých řetězců nevytvářejí často při elektroforéze homogenní, ale spíše migračně heterogenní zóny. Kvantitativní stanovení volných lehkých řetězců v séru je nepochybně integrální součástí vyšetření při podezření na nesecernující plasmocytom. Negativní výsledek by však měl být vždy doplněn ještě imunohistochemickým vyšetřením plazmatických buněk v kostní dřeni. Plasmocytom(MM) s intaktní molekulou monoklonákního imunoglobulinu: Asi % nemocných s plasmocytomem produkuje intaktní monoklonální imunoglobulin IgG, IgA, IgD a IgE, výjimečně i IgM. Při diagnóze nebo v pozdějším průběhu onemocnění lze u části v moči závisle na analytické citlivosti a specifitě použité metody prokázat i exkreci volných lehkých řetězců shodného antigenního typu s řetězci v intaktní molekule monoklonálního imunoglobulinu. Udává se, že 96% ze všech pacientů má abnormální poměr /. Při používání nyní absolentních termoprecipitačních zkoušek na Bence-Jonesovu bílkovinu byla BJB zjišťována asi jen u 5-15 % nemocných, při elektroforetické analýze -

7 závisle na stupni rozlišovací schopnosti až u 30 %, při používání elektroforézy s vyšší rozlišovací schopností s imunofixací až u 60 %; současné automatizované imunoprecipitační metody s analytickou citlivostí v oblasti fyziologických koncentrací volných lehkých řetězců v séru prokazují jejich patologické hodnoty u % nemocných s plasmocytomem, kteří produkují intaktní monoklonální imunoglobulin. U dalších asi 10 % nemocných lze prokázat významně abnormální κ/λ index volných lehkých řetězců v séru, i když přitom koncentrace obou antigenních typů nepřekračují fyziologická rozmezí. Korelace koncentrací intaktních monoklonálních imunoglobulinů a volných monoklonálních lehkých řetězců v séru je velmi slabá, intenzita syntézy volných lehkých řetězců je mírou individuální nádorové dediferenciace nádorové buňky a projevem neschopnosti syntézy fylogeneticky mladších komponent imunoglobulinové molekuly, tj. těžkých řetězců. Stanovení koncentrací volných lehkých řetězců v séru je u plasmocytomu podstatně lepším parametrem progrese onemocnění a efektu léčby než je stanovení koncentrace intaktních monoklonálních imunoglobulinů. Pomineme-li analytické problémy, o kterých jsme se zmínili již dříve, reflektují změny koncentrací volných lehkých řetězců v séru lépe změny počtu produkujících nádorových buněk při progresi a léčbě onemocnění, protože biologický poločas volných lehkých řetězců je relativně krátký ( 2-6 hod) a není závislý na jejich koncentraci. Biologický poločas intaktních imunoglobulinů je významně delší, změny v počtu buněk odráží později a v případě nejčastějšího IgG je biologický poločas v určité míře závislý na jeho koncentraci. Změny v koncentraci volných polyklonálních lehkých řetězců druhého antigenního typu než je monoklonální řetězec (v literatuře se někdy používá výraz alternativní ) mají význam pro posuzování funkce kostní dřeně a ledvin: snížení (není neobvyklé ani vymizení) svědčí pro potlačení syntézy residuálních, fyziologických imunoglobulinů v kostní dřeni, zvýšení může být projevem snížené glomerulární filtrace a retence nízkomolekulárních bílkovin v séru. Asymptomatický MM: pacienti s symptomatickým MM musí splňovat 2 kriteria MM (koncentrace monoklonálního proteinu > 30 g/l a/nebo > 10% monoklonálních plasmocytů v kostní dřeni. 96% pacientů s tímto typem myelomu má atypický poměr /. Jedná se o stacionární formy plasmocytomu s diagnosticky nepochybným nálezem vysokého počtu nádorových plazmatických buněk ve dřeni a s přítomností monoklonálního imunoglobulinu zřídka i lehkých monoklonálních volných řetězců v séru a/nebo v moči. U doutnajícího plasmocytomu chybí změny na kostech, u indolentního plasmocytomu mohou být ojedinělá osteolytická ložiska i mírná anémie přítomny; obě formy plasmocytomu mohou po řadu let, někdy i více než 10 let, probíhat stacionárně a nevyžadovat léčení. Asi dvě třetiny nemocných s doutnajícím nebo indolentním plasmocytomem má zvýšenou koncentraci volných monoklonálních lehkých řetězců v séru a 96 % jich mělo patologickou hodnotu indexu κ/λ. (Bradwell 2003). Tyto nálezy však neměly jednoznačnou prediktivní hodnotu pro riziko progrese onemocnění! MGUS monoklonální gamapatie nejasného významu: je typická zvýšením monoklonálních intaktních imunoglobulinů u pacientů bez známek MM, AL amyloidózy, Waldenstromovy choroby, lymfoproliferativních onemocnění, plasmocytomu nebo příbuzných chorob. MGUS je definován jako M-protein < 30 g/l, plasmocyty v kostní dřeni < 10 %, bez známek proliferace B buněk, bez orgánových abnormalit. Nachází se u 1 % populace starší 50 let, u 3

8 % starších 70 let a u 10 %starších 80 let. Kolem 70 % bývá IgG, 15 % IgM a 10 % IgA; ve 2 % se vyskytuje jako biklonální. Může progredovat do MM. Zvýšení hodnot volných řetězců, resp. abnormální poměr kappa/lambda je také prognostickým ukazatelem u pacientů s MGUS. U více než poloviny nemocných, u nichž je v séru zjištěna přítomnost monoklonálního intaktního imunoglobulinu IgG, IgA, IgM (při podezření na myelom, náhodně při vyšetření prováděném z jiných důvodů, výjimečně při screeningu ve vzorku populace) chybí známky maligního lymfoproliferativního onemocnění. V současné době jsou tito nemocní souhlasně klasifikováni jako MGUS (Kyle 1982). Asi u 1 % sledovaných nemocných s MGUS se v průběhu roku vyvíjí maligní lymfoproliferativní onemocnění, nejčastěji plasmocytom. Riziko maligního zvratu je tím větší, čím je koncentrace monoklonálního imunoglobulinu v séru při diagnóze vyšší. Ve třídách IgA a IgM je riziko zvratu vyšší než ve třídě IgG. Výsledky prvních stanovení volných lehkých řetězců v séru ukazují, že asi u 50 % vyšetřených MGUS (Lachmann cit. Bradwell 2002) jsou hodnoty řetězců souhlasného typu s monoklonálním imunoglobulinem patologické, u asi 25 % jsou zvýšené oba typy volných lehkých řetězců, u zbylých 25 % nedochází ke změnám. Při srovnání indexů κ/λ řetězců jsou hodnoty u nemocných s MGUS, u nichž po dobu pěti let nedošlo k malignímu zvratu, v referenčních mezích; u nemocných, kde ke zvratu došlo, je průměrná hodnota indexu sice významně vyšší, ale hodnoty obou souborů se hodně překrývají. Při stratifikaci hodnot indexů se však prokázalo, že riziko zvratu stoupá s hodnotou indexu κ/λ (Kyle a Katzmann cit. Bradwell). U nemocných se stejným rozsahem koncentrací intaktního imunoglobulinu v séru se riziko maligního zvratu zvyšuje paralelně se vzestupem indexu κ/λ! Jak jsme již úvodem uvedli, mají nemocní s MGUS v séru kompletní, intaktní monoklonální imunoglobulin. Současná přítomnost malého množství (Kyle 1992), resp. 0,05-1,0 g/d monoklonálních lehkých řetězců (BJB) v moči patří u MGUS k výjimkám a má vždy vyvolat podezření na nepoznaný plasmocytom nebo jinou maligní MG. Zvláštní a v mnohém zatím nejasnou kategorií MGUS jsou nemocní, u nichž prokážeme v moči výjimečně i v séru jen monoklonální lehké řetězce (idiopatická exkrece BJB). Teoreticky lze tyto případy považovat za prekursory plasmocytomu lehkých řetězců, praxe však takový výklad nepodporuje. Vždy je v těchto případech třeba cíleně pátrat po příznacích AL amyloidózy nebo LCDD. Údaje o koncentracích a relaci volných lehkých řetězců v séru jsou u nemocných s idiopatickou exkrecí BJB velmi chudé ( Kyle a spol. 2002, Bradwell a spol. 2002).Nelze vyloučit, že patologická koncentrace jednoho antigenního typu lehkých řetězců resp. indexu κ/λ může být prediktorem vývoje plasmocytomu lehkých řetězců nebo nesecernujícího plasmocytomu. Amyloidóza a onemocnění z depozice lehkých řetězců AL amyloidóza (primární systémová amyloidóza): protilátková specifita je dána primární strukturou variabilních částí L a H řetězců; v N-terminální variabilní části lehkých řetězců lze navíc rozlišit několik podskupin, čtyři u řetězců typu κ (V κ1 -V κ4 ) a šest u řetězců typu λ (V λ1 V λ6 ). Monoklonální volné lehké řetězce λ podskupiny V λ6 jsou amyloidogenní. MG s produkcí lehkých řetězců typu V λ6 může vyvolat vznik primární systémové amyloidózy (AL-amyloidózy). Příčinou může být tendence lehkých řetězců typu V λ6 vytvářet v plazmě polymery, jejichž proteolytická degradace je nedokonalá, takže vzniká nerozpustný fibrilární amyloid, který se deponuje v extracelulárním prostoru. Není rovněž jisté, zda ke vzniku AL-

9 amyloidózy nepřispívá genetická predispozice postižených jedinců k vazbě amyloidového prekursoru na povrch buněk. Není však sporu, že příčinou AL-amyloidózy je MG, obvykle ale s tak malou potenciální malignitou, že se nikdy nevyvine v generalizovanou formu MG, jako je např. plasmocytom. V souhlase s tím je počet nádorových plazmatických buněk ve dřeni nízký a koncentrace volných monoklonálních lehkých řetězců (jen výjimečně kompletních monoklonálních imunoglobulinů) v séru, resp. moči rovněž nízká. Při elektroforéze prokázali Lachmann a spol. (2003) monoklonální protein v séru a/nebo moči jen u 54 % nemocných, z toho u 75 % byla koncentrace v séru nižší než 10 g/l. Při imunofixaci prokázali přítomnost monoklonálního proteinu v séru a/nebo v moči u 80 % nemocných, Kyle a spol. (1995) až u 89 %. Všichni nemocní s nálezem monoklonálního proteinu v séru a/nebo v moči měli patologické hodnoty volných monoklonálních lehkých řetězců v séru. U nemocných s histologicky ověřenou diagnózou systémové AL-amyloidózy a negativním nálezem při imunofixaci séra a moči prokázali Kyle a spol. (1995) patologické hodnoty volných monoklonálních lehkých řetězců v séru v 66 %. Lachmann a spol. (2003) zjistili ve svém velkém souboru nemocných s AL-amyloidózou při diagnóze zvýšené hodnoty volných monoklonálních lehkých řetězců v séru u 98 %. Při klinickém podezření na systémovou primární AL-amyloidózu lze stanovení volných lehkých řetězců v séru opět považovat za metody volby. Samo onemocnění je charakteristické akumulací lehkých volných řetězců nebo jejich fragmentů jako amyloidových deposit. Incidence je 9/ % pacientů má abnormální koncentrace FLC. Tzv. monoklonalita, tedy změněný poměr kappa/lambda byl však změněn pouze u % pacientů. Doporučuje se provést stanovení volných řetězců v séru společně s imunofixací séra. Depozice lehkých řetězců: FLC v séru jsou abnormální u 90% pacientů a jsou důležité při monitorování progrese choroby. Stanovení lehkých řetězců lze ještě využít u pacientů se solitárním kostním plasmocytomem, extramedulármním plasmocytomem, recidivujícím mnohotným plasmocytomem, Walendstromovu makroglobulinemii, Mezinárodní doporučení pro diagnózu MM a MGUS (2003) Symptomatický MM M protein v séru a/nebo moči. Plasmocyty v kostní dřeni v nadměrném množství (> 10%). Orgánové postižení. Abnormální FLC. Nonsekreční MM bez M proteinu, plasmocyty v kostní dřeni v nadměrném množství (> 10%). Orgánové postižení. Abnormální FLC. Asymptomatický MM - M protein v séru > 30 g/l, Plasmocyty v kostní dřeni v nadměrném množství (> 10%), bez orgánového postižení. Abnormální FLC. MGUS - M protein v séru < 30 g/l, Plasmocyty v kostní dřeni < 10%), bez orgánového postižení, bez proliferace B buněk. Abnormální FLC ne vždy. Nová klasifikace monoklonální gamapatií (2003, The International Myeloma Working Group) 1) MGUS monoklonální gamapatie nejasného významu 2) Asymptomatický myelom 3) Symptomatický mnohotný meylom

10 4) Nonsekreční mnohotný myelom 5) Solitární kostní plasmocytom 6) Extramedulární plasmocytom 7) Mnohotný solitární plasmocytom 8) Plasmocytová leukémie Vydávání výsledků: minimálně 1x týdně Význam stanovení volných lehkých řetězců v séru pro monitorování průběhu a léčby MG Biologický poločas volných lehkých řetězců v séru je asi 4 hod ( 2-6 hod.)lze proto oprávněně předpokládat, že při zachovalé glomerulární filtraci se pokles syntézy volných lehkých řetězců resp. počtu je produkujících nádorových buněk velmi rychle projeví, podstatně rychleji než dojde ke změnám v koncentracích intaktních, kompletních monoklonálních imunoglobulinů s významně delším biologickým poločasem. U plasmocytomu s intaktním kompletním monoklonálním imunoglobulinem je stanovení volných lehkých řetězců lepším indikátorem průběhu onemocnění a efektu léčby než změny koncentrace intaktního monoklonálního imunoglobulinu v séru (imunoprecipitací, denzitometrií), resp. stanovení exkrece BJB (pokud je současně přítomná) v moči. Biologický poločas intaktního monoklonálního imunoglobulinu, hlavně ve třídě IgG je závislý na jeho koncentraci, pokles koncentrace při léčbě je opožděný a pomalý. Koncentrace volných lehkých řetězců se mění již za 2-3 dny léčby. Při relapsu onemocnění, zvláště v pokročilém stadiu onemocnění, kdy se obvykle mění medikamentózní léčba, informují změny koncentrace volných lehkých řetězců promtně o účinnosti léčby. Při remisi onemocnění stoupá někdy hladina volných lehkých řetězců dříve než hladina intaktního imunoglobulinu. U plasmocytomu lehkých řetězců, kde dosud byly hlavním, někdy jediným indikátorem průběhu onemocnění a účinku léčby změny v exkreci BJB, je stanovení volných lehkých řetězců v séru podstatně výhodnější: k vymizení BJB z moči může dojít při léčbě při ještě vysokých hladinách volných lehkých řetězců v séru a vice versa: vzestup hladiny volných lehkých řetězců je průkazný při relapsu onemocnění dříve než dojde opět k exkreci BJB do moče. U nesecernujícího plasmocytomu, kde dosud byly kriteriem průběhu onemocnění a efektu léčby klinická symptomatologie a nálezy při opakovaných sternálních punkcích, je stanovení volných lehkých řetězců v séru metodou volby. Podobně je tomu u primární AL amyloidosy. Význam stanovení volných lehkých řetězců v séru pro prognózu onemocnění Určitější údaje jsou zatím popsány u AL-amyloidosy, kde při supervizi hladiny volných lehkých řetězců v séru pod 50 % vstupní koncentrace přežívalo za 10 let 65 % nemocných v kontrastu k jen 43 % přežívání nemocných, kde pokles hladiny volných lehkých řetězců v séru byl menší než 50 % vstupní koncentrace. Prognosticky významná je hladina volných lehkých řetězců v séru u nemocných s MGUS. Obecně platí, že čím vyšší je hladina při diagnóze onemocnění, tím větší je pravděpodobnost maligního zvratu onemocnění. Účinnost predikce zvratu je větší, pokud se hodnotí hladina volných lehkých řetězců v séru ve vztahu ke koncentraci intaktního monoklonálního imunoglobulinu. Ucelenější údaje o prediktivní hodnotě hladiny volných lehkých řetězců v séru u jiných MG zatím chybí. Obecně lze předpokládat, že prognóza onemocnění bude tím horší, čím vyšší je hladina volných lehkých řetězců v séru při diagnóze onemocnění.

11 Indikace ke stanovení volných lehkých řetězců v séru při diagnostice, monitorování průběhu a hodnocení efektu léčby MG 1. Při klinickém podezření na MG je stanovení volných lehkých řetězců v séru integrální součástí vyšetření, vždy však musí být současně provedena elektroforésa séra i moči nemocného.pokud zjistíme v séru atypickou zónu, je třeba provést imunofixaci antiséry proti těžkým řetězcům. Pokud atypickou zónu v elektroforeogramu séra nenalezneme, avšak prokážeme patologické zvýšení lehkých řetězců a/ nebo indexu κ/λ, je vhodné doplnit vyšetření imunofixací séra i moči s použitím antisér proti lehkých řetězcům. Je třeba zdůraznit, že v žádném případě nelze stanovení volných lehkých řetězců v séru použít jako screening MG, protože asi 75% nemocných s MGUS nemá patologické hodnoty koncentrace nebo indexu lehkých řetězců v séru a má přitom v elektroforeogramu séra atypickou zónu kompletního, intaktního imunoglobulinu. 2. Při zahájení a v průběhu medikamentózní léčby MG hodnotíme efekt ve vztahu k bazální hodnotě, kterou jsme stanovili před zahájením léčby. První vyšetření po zahájení léčby je možné provést již po třech dnech, obvykle se však provádějí vyšetření po celou dobu léčby v týdenních intervalech. 3. Vyšetření u nemocných se stacionárním průběhem MG, kteří nejsou léčeni a u nemocných v remisi po medikamentózní léčbě se provádějí obvykle v intervalech 2 3 měsíců. Shrnutí: Marker diagnózy monoklonální gamapatie, nahrazení vyšetření B-J proteinu v moči, monitorování pacientů léčených nebo sledovaných pro monoklonální gamapatii, rychlý odhad responderů terapie, odhad přítomnosti residuální nemoci a kompletní odpovědi na terapii, riziková stratifikace pro progresi MGUS. Literatura: Bradwell AR, et al. Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin Chem 2001; 47: Carr-Smith HD, et al. Development of serum free light chain immunoassays for the detection and monitoring of patients with Bence Jones myeloma. Clin Chem 2001; 47, No. 141, (Supp 6):A33. Cole PW, Durie BGM, and Salmon SE. Immunoquantitation of free light chain immunoglobulins: application in multiple myeloma. J Immunol Meth 1978; 19: Drayson M, et al. Serum free light-chain measurements for identifying and monitoring patients with nonsecretory multiple myeloma. Blood 2001; 97: Keren DF. Proteins in serum identified by high resolution electrophoresis. In High-resolution electrophoresis and immunofixation, 2nd ed Boston: Butterworth-Heinemann Mead GP, et al. Serum free light chain immunoassays as an aid in the diagnosis and monitoring of light chain monoclonal gammopathies. J Bone and Min Metabol 2001; Supp 19, page 44. Pescali E and Pezozoli A. The clinical spectrum of pure Bence-Jones proteinuria. Cancer 1988; 61: Solling K, Solling J, and Romer FK. Free light chains of immunoglobulins in serum from patients with rheumatoid arthritis, sarcoidosis, chronic infections, and pulmonary cancer. Acta Med Scand 1981; 209: Tang LX, et al. Evaluation of F(ab') 2 -based latex-enhanced nephelometric reagents for free immunoglobulin light chains on the Behring Nephelometer TM II. Clin Chem 2000; 46(6):A181. * Bradwell AR, mead GP, Carr-Smith HD: Serum free light chain analysis. Binding Site Ltd, 2005: 292s. * Englis M: Stanovení volných lehkých řetězců imunoglobulinů v séru v diagnostice a monitorování monoklonálních gamapatii. KKB IPVZ Praha.

12