Klinický význam vyšetření paraproteinů, metody jejich průkazu a stanovení

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd Klinický význam vyšetření paraproteinů, metody jejich průkazu a stanovení Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Doc.Ing. Szotáková Barbora Ph.D. Školitel specialista.: Prim. MUDr. Lerch Ivo RNDr. Veškrna Zdeněk Hradec Králové 2008 Milada Nezvedová

2 Touto cestou děkuji prim. MUDr. Lerchovi a RNDr. Veškrnovi za odbornou pomoc, doc. Szotákové za cenné rady a připomínky při zpracování tématu mé bakalářské práce. Zároveň děkuji Mgr. Vojtěchové za pomoc při řešení problémů a prof. Tichému za ochotné poskytnutí materiálů a zodpovězení otázek souvisejících s mou bakalářskou prací

3 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány

4 Obsah 1 Úvod Teoretická část Imunoglobuliny Struktura imunoglobulinů Polyklonální a monoklonální imunoglobuliny Monoklonální gamapatie Rozdělení monoklonálních gamapatií Mnohočetný myelom Bence Jonesova bílkovina Doutnající myelom Monoklonální gamapatie nejasného významu Nemoci z těžkých řetězců Choroba z ukládání lehkých řetězců IgD myelom IgE a IgM myelom Primární AL- amyloidóza Waldenströmova makroglobulinemie Solitární plazmocytom Plazmocelulární leukémie Potransplantační lymfoproliferativní onemocnění typu MM Transientní paraproteinémie Další lymfoproliferace s tvorbou monoklonálního imunoglobulinu Asociace monoklonální gamapatie s jinými nemocemi Projevy monoklonálních gamapatií Laboratorní průkaz a stanovení paraproteinů Elektroforéza sérových bílkovin Imunoelektroforéza Imunofixační elektroforéza Imunoturbidimetrie Imunonefelometrie Význam stanovení volných lehkých řetězců v séru Ostatní sledované markery u MG Cíl práce Metodika Zpracování biologického materiálu před analýzou Pracovní postup při elektroforéze na agarózovém gelu Pracovní postup při imunofixaci Výsledky Závěr

5 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Titul, příjmení, jméno kandidáta: Nezvedová Milada Titul, příjmení, jméno školitele: Doc. Ing. Szotáková Barbora Ph. D. Titul, příjmení, jméno školitele specialisty: Prim. MUDr. Lerch Ivo RNDr. Veškrna Zdeněk Název bakalářské práce: Klinický význam vyšetření paraproteinů, metody jejich průkazu a stanovení Abstrakt Vyšetření paraproteinů v séru a moči je jedním z významných ukazatelů pro diagnostiku monoklonálních gamapatií. Monoklonální imunoglobuliny jsou výsledným produktem jednoho klonu B-buněk. Monoklonální gamapatie nejasného významu jsou charakterizovány nízkou produkcí M-Ig. Při této diagnóze je velice důležité sledovat hladinu paraproteinů v séru či moči pro včasný záchyt přechodu na vysoce maligní onemocnění - mnohočetný myelom. Další význam stanovení hladin M-Ig je při monitorování úspěšnosti léčby pacienta s MG a následném sledování, zda nedochází k relapsu onemocnění. Mezi nejdůležitější techniky průkazu a stanovení paraproteinů patří elektroforéza na agarózovém gelu a k průkazu jednotlivých tříd M-Ig imunofixace, která se skládá ze dvou částí - v první dochází k rozdělení bílkovin pomocí elektroforézy, ve druhé se aplikují monoklonální protilátky

6 Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Nezvedová Milada Consultant: Doc. Ing. Szotáková Barbora, Ph.D. Consultant specialist: Prim. MUDr. Lerch Ivo RNDr. Veškrna Zdeněk Title: Clinical meaning of paraproteins examination, methods for their evidence and determination Abstract The investigation of the serum and urine paraproteins is one of the significant indicators of the diagnostics of monoclonal gammapathies. Monoclonal immunoglobulins are the resulting product of one B-cells clone. Monoclonal gamapathies of the obscure signification are featured by the low production of M-Ig. By this diagnosis it is very important to observe the level of the serum or urine paraproteins to detect the malignant disease the myelom multiplex in time. The next meaning of the M-Ig level determination is when monitoring the success of the treatment of the patient with MG and when monitoring the potential relapse of the disease. One of the most important technologies of the diagnostics of paraproteins is agarose gel electrophoresis and very important technology of the diagnostics of particular classes M-Ig is immunofixation analysis, which consists of two parts in the first the proteins are divided by the means of the electrophoresis, in the second the monoclonal antibodies are applied

7 1 Úvod Monoklonální imunoglobuliny paraproteiny, jsou produktem jednoho klonu proliferujících buněk řady B. Vždy patří k jedné třídě, podtřídě a typu lehkých řetězců. Průkaz a stanovení paraproteinů v séru nebo v moči má význam diagnostický i prognostický. Sledování jejich koncentrace v průběhu léčby již diagnostikovaného onemocnění je velice dobrým indikátorem úspěšnosti léčby. Ne vždy výskyt paraproteinů poukazuje na maligní onemocnění, často je pozorována u pacientů stabilní nízká hladina bez jiných příznaků nemoci. Jedná se zejména o starší pacienty nebo o pacienty s benigním onemocněním. U těchto pacientů je velice důležité sledovat hladinu paraproteinů v krvi, protože při náhlém zvýšení jejich koncentrace lze včas zachytit počínající maligní onemocnění a zahájit léčbu. Prognostický význam spočívá v tom, že nález vysokých hladin paraproteinů v krvi nebo v moči poukazuje na horší prognózu než pokud je jejich hladina nízká či nejsou přítomny vůbec

8 2 Teoretická část 2.1 Imunoglobuliny Imunoglobuliny jsou sekreční produkty diferencovaných plazmatických buněk, které jsou konečným vývojovým stádiem B-lymfocytů. Tyto jsou zodpovědné spolu s lymfocyty T za specifickou imunitu, která je charakterizována přesným rozpoznáním všech cizorodých antigenů a imunologickou pamětí. Jednotlivé imunoglobuliny se od sebe liší strukturou vazebných míst pro antigen, která se nazývají idiotypy. Tyto mohou být rozpoznány jinými lymfocyty B jako antigeny a mohou se proti nim tvořit protilátky tzv. antiidiotypové (Špička a kol., 2005). Geny pro řetězce imunoglobulinů vznikají při dozrávání lymfocytů, kdy dochází k tzv. přeskupování subgenů pro těžké a lehké řetězce a jejich následnou kombinací vzniká obrovská rozličnost protilátkových molekul (Jílek, 1999) Struktura imunoglobulinů Imunoglobuliny jsou globulární bílkoviny tvořeny čtyřmi řetězci, z nichž 2 delší se označují jako těžké (H) a dva kratší jako lehké (L) (Obr.1). Řetězce jsou mezi sebou spojeny disulfidovými vazbami mezi dvěma aminokyselinami cysteinu. I uvnitř řetězců se nachází disulfidové vazby, díky nimž molekula vytváří kruhové smyčky-domény. U lehkých řetězců rozlišujeme domény dvě - variabilní(vl) a konstantní (CL). U těžkých řetězců se nachází 1 doména variabilní a 3 (někdy i 4) konstantní (Jílek,1999). Domény VL a VH slouží k reakci s antigenem - tato oblast je součástí tzv. Fab fragmentu (Obr.2). Konstantní domény jsou pro jednotlivé imunoglobulinové molekuly určité třídy shodné, liší se však mezi jednotlivými třídami. Součástí konstantní části je tzv. Fc fragment nutný pro aktivaci komplementu, vazbu na fagocyty při opsonizaci, přestup přes placentu atd

9 Těžké řetězce jsou ve své Fc části glykosylovány. Rozdělení molekuly na tyto dva fragmenty se docílí proteolytickým štěpením (Litzman a kol., 2001). Molekuly imunoglobulinů G, D a E mají základní čtyřřetězovou strukturu - tedy dva lehké a dva těžké řetězce. Molekula IgM tvoří pentamer spojený J řetězcem. Molekula IgA má čtyřřetězovou jednotku zdvojenou do dimeru (Jílek, 1999). Těžké řetězce: jsou kódovány geny, které jsou zakotveny na 14. chromozomu a jsou označovány,, 1-4, 1-2, (Špička a kol., 2005). Odpovídající izotopy imunoglobulinů jsou: IgM - tvoří se jako první při setkání s antigenem, velmi účinně aktivuje komplement. Má molekulovou hmotnost asi 900 kda a řetězce jsou silně glykosylovány. Neváže se ovšem na Fc receptory fagocytů. IgG - má největší koncentraci v séru a jednotlivé podtřídy se liší schopností vázat komplement a s různou afinitou se váží na Fc receptory fagocytů. Hladina tohoto imunoglobulinu na rozdíl od IgM nikdy neklesá k nule. IgA - existuje ve dvou formách - slizniční a sérové, aktivuje komplement, funguje jako opsonin vazbou na specifické Fc receptory fagocytů. Vyskytuje se ve dvou podtřídách - IgA1 - pochází zejména ze slizničních plazmocytů a IgA2 je produkován více v kostní dřeni (Hořejší, Bartůňková, 1998). IgE - je v séru v nepatrných koncentracích, zvýšení jeho hladiny - polyklonálníje typické pro parazitární a alergické choroby. Část molekul je vázána na receptory žírných buněk a bazofilů, kdy po vazbě antigenu či alergenu na IgE dojde k degranulaci žírných buněk, uvolnění histaminu a dalších mediátorů a následné reakci. Nízkoafinitní receptory pro tyto imunoglobuliny se nacházejí na lymfocytech B a Langerhansových buňkách a vazbou s IgE dochází k tomu,že je produkce IgE regulována (Špička a kol., 2005). IgD - je v séru přítomen pouze v nízkých koncentracích a jeho funkce není známa (Litzman a kol., 2001)

10 Lehké řetězce : Existují ve dvou typech - a. Liší se od sebe primární strukturou konstantních domén, jsou kódovány odlišnými geny na různých chromozomech, ale velikostí a funkcemi jsou si podobné (Špička a kol.,2005). Jedná se o polypeptidy, které se vyskytují jako monomery o molekulové hmotnosti 22 kda či dimery o molekulové hmotnosti asi 44 kda. Mnohem vzácněji se vyskytují jako tetramery (Engliš, 1993). Za fyziologických okolností jsou více produkovány řetězce typu než. Volné lehké řetězce jsou produkovány v nadbytku nad těžkými řetězci, jsou přítomny fyziologicky v séru i v moči. Koncentrace polyklonálních lehkých řetězců v moči je nízká: 0,75-1,8 mg/l. Koncentrace lehkých řetězců v séru: : 1,38-3,75 g/l : 0,93-2,42 g/l. Z těchto hodnot lze vypočítat indexy / u paraproteinémií antigenního typu lehkých řetězců a / u paraprotenémií s antigenním typem lehkých řetězců. Normální rozpětí indexů je: Sérum: 1,17 2,42 Moč: 0,75-4,5 (Špička a kol.,2005)

11 Obr.1. Variabilní a konstantní části lehkých a těžkých řetězců v molekule Ig ( Obr.2. Fc a Fab fragmenty molekuly Ig (Litzman a kol.,2001)

12 2.1.2 Polyklonální a monoklonální imunoglobuliny Polyklonální Ig se označují imunoglobuliny s různými idiotypy. Jsou přítomny za fyziologických okolností. Polyklonální gamapatie: je charakterizována zmnožením více typů či fragmentů imunoglobulinů. Jsou většinou spojeny s akutními nebo chronickými záněty, jaterními onemocněními a autoimunitními procesy. Monoklonální Ig jsou produkty jednoho klonu plazmatických buněk, mají shodný izotyp i idiotyp. Monoklonální gamapatie: jsou charakterizovány proliferací jednoho klonu plazmatických buněk, které produkují homogenní imunoglobulin paraprotein (M-protein). Ten může být prokazatelný jak v séru, tak i v moči. Zastoupení jednotlivých protilátkových specifit v séru záleží na tom, se kterými antigeny se daný jedinec v životě setkal. Při imunitní rekci může dojít i k tomu, že reakce proti určitému antigennímu epitopu je natolik silná, že se může přechodně objevit i malé množství monoklonálních protilátek. Pokud ovšem dojde k maligní přeměně plazmocytu, zachová si ten schopnost secernovat protilátky, které jsou monoklonální, dochází k infiltraci tohoto klonu do kostní dřeně a postupnému vyhubení fyziologických plazmocytů (Špička a kol, 2005.). 2.2 Monoklonální gamapatie Paraprotein je strukturálně i funkčně homogenní a náleží vždy jedné třídě, podtřídě a typu lehkých řetězců. M-protein tedy rozlišujeme na: IgG, IgA, IgM, IgD a IgE, lehké řetězce typu a. V elektroforeogramu séra a moči se takové zmnožení klonu imunoglobulinů projeví jako ohraničená frakce a je nazývána jako monoklonální komponenta či M gradient. Pohyblivost MC je mezi a oblastí elektroforeogramu

13 Monoklonální komponenta může být: 1. monoklonální imunoglobulin jedné třídy a jednoho typu lehkých řetězců, např. IgG 2. volné lehké řetězce jednoho typu nazývané jako Bence Jonesův protein 3. volné těžké řetězce nebo Fc fragmenty tj. -, - nebo -řetězce (Špička a kol.,2005) Rozdělení monoklonálních gamapatií Dle Kyla lze MG rozdělit do dvou skupin: A. maligní monoklonální gamapatie B. monoklonální gamapatie nejasného významu Maligní monoklonální gamapatie jsou dále klasifikovány: 1. Mnohočetný myelom (IgG,IgA,IgD,IgE nebo z lehkých řetězců) 2. Variantní formy myelomu: a) Smoldering b) Plazmocelulární leukemie c) Nesecernující myelom d) Solitární plazmocytom e) Extramedulární plazmocytom f) Osteosklerotický myelom 3. Maligní lymfoproliferativní onemocnění: a) Waldenströmova makroglobulinémie b) Maligní lymfomy c) Chronická lymfatická leukémie 4. Nemoc z těžkých řetězců: a) Nemoc z těžkých řetězců (gama) b) Nemoc z těžkých řetězců (alfa) c) Nemoc z těžkých řetězců (mí) 5. Amyloidóza: Primární (Tichý, 1997)

14 2.2.2 Mnohočetný myelom Mnohočetný myelom je relativně častým nádorovým onemocněním, které se vyskytuje především u osob vyššího věku a je častější u mužů. Jedná se o maligní lymfoproliferaci, která vychází z B lymfocytu na úrovni jeho diferenciace v plazmatickou buňku. Takto maligně transformovaný plazmocyt produkuje imunoglobuliny, které mají identické fyzikální, chemické a imunologické vlastnosti. Monoklonální imunoglobulin paraprotein a zejména jeho lehké řetězce způsobují postupně těžké poškození ledvin. Zvláště nefrotoxické jsou lehké řetězce. Současně dochází k produkci řady cytokinů (TNF, IL6, IL 1- ), které zvyšují aktivitu osteoklastů a vznik osteolytických ložisek. V neposlední řadě dochází ke snížení produkce fyziologických imunoglobulinů, což má za následek vyšší incidenci k infekcím (Klener a kol., 2003). Tři základní rysy mnohočetného myelomu: Infiltrace kostní dřeně Produkce monoklonálního imunoglobulinu Kostní postižení (Špička a kol., 2005) Klinická stádia myelomu dle Durieho a Salomona Stadium I: nutné splnění všech podmínek: hemoglobin 100 g/l, IgG 50 g/l nebo IgA 30 g/l, BJ bílkovina v moči 4 g/24 hod., Ca v normě, žádný nález na skeletu Stadium II: hodnoty mezi stadii I a III Stadium III: nutné splnění alespoň jedné podmínky: hemoglobin 85 g/l, IgG 70 g/l nebo IgA 50 g/l, BJ bílkovina v moči 12 g/24 hod, Ca 2,75 mmol/l, průkaz kostního postižení Subklasifikace: A : normální funkce ledvin B : snížená funkce ledvin (Kozák a kol., 2001)

15 Mezinárodní stážovací systém MM Stadium I: 2 M 3,5 mg/l, albumin 35 g/l Stadium II: 2 M 3,5 mg/l, albumin 35 g/l nebo 2 M 3,5-5,5 mg/l Stadium III: 2 M 5,5 mg/l (Tichý, Maisnar,2006) Etiologie tohoto onemocnění je neznámá. Je diskutováno o těchto příčinách vzniku: 1. radiace 2. chemické kancerogeny 3. genetická predispozice 4. virusová dvojzásahová teorie - např. virus Epstein - Barrové (Tichý, 1997) Kritéria pro diagnostiku MM: nejméně 10% abnormálních, nezralých plazmatických buněk v kostní dřeni klinické příznaky histologický průkaz u extramedulárního plazmocytomu nejméně jedna z těchto abnormalit: paraprotein v séru - detekce monoklonálního proteinu je možná při počtu myelomových buněk alespoň Bence Jonesova bílkovina v moči osteolytická ložiska. (Tichý, 1997) Kritéria MM dle Durieho a Salomona : Velká kritéria: 1. plazmocytom 2. počet plazmocytů v kostní dřeni 30% 3. sérové koncentrace M-IgG 35 g/l, M-IgA 20 g/l, lehké řetězce v moči za 24 hodin 1 g

16 Malá kritéria: 1. v kostní dřeni % plazmocytů 2. koncentrace M-Ig nižší než v bodě 2 velkých kritérií 3. osteolytická ložiska 4. snížení hodnot fyziologických Ig : IgM 0,5 g/l, IgA 1,0 g/l, IgG 6,0 g/l Diagnóza MM je jasná, pokud je přítomno jedno velké a jedno malé kritérium nebo jsou-li přítomna malá kritéria 1+2 a dále jedno z malých kritérií 3 nebo 4. (Adam a kol., 1999) Symptomatickou chorobu předchází bezpříznakové období, které může trvat od několika měsíců po několik let. V době, kdy se začínají projevovat klinické potíže, dochází k postižení různých orgánů a systémů. Nejčastější manifestací MM jsou: Algický syndrom při osteolýze Projevy imunodeficitu Anemický syndrom Projevy renální insuficience nebo proteinurie Poruchy hemostázy Hyperkalcemie Tvorba amyloidu (Špička a kol. 2005) Charakteristické znaky: Bolesti kostí - většinou bolesti zad a hrudníku Opakované infekce - obzvlášť bakteriální Slabost, únava, vyčerpání - hlavně jako důsledek anemie Projevy hyperviskozního syndromu - bolesti hlavy Poruchy vědomí, kardiální insuficience Vzestup teploty - v pokročilých fázích (Špička kol., 2005) Formy myelomu (Obr. 3): a) Multifokální myelom bez difuzní infiltrace kostní dřeně: tvoří asi 10% všech plazmocelulárních malignit, je charakterizován vícečetnými osteolytickými ložisky, difuzní osteoporóza není přítomna

17 b) Difuzní postižení kostní dřeně myelomovými buňkami: tvoří 80% všech plazmocelulárních malignit. Tuto formu lze rozdělit na kombinované postižení, kdy dochází k difuzní infiltraci kostní dřeně a hromadění myelomových buněk v osteolytických ložiscích, a na difuzní postižení kostní dřeně bez ložiskového nahromadění myelomových buněk. c) MM bez dominujících osteolytických projevů: dominující jsou vyšší koncentrace M-Ig a výrazně snížené koncentrace fyziologických imunoglobulinů, anémie a poškození ledvin. d) MM s dominující imunosupresí a infekcemi:převládajícími příznaky jsou četné závažné infekce, opakující se bronchopneumonie, vyšší hladiny M-Ig, výrazně snížené koncentrace fyziologických Ig. e) MM s dominujícím poškozením ledvin a případně anémií: izolovaná tvorba lehkých řetězců - Bence-Jonesův typ myelomu, myelom produkující kompletní molekuly M-Ig + volné lehké řetězce. f) Plazmoblastický sarkom: tvoří jen 3% plazmocelulárních malignit, přítomna jsou ne příliš četná, ale velká ložiska osteolýzy, často s prorůstáním do měkkých tkání. (Adam a kol., 2001) Obr.3. Znázornění postižení kostí plazmocelulárním maligním onemocněním dle Bartla (Adam a kol., 2001)

18 Tab. 1. Zastoupení typů monoklonálních imunoglobulinů u MM (monoklonální imunoglobuliny typu IgM jsou u MM vzácné) (Špička a kol., 2005) Typ monoklonálního Zastoupení v % imunoglobulinu IgG IgA IgD 1-2 IgE <0,01 Lehké řetězce Těžké řetězce <1 2 a více typů MIg <1 Negativní nález 1-4 Přítomnost monoklonální proteinu je potvrzena elektroforeticky většinou v oblasti, méně často v a jen ojediněle v 2. (Obr.4). Z hlediska izotypu lehkých řetězců je zastoupení / 2:1 (Špička a kol.,2005). Obr. 4. Oblasti výskytu M komponenty (

19 2.2.3 Bence Jonesova bílkovina Je prokazována v moči asi u 75 % nemocných s mnohočetným myelomem. Nízké hodnoty pod 0,2 g/24 h mohou poukazovat na monoklonální gamapatii neurčeného významu či maligní lymfoproliferativní proces, jelikož při normální funkci ledvin může být resorbován až 1g/24 h. (Špička a kol., 2005 ) Monoklonální lehké řetězce BJB - poškozují buňky proximálních tubulů. Její nefrotoxicita je zřejmě způsobena její polymerací, tendencí vytvářet depozita v tubulech a v bazální membráně nebo k tvorbě amyloidu. Lehké řetězce jsou považovány za nefrotoxičtější než. Asi u 15% pacientů s MM produkují nádorové buňky pouze volné monoklonální lehké řetězce (Engliš, 2007) Doutnající myelom Jedná se o přechodnou formu mezi monoklonální gamapatií nejasného významu a mnohočetným myelomem. Základním diferenciačním faktorem je hladina M-komponenty vyšší než 30g/l a procento plazmatických buněk v kostní dřeni nad 10%, nesmí však být přítomny další klinické známky typické pro MM (kostní léze, hyperkalcemie, anemie, renální selhání) a hladina M-Ig je dlouhodobě stabilní. Dochází též ke snížení hladiny fyziologických imunoglobulinů. Riziko progrese v mnohočetný myelom: 1. nízké: M-Ig 30 g/l a typ IgG, resp. nízká hladina M-Ig + negativní nález magnetické rezonance 2. střední: M-Ig > 30 g/l nebo M-Ig typu IgA, resp. stejná hladina M-Ig nebo pozitivní nález MR 3. vysoké: M-Ig > 30g/l a IgA, resp. stejná hladina M-Ig + pozitivní nález MR (Špička a kol., 2005)

20 2.2.5 Monoklonální gamapatie nejasného významu Tímto termínem se označuje izolovaný nález monoklonálního imunoglobulinu v séru nebo v moči bez současné přítomnosti lymfoproliferativního onemocnění. Vlastní MGUS je považována za první fázi mnohočetného myelomu. Ve většině případů zůstává toto onemocnění klinicky němé. Jen ojediněle dochází k rozvoji orgánových komplikací způsobených paraproteinem (Špička a kol., 2005). Při této nemoci lze laboratorně prokázat dlouhodobě stabilní množství M-Ig < 30 g/l v séru a pouze v malém množství v moči - méně než 1g za 24 hodin, počet plazmocytů v kostní dřeni méně než 10 % (Adam a kol., 1999). Větší riziko přechodu v MM upozorňuje zejména vyšší hladina M-Ig typu non-igg. Užitečným testem pro rozlišení myelomu a MGUS je stanovení kvantity lehkých řetězců a a jejich indexu v séru a moči. Růst tohoto indexu může upozornit při dlouhodobém sledování na přechod MGUS v maligní monoklonální gamapatii (Špička a kol., 2005) Nemoci z těžkých řetězců Nemoci z těžkých řetězců jsou onemocnění charakterizována proliferací jednoho klonu B-lymfocytů, které produkují strukturálně nekompletní těžké řetězce Ig bez asociace s lehkými řetězci. Postupně byly prokázány nemoci z těžkých řetězců,, a. Nejčastější je nemoc z těžkých řetězců, zatímco nemoc z těžkých řetězců je vzácná a ojedinělá (Tichý a kol., 2007). Nemoc z těžkých řetězců alfa - klinické projevy: postižení gastrointestinálního traktu, malabsorpce se snížením váhy, diarrhoea, steatorrhea. Při elektroforéze nebývá detekován charakteristický M-gradient, asi u poloviny nemocných se jedná o nápadné zesílení zóny alfa-2 nebo beta globulinů. V nízké koncentraci mohou být monoklonální těžké řetězce přítomny v moči, na rozdíl od Bence Jonesovy bílkoviny, která nebyla prokázána nikdy. Nemoc z těžkých řetězců gama - elektroforéza séra je velmi variabilní, asi u 40% nemocných je obraz normální. Koncentrace paraproteinu

21 bývá nižší než 10 g/l, množství těchto řetězců v moči je obvykle nižší než 0,5 g/24 hodin. BJB nebyla v moči nikdy prokázána. Nemoc z těžkých řetězců mí - je vzácné onemocnění. M - gradient při elektroforéze byl nalezen u 40% nemocných a BJB v moči byla přítomna u více jak poloviny nemocných. (Tichý,1997) Choroba z ukládání lehkých řetězců Příčinou LCDD je benigní, ale i maligní lymfoproliferace produkující lehké řetězce, které působí především na ledviny. Nemoc se neprojevuje typickým morfologickým obrazem v kostní dřeni a je definována způsobem ukládání a poškození měkkých tkání depozity lehkých řetězců v neamyloidové formě (Adam a kol., 1999) IgD myelom Toto onemocnění tvoří asi 1-2% případů s MM (Špička a kol., 2005). Je pro něj typický výskyt v mladším věku, často ho provází selhání ledvin, hyperkalcémie a amyloidóza (Maisnar a kol., 2007). Průkaz monoklonální komponenty v séru je pouze u 60% případů. Téměř ve všech případech jsou ovšem přítomny lehké řetězce v moči. Na rozdíl od většiny ostatních forem myelomu převažují lehké řetězce (Špička a kol., 2005). Diagnóza může být obtížná z toho důvodu, že imunofixace s antisérem proti IgD není rutinně prováděna, a řada případů IgD MM tak může být chybně diagnostikována jako onemocnění z lehkých řetězců (Maisnar a kol., 2007) IgE a IgM myelom Tyto myelomy jsou velmi vzácné. IgE myelom je spojen s horší prognózou, existence IgM myelomu byla do nedávné doby zpochybňována (Špička a kol., 2005)

22 Primární AL - amyloidóza Kromě klinických příznaků, mezi které patří poškození ledvin, karpální tunel, periferní neuropatie, je charakteristický nález paraproteinu v séru nebo v moči (Tichý, 1997). Primární AL amyloidóza může být jednak systémová, kdy dochází ke zvýšení počtu plazmocytů v kostní dřeni na 5 až 10%, patologický lymfocytární klon produkuje amyloidogenní lehké řetězce, a lokalizovaná, jejíž podstatou je klonální B-lymfoproliferace nikoliv v kostní dřeni, ale v některé tkáni či orgánu. V tomto případě dochází k okamžitému usazování lehkých řetězců v místě lymfoproliferace. Amyloidové fibrily jsou tvořeny monoklonálními lehkými řetězci kappa a lambda (vzácně i těžkými řetězci) v poměru 1:3, což je obrácený poměr proti myelomu i proti fyziologickému stavu. V amyloidové hmotě byly prokázány převážně jen variabilní části lehkého řetězce. Konstantní část nebo celý lehký řetězec byly nalézány jen ojediněle (Adam a kol., 1999). U lehkých řetězců jsou jejich variabilní části rozlišovány na 6 podskupin - V 1 - V 6. Právě monoklonální volné lehké řetězce typu V 6 mohou vyvolat vznik primární systémové amyloidózy. Tendencí těchto typů lehkých řetězců je vytvářet v plazmě polymery, jejichž proteolytická degradace je nedokonalá, takže vzniká nerozpustný fibrilární amyloid, který se deponuje v extracelulárním prostoru. Příčinou amyloidózy je tedy monoklonální gamapatie, ovšem s tak malou potenciální malignitou, že se nikdy nevyvine v generalizovanou formu jako je například plazmocytom (Engliš, 2007). V séru nemocných převažují lehké řetězce nebo kompletní molekula M-Ig nejčastěji typu IgG lambda (Obr. 5.), ale jejich koncentrace je nízká. Stejně tak vylučování Bence - Jonesovy bílkoviny je menší než 1g/24 h (Adam a kol., 2001). Při klinickém podezření na systémovou primární amyloidózu lze za metodu volby považovat stanovení volných lehkých řetězců v séru (Engliš, 2007)

23 Obr. 5. Zastoupení M-Ig u pacientů s AL - amyloidózou (Adam a kol., 2001) Waldenströmova makroglobulinemie Jedná se o chronické B-lymfoproliferativní onemocnění řazené mezi nízce maligní choroby. Je charakterizována mimo jiné přítomností monoklonálního IgM o koncentraci > 30 g/l, hyperviskozitou a anémií (Špička a kol., 2005). Koncentrace fyziologických Ig nemusí být snížena. Typické je zvýšení počtu lymfocytů a lymfoplazmocytů (Adam a kol., 2001). Onemocnění má chronický průběh. Nejčastějšími příčinami úmrtí pacientů jsou progrese onemocnění, infekční komplikace, srdeční selhání. V některých případech dochází k transformaci ve vysoce maligní lymfomy (Špička a kol., 2005). Monoklonální IgM může mít i vlastnost kryoglobulinu (bledost a bolesti prochlazené části těla), popřípadě chladových aglutininů. Na rozdíl od mnohočetného myelomu nemusí být koncentrace M-Ig ve vztahu s velikostí maligní masy (Adam a kol., 2007)

24 Solitární plazmocytom Solitární plazmocytomy jsou lokalizované maligní nádory, které vznikají lokální proliferací plazmocytů. Dělí se na: solitární plazmocytomy měkkých tkání solitární plazmocytomy kostí Jsou relativně vzácné, tvoří asi 3-5% všech maligních plazmocytárních onemocnění (Bačovský, 2005). Část solitárních kostních plazmocytomů má tendenci přecházet na mnohočetný myelom, z toho častěji je přechod solitárního plazmocytomu osového skeletu než periferní kosti. Mezi hlavní kritéria tohoto onemocnění patří: přítomnost pouze jednoho osteolytického ložiska počet plazmocytů menší než 5% koncentrace monoklonálního imunoglobulinu je velmi nízká M-IgA do 20 g/l, M-IgG do 35 g/l nebo je M-Ig nepřítomen, B-J bílkovina do 1 g/24 hodin nepřítomnost anémie,hyperkalcémie (Adam a kol., 1999) Výskyt nesecernujících kostních solitárních plazmocytomů je podstatně vyšší než počet případů nesecernujících mnohočetných myelomů. Pro mimokostní formy solitárního plazmocytomu je charakteristický minimální počet přechodů na generalizovanou formu. Buňky tohoto typu plazmocytomu mají nízkou proliferační aktivitu (Adam a kol., 2001). Tyto plazmocytomy se mohou nacházet v nasopharyngu, oropharyngu, tonzilách, nosní dutině a paranasálních sinusoidách, velmi vzácně v uzlinách, podkoží, na pleuře nebo v testes (Baťovský, 2005)

25 Solitární extramedulární plazmocytom: Je velmi vzácné maligní onemocnění. Symptomy jsou závislé na lokalizaci tumoru. Ulcerace a nekróza nejsou typické, jsou známkou pokročilosti tumoru. M-Ig bývá detekován do 25% případů, jeho vyšší hladiny upozorňují na horší prognózu (Vošmik, Maisnar, 2007). Solitární kostní plazmocytom: Tento typ plazmocytomu patří také do kategorie vzácných chorob, ovšem značná část těchto onemocnění má tendenci přecházet v mnohočetný myelom. M-Ig je detekován asi ve 24-72% případů v množství do 20 g/l. Nesekreční plazmocytomy jsou o něco vzácnější, ale mají větší riziko přechodu do MM (Radocha, Maisnar,2007) Plazmocelulární leukémie Je považována za leukemickou variantu mnohočetného myelomu s agresivní povahou a krátkým fatálním průběhem. Tvoří pouze 2-4% onemocnění typu myelomu. PCL je charakterizována přítomností maligních buněk s vysokou proliferativní aktivitou. Produkce M-Ig je obdobná jako u mnohočetného myelomu, ale patologické buňky mnohem častěji produkují lehké řetězce (Špička a kol, 2005.) Potransplantační lymfoproliferativní onemocnění typu MM Následkem imunosuprese u pacienta, kterému byla provedena transplantace orgánu, vzniká lymfoidní proliferace anebo lymfom. Příčinou vzniku tohoto onemocnění je tedy potlačení imunitního systému příjemce a také chronická antigenní stimulace transplantovaným orgánem. Většina těchto onemocnění je spojována s EBV infekcí, která vede k monoklonální anebo méně často k polyklonální B - buňkové proliferaci. Jen málo dochází k proliferaci T- buněk. Nejmenší riziko vzniku PTLD je u transplantace ledvin, jedná se o méně než jedno procento

26 Prognóza tohoto onemocnění je vážná, celková mortalita u příjemců orgánového štěpu je asi 60%, u příjemců krvotvorných kmenových buněk až 80%. Jeho výskyt je ovšem zřídkavý (Kafková, 2007) Transientní paraproteinémie Transientní paraproteinémie patří do skupiny MGUS. Je pro ně typická přítomnost nízkých koncentrací M-Ig, který se ovšem spontánně ztrácí v průběhu několika dní, častěji však týdnů či měsíců. Výskyt TP je častější u dospělých než u dětí. Výsledky studií, kde bylo sledováno 592 MG, udávají, že bylo zachyceno 34 pacientů s TP, z toho jich 31 mělo infekční onemocnění. Průměrná koncentrace paraproteinů činila 4,5 g/l, IgG paraproteinů bylo 2x více než IgM. Monoklonální IgA nebyly zachyceny vůbec. Na etiologii tohoto onemocnění není v současnosti jednotný názor, stejně jako na jeho klinický a prognostický význam (Buryška a kol., 2007) Další lymfoproliferace s tvorbou monoklonálního imunoglobulinu 1. B chronická lymfatická leukémie - monoklonální Ig u méně než 5% pacientů 2. B non-hodgkinské lymfomy - monoklonální IgM, koncentrace většinou < 20g/l 3. Castlemanova choroba - monoklonální IgM 4. Schnitzlerův syndrom - monoklonální IgM do 20 g/l 5. Vlasatobuněčná leukémie 6. Kožní T-lymfomy 7. Mycosis fungoides 8. Sézaryho syndrom (Špička a kol,2005, Adam a kol., 2001)

27 relativní zastoupení (%) Asociace monoklonální gamapatie s jinými nemocemi 1. Krevní choroby: myelodysplastický syndrom, chronická myeloidní leukémie, myelofibróza, chronická neutrofilní leukémie, lupus antikoagulans 2. Kožní choroby: skleromyxoedém, papulární mucinóza 3. AIDS 4. Revmatické nemoci: revmatoidní artritida, séronegativní polyartritida, Bechtěrevova nemoc, lupus erytematodes, revmatická polymyalgie 5. Myastenia gratis 6. Karcinomy: karcinom prostaty (Adam a kol., 2001) Poměrné zastoupení monoklonální gamapatií dle údajů Mayo Clinic, Kyle, R.A. (1996) MGUS Mnohočetný myelom AL- Amyloidóza Doutnající mnohočetný myelom Jiné maligní lymfoproliferativní nemoci Solitární nebo extramedulární plazmocytom Makroglobulinémie 0 Diagnoza Ostatní Obr. 6.. Zastoupení monoklonálních gamapatií

28 Tab.2. Diagnostická kritéria vybraných monoklonálních gamapatií (Adam a kol,1999, Adam a kol., 2001) Diagnóza Plazmocyty Koncentrace M- Ig Nejčastější typ M- Ig B-J bílkovina Ostatní příznaky osteolytická ložiska, Mnohočetný myelom > 30 % IgG > 35 g/l IgA > 20 g/l IgG IgA > 1g /24 h anémie, hyperkalcémie, snížení hodnot fyziologických Ig Indolentní mnohočetný myelom % IgG > 35 g/l IgA > 20 g/l IgG IgA > 1g /24 h mírná anémie, drobná osteolytická ložiska nepřítomny Doutnající myelom % IgG > 35 g/l IgA > 20 g/l IgG IgA > 1g /24 h osteolýza, anémie ani hyperkalcémie Osteosklerotický myelom a POEMS syndrom 5% Nízká IgA Lehké řetězce osteosklerotická ložiska, polyneuropatie, organomegalie nepřítomny Kostní forma solitárního plazmocytomu < 5 % Nepřítomen nebo IgG < 35 g/l IgA <20 g/l IgG IgA < 1g /24 h anémie, hyperkalcémie, v celém skeletu jedno osteolytické ložisko Monoklonální gamapatie nejasného významu < 10 % IgG < 35 g/l IgA <20 g/l IgG IgA < 1g /24 h nepřítomny osteolytická ložiska, hyperkalcémie, anémie

29 Projevy monoklonálních gamapatií Viskozita séra Viskozita séra není lineárně závislá na koncentraci paraproteinu. Zvýšení viskozity je závislé i na neobvyklých vlastnostech monoklonálních imunoglobulinů - schopnosti agregovat, na kryoprecipitačních vlastnostech. Normální viskozita séra se pohybuje mezi 1,4-1,9 relativních jednotek. U hyperviskozního syndromu, který bývá zjišťován asi u 33% WM, méně u IgG a IgA mnohočetných myelomů, je viskozita nad 3-4 r.j. Při léčbě hyperviskozity pomocí plazmaferézy je třeba brát v úvahu to, že poločas jednotlivých imunoglobulinů v séru je rozdílný. Například poločas IgM je 5 dní, IgG je 21 dní (Tichý, 1997). Kryoglobuliny Jedná se o bílkoviny, které precipitují při teplotách nižších než 37 o C a po zahřátí se znovu rozpustí. Jedná se tedy o reverzibilní jev. Tyto vlastnosti mohou mít monoklonální, polyklonální imunoglobuliny a fibrinogen. Kryoglobuliny dělíme do tří skupin: typ I. izolované monoklonální kryoglobuliny, většinou paraproteiny IgM, IgG, IgA nebo vzácně monoklonální lehké řetězce typ II. smíšené kryoglobuliny-kombinace paraproteinu s polyklonálním imunoglobulinem typ III. polyklonální Ig, kryoglobulin je tvořen imunoglobuliny jedné nebo více tříd, které tvoří antigen protilátkový komplex Kryoglobulinémie ovlivňuje řadu laboratorních vyšetření: zpomaluje sedimentaci, vzorek musí být před elektroforézou či imunofixací předehříván (Tichý, 1997). Pyroglobuliny Jsou monoklonální imunoglobuliny, které precipitují ireverzibilně při teplotě 56 o C. Jedná se o heterogenní skupinu imunoglobulinů s různými fyzikálními a chemickými vlastnostmi. Vždy se jedná o paraproteiny. Pyroprecipitační vlastnosti mohou mít kromě intaktních molekul Ig i monoklonální lehké řetězce a fragmenty IgG. Výskyt pyroglobulinů je vzácnější než kryoglobulinů

30 Jeden a tentýž paraprotein může mít oba typy abnormalit jak kryo - tak i pyroprecipitaci (Tichý, 1997). 2.3 Laboratorní průkaz a stanovení paraproteinů U všech paraproteinémií je nezbytná analýza séra a moče. Nejčastěji jsou prokazovány paraproteiny IgG, pak IgA, IgM, IgD a IgE. K vyšetření se odebírá vzorek srážlivé krve. Plazma není vhodná, protože fibrinogen vytváří ostrou linii mezi a globuliny a simuluje tak M-gradient. Přítomnost paraproteinu může ovlivňovat i výsledky jiných vyšetření. Například bylo popsáno enormní zvýšení CRP u WM s paraproteinem IgM-, které bylo vysvětlováno buď tvorbou komplexu CRP-IgM nebo nespecifickou reakcí mezi paraproteinem a latexovými částicemi. Základními laboratorními metodami pro monitorování klinického průběhu a léčby MG jsou elektroforetické metody (Tichý, 1997). Nejdůležitější laboratorní metody používané k průkazu a stanovení paraproteinů: Elektroforéza sérových bílkovin: slouží k potvrzení nebo vyloučení MG, kvantifikaci a monitorování MC. Imunoelektroforéza séra: používá se k ověření nálezu v elektroforéze a ke klasifikaci a typizaci monoklonálního imunoglobulinu. Imunofixační elektroforéza séra: její pomocí se potvrzuje MG, klasifikuje a typizuje monoklonální imunoglobulin a to i v případě nízkých koncentrací (má až 50x vyšší citlivost než klasická imunoelektroforéza). Elektroforéza močových bílkovin: průkaz a stanovení lehkých řetězců. Imunoelektroforéza v moči: průkaz Bence Jonesova proteinu a exkrece monoklonálního imunoglobulinu. Imunofixační elektroforéza moči: velmi citlivá metoda pro průkaz BJ proteinu a exkrece monoklonálního imunoglobulinu. Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie: slouží ke kvantitativnímu stanovení tříd polyklonálních Ig, monitorování koncentrace Ig,

31 kvantitativnímu stanovení lehkých řetězců v séru i v moči a jejich indexů a kvantitativnímu stanovení volných lehkých řetězců. (Špička a kol., 2005) Indikace speciálního vyšetření bílkovin, imunoelektroforézy, kvantitativního stanovení mono - a polyklonálních imunoglobulinů: Snížená koncentrace fyziologických imunoglobulinů Hyperkalcémie Proteinurie Nefrotický syndrom Selhávání ledvin Malabsorpce Syndrom karpálního tunelu Celková slabost Anemie Bolesti kostí Vysoká sedimentace Difuzní osteoporóza Hepatomegalie Splenomegalie (Adam a kol., 2001)

32 2.3.1 Elektroforéza sérových bílkovin Tato metoda je založena na pohybu elektricky nabitých částic v elektrickém poli. Molekuly bílkovin mají amfoterní povahu, mohou tedy nabývat kladného nebo záporného náboje v závislosti na ph prostředí. Pohyblivost dále ovlivňuje iontová síla prostředí, velikost separovaných molekul, chemické složení nosiče. Pro dělení sérových bílkovin se používá nejčastěji elektroforéza na agaróze nebo na acetátcelulóze. Bílkoviny se takto dělí na 5 frakcí: albumin, 1 -, 2 -, - a - globuliny. Vyhodnocení elektroforeogramu se provádí denzitometricky a poskytuje relativní procenta zastoupení jednotlivých frakcí a spolu se stanovením celkové bílkoviny pak lze kvantifikovat obsah jednotlivých frakcí - tedy i koncentraci paraproteinu. V poslední době se považuje za nejmodernější systém kapilární elektroforéza. Za pomoci vysokého napětí (7-9 kv), za použití silně alkalických pufrů a přímém měření absorbance v UV oblasti na katodickém konci kapiláry zvyšuje citlivost detekce monoklonálních paraproteinů. Asi u 80% pacientů s monoklonální gamapatií lze touto metodou detekovat přítomnost M gradientu. Do zbývajících 20% jsou zahrnuty nemoci z lehkých a těžkých řetězců, vzácné IgD paraproteinémie, dále paraproteiny skryté v - a - globulinech a nesecernující myelomy. Mimo průkazu a stanovení paraproteinů lze pomocí elektroforézy zjistit polyklonální gamapatii, popřípadě oligoklonální gamapatii, která je charakteristická několika slabšími pruhy v gama oblasti elektroforeogramu. Denzitometrický záznam elektroforeogramu může být částečně zkreslen, artefakty technického charakteru mohou být způsobeny různou analytickou citlivostí scanovacího zařízení. Jiné důvody zvýšení frakcí: zvýšení 2 frakce - při 2 makroglobulinémii, reakcích akutní fáze při zánětu, hyperlipoproteinémiích zmnožení globulinů - artificiální hemolýza pseudo M gradienty mezi a - globuliny - fibrinogen, vysoké koncentrace lysozymu

33 negativní ovlivnění typického rozdělení bílkovin - přítomnost kryoglobulinu (tvorba protilátkových komplexů) (Špička a kol.,2005) Dvojrozměrná elektroforéza: K rozlišení monoklonálních lehkých a těžkých řetězců od polyklonálních a k průkazu výrazné mikrohomogenity monoklonálních lehkých řetězců se používá dvojrozměrná elektroforéza. Pomocí ní byla zjištěna řada izoforem monoklonálních lehkých řetězců s rozdílným pi, od výrazně kyselých až po silně bazické. Touto metodou byla i prokázána variabilita v molekulové hmotnosti monoklonálních lehkých řetězců a v moči jejich monomery, dimery a trimery. Princip dvojrozměrné elektroforézy spočívá v kombinaci izoelektrické fokusace s elektroforézou v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného. V současné době je diskutováno o významu pi a polymerizace monoklonálních lehkých řetězců pro jejich nefrotoxicitu (Tichý, Stulík, 1995) Imunoelektroforéza Jedná se o metodu, v které dochází ke kombinaci elektroforézy a imunodifuze v gelu za použití polyvalentních či monovalentních antisér. Základní princip imunoelektroforézy spočívá v rozdělení vzorků v elektrickém poli a poté v aplikaci poly - či monovalentních antisér do podélných kanálků v gelu. Difúze probíhá po dobu hodin a dochází při ní k tvorbě precipitačních linií ve tvaru obloučků, které se hodnotí buď v nativním stavu nebo po obarvení vizuálně. Tato metoda vyžaduje zkušenost hodnotícího pracovníka a je také velmi časově náročná. Je také nutné dodržovat optimální ekvivalentní poměr koncentrace antigenu a protilátky, protože v opačném případě nemusí k precipitaci dojít.(špička a kol., 2005)

34 2.3.3 Imunofixační elektroforéza Imunofixace je nejméně 10x citlivější než imunoelektroforéza. Principy jsou stejné jako u klasické imunoelektroforézy. Podstatný rozdíl je ovšem v tom, že antisérum je aplikováno přímo na elektroforeogram, takže reakce s protilátkou proběhne téměř okamžitě. Mimo jiné umožňuje též určení antigenního typu lehkých řetězců u paraproteinémií IgM, což je u imunoelektroforézy téměř nemožné. Další předností imunofixace je průkaz monoklonálního imunoglobulinu již při nízkých koncentracích a i v případě vysokých koncentrací polyklonálních imunoglobulinů. Pro imunofixaci močových bílkovin se používají nativní nebo zahuštěné vzorky močí. Je výhodné současně analyzovat jak vzorek moči, tak vzorek séra (Špička a kol., 2005) Imunoturbidimetrie Její využití spočívá v kvantifikaci jednotlivých imunoglobulinů, popřípadě ke stanovení koncentrace lehkých řetězců v séru a moči. Principem této metody je precipitace v kapalné fázi. Po reakci antigenu s protilátkou vzniká zákal, který se měří turbidimetricky při 340 nm. Závislost turbidity na koncentraci je lineární ve zředěných mikrosuspenzích s definovanou velikostí částic pro monochromatické záření v určitém koncentračním rozsahu (Špička a kol., 2005) Imunonefelometrie Principem této metody je na rozdíl od imunoturbidimetrie měření intenzity rozptýleného světla, které vzniká při průchodu paprsku kyvetou obsahující precipitací vzniklé imunokomplexy. Moderní nefelometry využívají jako zdroj monochromatického paprsku laser a mají též maximálně optimalizovaný úhel měření rozptylovaného světla s ohledem na velikost a tvar částic, které světlo odrážejí. Jsou tedy vysoce citlivé a přesné (Špička a kol., 2005)

35 2.4 Význam stanovení volných lehkých řetězců v séru Biologický poločas volných lehkých řetězců je 2-6 hodin, lze tedy předpokládat, že při zachovalé glomerulární filtraci se pokles jejich syntézy velmi rychle projeví. Podstatně dříve než dojde ke změnám v koncentracích kompletních monoklonálních imunoglobulinů, které mají významně delší biologický poločas. Stanovení volných lehkých řetězců je tedy lepším indikátorem průběhu onemocnění a efektu léčby než stanovení koncentrace intaktního monoklonálního imunoglobulinu. Změny koncentrací volných lehkých řetězců reflektují lépe změny počtu produkujících nádorových buněk při progresi a léčbě onemocnění i díky tomu, že jejich biologický poločas není závislý na jejich koncentraci. Například biologický poločas v případě IgG je závislý na jeho koncentraci. Nejvhodnějším kritériem jejich průkazu byla dosud imunofixace moči. Při průkazu v séru se používá elektroforéza s vyšší rozlišovací schopností, při které lze prokázat monoklonální lehké řetězce asi u 50% nemocných. Zóna bývá lokalizována v oblasti a globulinů, kde ovšem bývá překryta zónami jiných plazmatických bílkovin. Asi dvě třetiny nemocných mají zvýšenou koncentraci volných monoklonálních lehkých řetězců v séru a 96% jich má patologickou hodnotu indexu / (Engliš, 2007). V případě nesecernujícího plazmocytomu nelze ani v séru ani v moči elektroforeticky a imunofixací prokázat přítomnost monoklonálních imunoglobulinů. V 80-90% takových případů však lze s použitím imunohistologických metod prokázat monoklonální protein v cytosolu nádorových plazmatických buněk. Při použití kvantitativních imunoprecipitačních metod lze u 68 % těchto myelomů prokázat v séru buď patologickou koncentraci monoklonálního lehkého řetězce nebo indexu / (Engliš, 2007). Metoda Freelite umožňuje stanovení pouze volných lehkých řetězců v séru a moči. Základní podmínkou je vysoká specifita a afinita analytické protilátky, která nesmí interferovat s žádným ze sérových proteinů (Říčařová, 2006)

36 Principem tohoto stanovení je, že protilátka je zaměřena nikoliv na vnější, ale na vnitřní epitop molekul lehkého řetězce, který je v celkové molekule imunoglobulinů nepřístupný. Tímto postupem lze spolehlivě odlišit volné lehké řetězce od vázaných a zachytit jejich koncentraci již od 2 mg/l (Tichý, Maisnar, 2006). Obzvláště u nesecernujícího myelomu je toto stanovení metodou volby. Prognosticky významná je hladina volných lehkých řetězců v séru u nemocných s MGUS. Obecně platí, že čím vyšší je hladina při diagnóze onemocnění, tím větší je pravděpodobnost maligního zvratu onemocnění (Engliš, 2007). Stanovení volných lehkých řetězců se zdá velice slibnou metodou pro zpřesnění a rozšíření možnosti detekce a monitorování monoklonálních gamapatií. Přínos tohoto stanovení: Detekce sekrečních myelomů - až 75% do této doby nezachytitelných Časnější záchyt relapsu a přesnější hodnocení účinku terapie Průkaz monoklonální gamapatie u nemocných s AL amyloidózou, nemoci z ukládání lehkých řetězců, Waldenströmovou gamapatií (Špička a kol., 2005) 2.5 Ostatní sledované markery u MG 1. 2-mikroglobulin je glykoprotein, který je součástí HLA (MHC 1. třídy) a je exprimován na všech jaderných buňkách. Je homologií s konstantní částí těžkých řetězců Ig a odbouráván a vylučován v ledvinách a téměř ve 100% resorbován v proximálních tubulech. Jeho koncentrace v moči i v séru jsou závislé na funkci ledvin, proto je nutné jeho hodnoty vztahovat na hodnoty kreatininu. Vyšetření hladin 2 M se využívá k monitorování pacientů s mnohočetným myelomem, non - hodgkinskými lymfomy a chronickou lymfocytární leukemií B řady. Referenční interval: 0,8-2,4 mg/l

37 2. Laktátdehydrogenáza (LD) je enzym uplatňující se při anaerobní glykolýze. Bývá zvýšen u mnohých tumorů a non - hodgkinských lymfomů, ale také při hemolýze, infarktu myokardu, svalových onemocněních a dalších stavech. 3. Thymidinkináza (TK) je enzym, jehož aktivita stoupá v buňce v S fázi dělení a odráží míru proliferace. Zvýšená aktivita se nachází především u hematologických malignit. Nespecifické zvýšení způsobují virové infekce, nedostatek vitaminu B 12, ale také léčba některými cytostatiky (Špička a kol.2005). 4. Solubilní CD 138 (scd 138): je označení pro syndecan -1, molekulu, která se uvolňuje z povrchu myelomových buněk. Jedná se o nový nezávislý prognostický ukazatel MM (Pecka, 2006)

38 3 Cíl práce Cílem této práce je ukázat na příkladech pacientů s diagnózou monoklonální gamapatie možnost využití metod stanovení hladiny paraproteinu v séru při sledování léčby či relapsu onemocnění nebo sledování vývoje nemaligní formy onemocnění

39 4 Metodika 4.1 Zpracování biologického materiálu před analýzou Vzorky krve pro elektroforetickou a imunofixační analýzu: centrifugujeme při 3000 otáčkách za minutu po dobu deseti minut, sérum přepipetujeme do plastových zkumavek a uchováváme týden v lednici (déle pouze zmrazené) až do analýzy. Sérum pro elektroforézu na agarózovém gelu: viskózní a zkalená séra smícháme před analýzou s roztokem Fluidil v poměru 25 l Fluidil + 75 l séra a promícháme na třepačce. Sérum pro imunofixaci: ředíme obarveným ředícím roztokem pro IgG 6x a pro ostatní 3x, při vysoké koncentraci celkových Ig ( 20 g/l) zdvojnásobíme objemy diluentů kromě dráhy ELP, při nízké koncentraci celkových Ig ( 5 g/l) sérum ředíme polovičním množstvím diluentu, viskózní a zkalené vzorky: používáme roztok Fluidil stejně jako při elektroforéze. Depolymerace 2 - merkaptoetanolem: 25 l 1% redukčního roztoku (merkaptoetanol + Fluidil) + 75 l séra, promícháme a necháme 15 minut stát. Vzorky moče pro elektroforetickou analýzu a imunofixaci: uchováváme týden v lednici a déle pouze zmrazené. Moč pro elektroforézu: zahustíme na koncentraci bílkoviny 15-20g/l. Moč pro imunofixaci: zahustíme na koncentraci bílkoviny alespoň 5 g/l nebo celkových imunoglobulinů 1 g/l ( pro všechny dráhy). Depolymerace 2 - merkaptoetanolem: 5 l redukčního roztoku (merkaptoetanol + voda v poměru 1:9) l zahuštěné moče promícháme a necháme stát 15 minut

40 4.2 Pracovní postup při elektroforéze na agarózovém gelu Princip metody: dělení bílkovin probíhá podle rozdílné pohyblivosti ve stejnosměrném elektrickém poli. Tato pohyblivost je nejvíce závislá na velikosti elektrického náboje bílkovin, na velikosti jejich molekuly a ph prostředí. Největší pohyblivost má albumin, následují 1, 2, globuliny a nakonec globuliny, které se vlivem elektroendoosmózy, který je pro ně silnější než vliv elektrostatických sil, pohybují nikoliv k anodě, ale ke katodě (ph pufru nad 8,0). Pohyblivost molekul bílkovin dále ovlivňuje iontová síla a velikost separovaných částic. Vzorek: sérum - vadí hemolýza, moč Diagnostická souprava: Sebia Hydragel Protein 15/30 Analyzátor: Sebia Hydrasys poloautomatický systém pro zpracování elektroforéz řady Sebia Hydragel Popis analyzátoru: v levé části přístroje je pod víkem dělící komora, vpravo komora barvící. Uprostřed přístroje je displej a ovládací tlačítka. Tlačítka v levé části slouží k ovládání dělících programů, v pravé části pro barvící programy. Použité roztoky: Barvící roztok: Amidoblack: do lahvičky koncentrovaného roztoku přidáme asi 15 ml Staining solution diluent a přelijeme do válce, postup opakujeme, dokud se nevypláchne zbytek barvy, zbytek diluentu nalijeme do válce, který doplníme po 300 ml destilovanou vodou. Takto připravený barvící roztok mícháme 5-10 minut na míchačce. Stabilita 1 měsíc při laboratorní teplotě. Odbarvovací roztok: 5 ml koncentrovaného roztoku Destaining Solution do 5 l destilované vody. Mycí roztok: 1 lahvička Wash solution do 5 l destilované vody. Postup při dělení gelu (originální návod Sebia-Hydragel, 2005): 1) Na displeji analyzátoru zvolíme program dělení a barvení. 2) Do jamek aplikačního hřebenu ze soupravy naneseme vzorky v objemu 10 l /vzorek. Kapacita hřebenu je 30 vzorků. 3) Hřeben vložíme na 5 minut do vlhké komůrky

41 4) Po otevření víka dělící komory analyzátoru zvedneme nosič elektrod, ze soupravy vyjmeme houbičky s pufrem a napneme je mezi kolíky na nosiči. 5) Z obalu vyjmeme fólii a gel krátce osušíme tenkým filtračním papírem. 6) Do bližší třetiny naznačeného rámečku v dělící komoře napipetujeme 200 l destilované vody a pomalu na něj položíme fólii tak, aby mezi ní a deskou nezůstala žádná bublina. 7) Nosič elektrod sklopíme do pracovní polohy, aplikační hřebeny po odlomení ochranného rámečku zasuneme do příslušné pozice na nosiči. 8) Zavřeme víko, stiskneme tlačítko start. Začne probíhat dělení. 9) Po ukončení procesu vložíme gel do nosiče a vložíme ho do barvící komory. 10) Po obarvení otřeme zadní stěnu gelu vlhkou buničinou. Obr. 7. Ukázka výsledku po elektroforéze, u vzorku číslo 10 provedena imunofixace ( vzorek č. 23 M-Ig v oblasti gama, vzorek č. 4 fibrinogen)