MUDr. Renata Procházková, PhD.

Transkript

1 MUDr. Renata Procházková, PhD.

2 I. Úvod do problematiky II. Krvetvorba III. Krevní buňky - funkce, morfologie IV. Růstové faktory V. Možnosti využití v praxi/výzkumu

3 Nauka o krvi hematologie (haima krev + logos- rozmluva) Studuje krev, krvetvorné orgány, krvetvorbu za normálních a patologických stavů 400 p.n.l. Empedokles: krev = život Krev tělesná tekutina - Krevní oběh (1628 W. Harwey) - Krev plní úlohu jen tehdy, když se v těle pohybuje - = dutý systém cév (intaktní endoteliální vrstva) + srdeční pumpa

4 Množství v organismu: cca 5 litrů ml/kg váhy dospělí ml/kg váhy děti Část buněčná - 45 % Část tekutá - 55 % (Hippokrates 4. stol. p.n.l. - rozdělení krve na vrstvy)

5 Voda 90 % Anorganická složka - Na +, K + - Ca 2+, Mg 2+ - Fe - Bikarbonát, fosfát - Cl Rovnováha ICT,ECT Srážení krve Funkce svalů, nervů Krvetvorba, fce enzymů Acidobazická rovnováha ph 7,4

6 Krevní buňky Červené krvinky erytrocyty /l Bílé krvinky leukocyty /l Destičky trombocyty /l granulocyty agranulocyty neutrofil bazofil eozinofil monocyt lymfocyt

7 Erytrocyty Leukocyty Přenos kyslíku Obranné procesy Tvorba imunoglobulinů Buněčná imunita Zánětlivé procesy Trombocyty Zástava krvácení a regenerace cév

8 Proces tvorby krvinek v krvetvorných orgánech - 2 fáze - prenatální (předporodní) - postnatální (poporodní) odlišná krvetvorba a místa tvorby krvinek Prenatální krvetvorba Začíná ve velmi raném období těhotenství 3 období: - Mezoblastové: týden gravidity - Hepatolienální: po 6. týdnu, trvá až do porodu - Dřeňové: od 20. týdne

9 Po narození krvetvorba jen v kostní dřeni. Všechny krevní elementy vznikají z hematopoetických kmenových buněk. Hematopoéza probíhá ve vysoce komplexním mikroprostředí kostní dřeně. Hnízda kmenových buněk (stem cell niche). Vysoce regulovaný proces.

10 Probíhá v kostní dřeni od kmenových buněk přes buňky progenitorové až po buňky diferencované (erytrocyty, leukocyty, trombocyty). Hemopoetická / Pluripotentní kmenová buňka Progenitorová kmenová buňka Prekurzorové buňky Zralé buňky krvetvorby

11 HSC: Hemopoetic Stem Cell Schopnosti HSC: dlouhodobá obnova krvetvorby nekonečná sebeobnova/nesmrtelnost diferenciace do všech vývojových řad krevní tkáně = pluripotence (ale ne do buněk jiných tkání) migrace z kostní dřeně do periferní krve a zpět Transplantace kostní dřeně = transplantace hematopoetických kmenových buněk HSC= 1: mononukleárních buněk kostní dřeně

12 schopna diferenciace do 1 či více bb. řad neschopna sebeobnovy > bb. ve fázi S buněčného cyklu citlivá na růstové faktory Hemopoetická / Pluripotentní kmenová buňka Progenitorová kmenová buňka Prekurzorové buňky CFU-GEMM Granulocyte Erytrocyte Macrophage Megakaryocyte myelopoeza CFU-GM Granulocyte Macrophage makrofágy, granulocyty BFU-E Burst Forming Unit Erythroid erytrocyty CFU-E erytrocyty CFU-G Granulocyte granulocyty CFU-M CFU: Colony Forming Unit monocyty CFU-Meg Megakaryocyte megakaryocyty Zralé buňky krvetvorby

13 CFU-GEMM CFU-GM BFU-E CFU-E CFU-G CFU-M CFU-Meg myelopoeza makrofágy, granulocyty erytrocyty erytrocyty granulocyty monocyty megakaryocyty

14 Krvetvorba- neustálý, plynutý a rovnoměrný děj. Multifaktoriální proces, řada faktorů a látek. Faktory: - povaha a metabolický stav bb. - vlivy prostředí - mikroprostředí kostní dřeně Látky: - hemopoetické růstové faktory (cytokiny) - nervové a humorální vlivy - přívod nezbytných látek (Fe, vit. B12 )

15 - růstové faktory - interleukiny, interferony - chemokiny, regulační proteiny = nositelé určitých signálů hematopoetické transkripční faktory jako vykonavatelé těchto signálů

16 Původně popsány na základě schopností podporovat růst kolonií hemopoetických buněk in vitro. CSF Colony Stimulating Factor Umožňují dělení a vyzrávání mateřských bb. Jejich působením se zahájí diferenciace do příslušné krvetvorné řady (1 i více). Interferony a interleukiny a další: přímé působení na primitivní progenitorové buňky (např. IL-1,3,6, 11). Dnes známo několik desítek RF. Rekombinantní příprava. Využití v klinické praxi: Epo a G-CSF.

17 Signální (glyko)proteiny produkované širokým spektrem buněk mikroprostředí kostní dřeně (leukocyty, fibroblasty, osteoblasty, endotelie, adipocyty, dendritické buňky aj.) Vážou se na specifické receptory nacházející se na povrchu buněk kostní dřeně. Vazbou cytokinu na receptor dochází k přenosu signálu do jádra, aktivaci cílových transkripčních faktorů a ovlivnění exprese cílových genů.

18 CSF místo působení SCF Stem cell factor pluripotentní KB Epo Erytropoetin červená krevní řady GM-CSF progenitory granulo a makrof krevní řady G-CSF progenitory granulocytární řady M-CSF progenitory makrofágové řady TPO trombopoetin prekurzory megakaryocytů interleukin IL-1 IL-3 IL 6 místo působení megakaryocyty a B bb., progenitory všech vývojových řad krvetvorby "multi -CSF" myeloidní řada

19 Přehled regulační role jednotlivých cytokinů Hematopoeza Erytropoeza Megakaryopoeza Vývoj žírných buněk Vývoj eozinofilů Granulopoeza Vývoj makrofágů Vývoj lymfocytů Cytokiny Epo, SCF, IGF-1, IL-9, IL-3, Tpo, IL-20, SDF-1 Tpo, IL-3,IL-11, LIF, SCF, Epo, FL IL-3, SCF, IL-10 IL-5, IL-3, GM-CSF, SCF G-CSF, GM-CSF, IL-3, SCF, IL-6, FL, SDF-1 M-CSF, GM-CSF, IL-3, FL, SDF-1 IL-7, FL, SCF, SDF-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-15,..

20 .

21

22 Proces tvorby a vývoje červené krvinky v erytroidní řadě. Funkcí erytropoezy je zajistit dostatek erytrocytů pro potřeby organizmu. Regulace zpětnou vazbou (počet erytrocytů x hypoxie). Ŕízení - erytropoetin podněcuje diferenciaci BFU-E a CFU-E v erytroblasty. Vyzrávání buněk: biochemicko morfolofické změny.

23 CFU-GEMM BFU-E CFU-E Proerytroblast jemný chromatin, velké jádro s jadérky, vysoká basofilie cytoplazmy Bazofilní normoblast tvorba hemoglobinu Polychromatofilní normoblast Ortochromní normoblast - již se nedělí Retikulocyt - přechodná buňka mezi jadernými nbl a erytrocyty Erytrocyty bezjaderné bb. ztráta jádra odškrcením ve stadiu oxyfil.normoblastu vývoj 5 6 dní, v periferní krvi: 120 ± 20 dní

24 1. SPECIFICKÉ MIKROPROSTŘEDÍ - kostní dřeň 2. SUBSTRÁTY PRO STAVBU ERYTROCYTŮ: železo (tvorba hemu), aminokyseliny (bílkoviny) kys. listová (syntéza DNA), vit. B6 - pyridoxin (syntéza hemu) vit. B2 - riboflavin (normální fce a přežití ERY) vit. B12 cyanokobalamin: (syntéza NK), jeho využití v organismu záv. na vnitřním faktoru (GP tvořený parietál. bb. žaludku, chrání vit. B12 před účinky tráv. enzymů 3. RŮSTOVÉ FAKTORY: cytokiny interleukiny: IL-1, IL-2, IL-3 nejdůležitější pro krvetvorbu, IL-4, IL-6, IL-9, IL-11) SCF faktor kmenových buněk CSF kolonie stimulující faktor interferony inhibiční fce (omezují proliferaci krvetvorných buněk) EPO (erytropoetin) hlavní regulační faktor erytropoezy

25 Glykoprotein 65 AK zbytků + 4 oligosacharidové řetězce hormon, tvořen - v ledvinách (90%) - v játrech hepatocyty a Kupfferovy bb. (x fetál. vývoj: hlavně játra) indukuje a urychluje proliferaci a diferenciaci erytroidních bb.

26 1. VYUŽITÍ: Rekombinantní EPO produkovaný zvířecími buňkami se využívá v klinické praxi: léčba anémie spojené s postižením ledvin stimulace tvorby ERY pro případnou autologní transfúzi během plánovaných operací 2. ZNEUŽITÍ: Vrcholový sport doping : - EPO zvyšuje výkonnost ( x úmrtí několika atletů a cyklistů) - EPO zvýší viskozitu krve hrozí ucpávání cév, vznik trombů a infarkt myokardu nebo mozková příhoda) Jeho použití je zakázáno od r.1989, avšak testy umožňující kontrolu jeho zneužívání jsou k dispozici teprve od roku 2000 (použity na olympijských hrách v Sydney).

27 Granulomonocytární řada - granulocyty - monocyty Mateřská bb. CFU-GM GM-CSF, G-CSF Postupné změny: - Zmenšování bb. - Poměr jádro/cytoplazma - Zmenšení a změny tvaru jádra - Tvorba granulí azurofilní, - specifická

28 CFU-GEMM CFU-GM CFU-G Myeloblast (A) Promyelocyt (B): primární granula hrubá azurofilní, jasně červená Myelocyt (C,G,K): mizí jadérka, objevují se sekundární granula neutrofilní: tmavě fialová granula eozinofilní: oranžová granula bazofilní: tmavě modrá až černá Metamyelocyt (D,H,L) Tyč (E,I,M) Granulovaný segment (F,J,N) během 6 17 dnů přežívání v periferní krvi: neutrofily 8-10 hod, eosinofily a bazofily 3-4 dny

29 CFU-GEMM CFU-GM monoblast promonocyt monocyt jemná struktura chromatinu, velmi jemná azurofilní granula během 2 2,5 dne nevyzrávají ve dřeni fixní makrofágy tzv. histiocyty putující fagocytující makrofágy

30 CFU-GEMM CFU-Meg megakaryoblast (A) promegakaryocyt (B) megakaryocyt - buňka v kostní dřeni již se nedělí granulární (C), zralý (D) jádro mgc s trombocyty (E) jemný chromatin přetrvává i ve zralých megakaryocytech trombocyty (F) - během 4 5 dní - z 1 megakaryocytu až destiček - do obv. krve denně destiček (1/3 zásobní pool) - přežívají v krvi cca 10 dní

31 Pluripotentní kmenová buňka lymfoblast prolymfocyt lymfocyt: T, B, NK přežívají 4 roky/10 let po antigenní stimulaci se B lymfocyty mění v plasmatické bb. produkce protilátek

32 Humorální Trombopoetin (TPO) hlavní regulátor IL -1, IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF, G-CSF, EPO, FGF (růstový faktor fibroblastů) SCF Stimul pro trombopoezu pokles trombocytů - aktivace trombopoezy: a) Proliferace megakaryoblastů b) Vyzrávání megakaryoblastů

33 Krevní buňky Červené krvinky erytrocyty /l Bílé krvinky leukocyty /l Destičky trombocyty /l granulocyty agranulocyty neutrofil bazofil eozinofil monocyt lymfocyt

34 bezjaderné buňky bikonkávního tvaru struktura uzpůsobena opakovaným deformacím v cévní stěně (7,2μm 2μm ) membrána erytrocytu elastická, pevná 7,2 μm - membránový skelet: kontraktilní bílkoviny spotřeba ATP (glykolýza ) - k udržení buněčné struktury membrány - pro aktivní transport sodíková pumpa morfologické změny provázejí anemie aj. funkce: - - přenos O 2 a CO 2 mezi plícemi a tkáněmi - udržení stálého ph krve 2 μm

35 - Červené krevní barvivo - Izolován v r Složitá krevní bílkovina - Vyplňuje zralý erytrocyt - Umožňuje přenos kyslíku Fyziologicky: - Hb embryonální (Hb Gower) - Hb plodový (HbF fetální) - Hb dospělých (HbA- adult) - Jiné složení řetězců, afinita ke kyslíku

36 Hemoglobin (Hb) přímo měřený parametr na hematologických analyzátorech v g/l Hematokrit (Ht) poměr objemu erytrocytů k objemu celé krve parametr vypočítaný z počtu erytrocytů a MCV Ht = RBC x MCV Počet erytrocytů (RBC) závisí na věku, pohlaví a rase přímo měřený parametr na hematologických analyzátorech počet ery /l Střední objem erytrocytu (MCV) přímo měřený parametr ve fentolitrech (fl)

37 počtu erytrocytů (Hb, Ht) anémie počtu erytrocytů polyglobulie zhoubné bujení červené řady erytroleukémie rozpad erytrocytů hemolytické anemie anemie: Hb < 120 g/l ženy < 130 g/l muži

38 vždy jaderné, vys. obsah H 2 O v obvodové krvi fyziologicky: neutrofilní tyče 0 5 % neutrofilní segmenty % eosinofilní segmenty 0 7 % bazofilní segmenty 0 2 % monocyty 2 12 % lymfocyty %

39 dle morfologického hlediska: - dle přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických granulí v cytoplazmě : granulocyty polymorfonukleáry (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní) agranulocyty mononukleáry (lymfocyty, monocyty) z imunologického hlediska: fagocyty - makrofágy (monocyty, histiocyty) - mikrofágy (granulocyty) imunocyty - lymfocyty (B a T, NK buňky) - plazmatické buňky

40 Hlavní funkce leukocytů = v imunitním systému obrana organizmu proti cizorodým látkám fagocytóza = pohlcování a rozkládání pohlcených částic: granulocyty (neutrofily, eozinofily), monocyty a makrofágy imunitní odpověď - tvorba protilátek (B-lymfocyty, plazmocyty) - přímé působení krevních buněk na cizí buňky nebo částice, tyto buď usmrtí nebo rozloží (T-lymfocyty, NK buňky)

41 specifická protilátková odpověď (B-lymfocyty) specifická buněčná odpověď (T-lymfocyty) přirození zabíječi (NK buňky) A malý lymfocyt B střední lymfocyt C lymfocyt se zářezem v jádře D - střední lymfocyt E lymfocyt s výběžky z cytoplazmy a normálním jádrem F vřetenovitý lymfocyt G velký lymfocyt H - velký lymfocyt I velký lymfocyt J reaktivní lymfocyt K velký lymfocyt s azurofilní granulací L velký lymfocyt s azurofilní granulací

42 Nejmenší částice v krvi Heterogenní populace složená z PLT různé velikosti, tvaru, hustoty Bezjaderná diskoidní tělíska/buněčné fragmenty Tvar PLT se mění dle stupně aktivace

43 - Periferní oblast: plazmatický obal, glykokalyx, membránové a submembránové struktury (interakce PLT s mimobuněčným prostředím) - Oblast solubilního gelu: pás mikrotubulů, submembránové filamenty, mikrofilamenty (základní jednotka PLT kontraktilního systému) - Oblast organel: denzní granula, alfa granula, mitochondrie - Membránové systémy:

44 Metabolické a strukturální odlišnosti od ostatních krevních buněk/specifické schopnosti PLT podléhají řadě interakcí se složkami plazmy nebo narušeným povrchem endotelu. Výsledkem je aktivace trombocytu. Metabolické a morfologické změny Adhese k jiným než destičkovým povrchům Agregace vzájemné shlukování Sekrece (i GF) Retrakce smršťování agregovaných PLT

45 Zástava krvácení - Zprostředkují interakce mezi krví a cévní stěnou - Primární hemostáza primární krevní zátka - Fosfolipidový povrch pro navázání koagulačních faktorů závislých na vit. K sekund.krevní zátka - Aktivace plazmatických koagulačních faktorů Vliv na správnou funkci endotelu Hojivé procesy PLT nosiči řady proteinů, zejména GF syntetizovaných megakaryocyty

46 Growth Factors (GF) Proteiny syntetizované rozsáhlou skupinou buněk mezenchymálního původu. - Specificky se vážou na receptory buněčných membrán cílem je buněčná proliferace/diferenciace. - GF přísně specifické x stimulace více bb. typů. - Objev: počátek 90 let i první pokusy s terapeutickým využitím. - Optimalizace hojení a zrychlení reparace rozsáhlý výzkum.

47 - Význam pro oblast regenerace pojivových tkání: - Faktory syntetizované megakaryocyty -uvolněné GF podporují v organismu buněčnou diferenciaci, proliferaci, transkripci specifických proteinů, chemotaxi a další procesy nutné pro regeneraci tkání.

48 Porušení tkáňové integrity vyvolává dynamickou kaskádu reparace fáze: 1. Hemoragická aktivace PLT s jejich degranulací a adhezí je ukončena hemostázou a chemotaxí zánětlivých buněk 2. Zánětlivá infiltrace neutrofily, makrofágy a lymfocyty produkce specifických cytokinů, chemotaxe 3. Reparace uvolnění řady proteinů v místě léze 4. Remodelace - Uvolnění růstových faktorů (syntetizované megakaryocyty, plazmatické) chemotaxe, proliferace mezenchymálních buněk a proteosyntéza vazba RF na receptory buněčné membrány intracelulární aktivace proliferace a proteosyntézy

49 Aplikované růstové faktory (PRP) působí v organismu obdobně: - Zahajují chemotaxi, proliferaci, angioneogenezi, proteosyntézu, reparaci a remodelaci poškozené tkáně. - Ve zvýšené koncentraci v poškozené tkáni v místě leze proces reparace a regenerace výrazně urychlují. - Silně redukují zánětlivou část kaskády. - Tkáň se hojí bez výrazných otoků (rychlejší angioneogeneze) - Snížená bolestivost. - Efekt ovlivněn obsahem růstových faktorů.

50 - 90. léta 20. století - Stomatochirurgie - příprava pro implantaci dentálních implantátů - Ortopedie, traumatologie osteosyntézy, primární sutury ran, osteochondrální defekty, aloplastiky kloubů - Dermatologie kožní defekty, popáleniny, diabetická noha, dekubity - Oční lékařství - Terapeutický benefit pro pacienty: - Omezení rizika nákazy (autologní materiál) - Zkrácení doby hojení poškozených tkání - Snížení bolestivosti - Snížená spotřeba farmak (ATB, antiinflamatorika, analgetika)

51 Autologní materiál 1. Příprava PRP - Odběr venózní krve a následná centrifugace - Separátory krevních buněk - Speciální přístroje 2. Formy aplikace - PRP přímé užití - Destičkové lyzáty - Kompozitní gely - V kombinaci s dalšími materiály

52 Zpracování na lisu Výsledek Přípravky

53

54

55 Jak trombocyty použít? - Aktivované (trombin, CaCl 2 ) x neaktivované? - Optimální forma použití - Otázka obsahu růstových faktorů - Porovnatelnost jednotlivých studií - Standardizace přípravy PRP

56 Regulation (EC) No 1394/2007/EC on advanced therapy medicinal products - Klasifikace ATPMs: 1. buněčná terapie - trombocyty: Zák. 378/2007 Sb., Vyhl 143/2008 Sb. - kmenové buňky: Zák. 296/2008 Sb., Vyhl. 422/2008 Sb. 2. produkty tkáňového inženýrství - nanovlákna: Zák. 123/2000 Sb. Třeba stanovisko SÚKL klinická studie x zařazení přípravku zarazeni-pripravku Nedodržení pravidel: možnost pokuty, forenzní dopad

57 - Committee for Advanced Therapy (CAT) - klasifikace, certifikace,hodnocení a vědecký dozor, poradenství : 250 klinických studii, 170 dozorů - Některé státy EU: národní regulace problematiky - Doporučena klasifikace ATMP na národní úrovni